一種具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及有機固體廢棄物處理領域，具體地說，涉及一種具有降解偶氮化合物 活性的地衣芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 城鄉(xiāng)有機固體廢棄物中特別是印染行業(yè)的廢棄物常含有某些偶氮化合物，采用目 前的工藝很難去除。利用微生物處理含偶氮有機廢棄物是易操作低成本的方法，從而引起 人們的廣泛關注。采用微生物處理含有有害有機化合物污染的污泥，使其減量化、無害化和 資源化。
[0003] 地衣芽孢桿菌（Bacillus Iicheniformis)是一種常見的土壤微生物類群，能分泌 多種酶并運用于生化反應過程中。將具有偶氮還原酶活性及果膠酶等多種耐高溫生物質水 解酶的地衣芽孢桿菌運用于相關污泥的減量化和無害化處理具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決現有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有降解偶氮化合物 活性的地衣芽孢桿菌及其應用。
[0005] 為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢 桿菌菌株UTM115,所述菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡 稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，郵政編碼： 100101)，保藏日期為2014年9月18日，保藏編號為CGMCC No. 9680。
[0006] 所述菌株UTMl 15分離自云南騰沖溫泉采集的底泥樣本，利用馴化培養(yǎng)基（葡萄糖 3g、淀粉 2. 5g、蛋白胨 2g、牛肉膏 2g、硫脲 0· 04g、偶氮染料 0· lg、KH2P040. 05g、NH4Cl 0· 2g、 NaHCO3O. lg、MgSO4 · 7Η200· 06g、MnSO4 · 7H20 0· 006g、FeCl3 · 6H20 0· 003g、CaCl2 · 2H20 0. 006g、水1000ml)在40°C，經多代富集馴化、定向篩選得到。
[0007] 所述菌株UTM115為革蘭氏陽性、細胞0. 8X (2. 0?3. 5) μπκ直桿狀、單生、芽孢 橢圓型、近中生，孢囊膨大；在含葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母膏 5g、氯化鈉5g、瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7. 0)上菌落光滑正園、扁平微突、蛋殼黃色、生長 迅速，35?50°C培養(yǎng)24小時后菌落直徑約3mm，最適生長溫度40?70°C。硝酸鹽還原陽 性、接觸酶陽性、氧化酶陽性、VP實驗陽性。
[0008] 本發(fā)明還提供了用于克隆所述菌株16S rRNA的引物：
[0009] F :5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3';
[0010] R :5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。
[0011] 利用上述引物經PCR擴增該菌株的16S rRNA序列（如SEQ ID No. 1所示），將獲得 序列提交到EzTaxon數據庫進行比對，結果顯示UTM115菌株的16S rRNA序列與Bacillus Iicheniformis的相似性最高，為99. 7%，此序列是鑒定該菌株的主要特征依據。
[0012] 利用通用引物UP-1S:5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3'和UP-2Sr:5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3'經 PCR 擴增該菌株的 gyrB 基因序列（如 SEQ ID No. 2 所 示），將獲得的序列提交到NCBI GeneBank數據庫運用Blast程序進行序列比對，結果顯示 UTM115菌株的gyrB基因序列與Bacillus Iicheniformis相似性最高，結合所述菌株的細 胞形態(tài)及生理生化特性為鑒定該菌株的次要特征。確定該菌株為地衣芽孢桿菌Bacillus Iicheniformis 0
[0013] 進一步地，所述菌株具有偶氮還原酶、果膠酶和β -(1，4)_木糖苷酶活性。偶氮還 原酶、果膠酶和β-(1，4)-木糖苷酶的編碼基因分別如SEQ ID No. 3?SEQ ID No. 5所示。
[0014] 本發(fā)明還提供了含有述菌株的菌劑。
[0015] 進一步地所述菌劑的制備方法為：
[0016] 1)將所述菌株接種于培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；
[0017] 2)將發(fā)酵液直接分裝成為液體菌劑，或將發(fā)酵液經脫水干燥得到菌粉劑。
[0018] 更進一步地，所述步驟1)具體為：
[0019] (1)將所述菌株接種于培養(yǎng)基中，35-45°C溫度下，100?250轉/分鐘搖瓶培養(yǎng) 1?2天得到搖瓶種子液；
[0020] (2)將搖瓶種子液按0. 01?1 %接種量接種至含有LB液體培養(yǎng)基的種子罐中培 養(yǎng)；培養(yǎng)溫度35?45°C、通氣量為1 2?0. 5 (v/v)、轉速100?400轉/分鐘，培養(yǎng)時間 1?2天，得到種子罐種子液。
[0021] (3)將上述種子液按0. 1?1 %接種量接種至含有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行 培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度35?45°C、通氣量為1 :0. 3?0. 6 (v/v)、轉速60-200轉/分鐘，培養(yǎng)時間 1?2天，當OD6tltlS 2時停止培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。
[0022] 作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基為含葡萄糖蛋白胨的液體培養(yǎng)基，包括：葡萄糖5g、蛋白胨 15g、酵母膏5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，pH為7. 0。
[0023] 本發(fā)明還進一步提供了所述菌株或所述菌劑在處理含偶氮化合物的有機固體廢 棄物中的應用。
[0024] 其中，所述有機固體廢棄物包括城市生活污水廠的下水污泥、生活垃圾、餐廚垃 圾、動物尸體或畜禽糞便，碳氮比為10?50:1、含水量為45%?65%。
[0025] 進一步地，所述應用具體為：
[0026] 1)將相當于總物料濕重0. 01%?1%的菌劑接種于有機固體廢棄物中，混合均勻 進行堆肥好氧發(fā)酵；
[0027] 2)好氧堆肥發(fā)酵12?20天，其間保持通氣，保持氧氣含量為8?15%，間隔4? 5天翻堆1次；
[0028] 3)當含水量低于40%，同時溫度不再升高時停止通氣，發(fā)酵終止，堆體中的有機 物減量約85%，容積減量約60%，原物料中的偶氮化合物降低；
[0029] 4)剩余物料或焚燒或填埋或過篩分裝成生物肥料。
[0030] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0031] 本發(fā)明菌株UTM115可以用于有機固體廢棄物生物的降解，特別是用于含偶氮化 合物的有機固廢的處理，對治理城鄉(xiāng)有機固體廢棄物的污染有益。
【附圖說明】
[0032] 圖1為本發(fā)明所述UTMl 15菌株的系統(tǒng)進化樹。
[0033] 圖2為本發(fā)明所述UTMl 15菌株的顯微鏡照片。
[0034] 圖3為好氧堆肥發(fā)酵用的發(fā)酵槽。
【具體實施方式】
[0035] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0036] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0037] 實施例1地衣芽孢桿菌UTMl 15的分離與鑒定
[0038] 取約1克溫泉底泥樣品置于裝有多粒玻璃珠及50ml無菌水的250ml三角瓶中。 40°C、恒溫搖床上震蕩1小時，然后靜置30分鐘。在無菌條件下吸取上清液lml，接至裝有 50ml已滅菌的富集培養(yǎng)基（葡萄糖2. 5g、淀粉2. 5g、蛋白胨2g、牛肉膏2g、硫脲0. 4g、偶氮 染料 0· lg、KH2PO4O. 05g、NH4Cl 0· 2g、NaHCO3O. lg、MgSO4 · 7H20 0· 6g、MnSO4 · 7H20 0· 006g、 FeCl3 · 6H20 0· 003g、CaCl2 · 2H20 0· 006g、水 1000ml)中，40°C震蕩培養(yǎng) 3 天，轉速 220 轉 /分鐘。取培養(yǎng)3天的菌液lml，加入到裝9ml無菌水的試管中，以梯度稀釋法配制成ΚΓ1， 10_ 2,10_3,10_4,10_5,10_6,10_ 7的稀釋度，分別取0· Iml涂布于含偶氮化合物作為唯一碳源 的選擇培養(yǎng)基平板上（Na2HP044. 5g、ΚΗ2Ρ042· 5g、MnSO4 · 7H20 0· 003g、FeSO4 · 7H20 0· 02g、 MgSO4 ·7Η20 0· 3g、CaCl20. 05g、NH4Cl 0· 5g、0. OOlg 偶氮化合物、瓊脂 15g，蒸餾水 1000ml)。 40 °C培養(yǎng)4?5天后，挑取較大的單菌落進行純化。
[0039] 以本發(fā)明菌株的DNA為模板，PCR擴增其16S rRNA基因序列，引物為（27f): 5， -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和（1492r) :5， -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。 PCR反應程序為：95°C預變性5分鐘，95 °C變性30秒，53 °C退火45秒，72 °C延伸90秒，30 個循環(huán)，72°C延伸10分鐘。擴增產物經電泳檢測其純度后測序，測序結果見序列表SEQ ID No: 1 所不。獲得的 16S rRNA基因序列通過EzTaxon數據庫（http://www. ezbiocloud. net/) 進行比對，與菌株Bacillus Iicheniformis的相似性最高，同源性為99. 7%。如圖1所示 的基于UTMl 15菌株及其相關菌株的16S rRNA基因序列，利用Mega5. 0系統(tǒng)進化軟件構建 的系統(tǒng)進化樹（最大似然法），說明其系統(tǒng)進化關系與地衣芽孢桿菌最近。利用通用引物 UP-IS:5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3'和 UP-2Sr:5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3'經PCR擴增該菌株的gyrB基因，測序結果見序列表SEQ ID No:2獲得的序列提 交到NCBI GeneBank數據庫運用Blast程序進行序列比對，結果顯示UTMl 15菌株的gyrB 基因序列與Bacillus Iicheniformis相似性最高，結合菌株的形態(tài)學特征（如圖2所示的 UTM115細胞的顯微形態(tài)）及生理生化特征，把該菌株鑒定為Bacillus licheniformis，命 名為UTM115,并于2014年9月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，郵編100101)。分 類命名為 Bacillus licheniformis，保藏號為