一株兼性厭氧砷氧化副球菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株兼性厭氧砷氧化副球菌及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 砷（As)是一種有劇毒的類金屬。在我國(guó)南方地區(qū)，受采礦和金屬冶煉的影響，農(nóng) 田砷污染情況已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重。砷污染嚴(yán)重的水稻土壤中，較高濃度的As會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)生毒害 效應(yīng)，危害其生長(zhǎng)發(fā)育，并降低農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)。由于稻田的水分管理方式以水稻對(duì)三價(jià) 砷（As(III))的快速吸收，水稻通常會(huì)比其他作物富集更高含量的砷。稻米已經(jīng)成為水稻 生產(chǎn)和消費(fèi)地區(qū)最為主要的砷的食物暴露途徑。
[0003] 生物修復(fù)法是利用生物的代謝機(jī)制吸收、沉淀、降解或氧化還原一定濃度的有毒 有害污染物，將污染物移走或降低其有效性。由于生物修復(fù)投資較少，可直接進(jìn)行原位修 復(fù)，且不會(huì)造成二次污染，所以是一種最有前景的污染修復(fù)手段。前期研宄表明淹水條件下 水稻土存在細(xì)菌亞砷酸氧化酶的基因，說明亞砷酸氧化菌的存在。水稻土壤中的砷氧化細(xì) 菌可以將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷，由于土壤中的鐵氧化物對(duì)五價(jià)砷吸附能力強(qiáng)，從而降低了 土壤中的砷的生物有效性和生物毒性。該法作為一種最有前景的砷污染治理方法，具有經(jīng) 濟(jì)高效且無害等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 與硝酸鹽還原耦合的三價(jià)砷氧化是由微生物介導(dǎo)的酶促反應(yīng)，具有砷氧化功能 和硝酸鹽還原活性的細(xì)菌是反應(yīng)得以進(jìn)行的關(guān)鍵。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三價(jià)砷氧化耦合硝 酸鹽還原的細(xì)菌只有固氮弧菌屬（Azoarcus sp.)、中華根瘤菌（Sinorhizobium sp.)、 AlkalilimnicolaehrlichiiMLHE-I等幾個(gè)屬。尚未發(fā)現(xiàn)來源于水稻土的厭氧砷氧化細(xì)菌， 所以分離篩選厭氧砷氧化細(xì)菌可以促進(jìn)三價(jià)砷在水稻土及水稻根際氧化，從而降低砷的有 效性及水稻籽粒的砷積累。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一株兼性厭氧砷氧化副球菌。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供厭氧砷氧化副球菌在砷污染土壤中的應(yīng)用。
[0007] -株兼性厭氧砷氧化副球菌（Paracoccusarsenicoxydans) SY，保藏于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年10月8日，保藏編號(hào)為：CCTCC N0:M2014456。
[0008] 菌株特征、分離步聚、砷氧化活性鑒定方法
[0009] (1)菌體形態(tài)特性
[0010] 采用常規(guī)細(xì)菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，該菌株為革蘭氏陰性菌，球 狀，大小為〇· 4-0. 6X0. 6-1. 0 μ m，細(xì)菌不具有運(yùn)動(dòng)性。
[0011] ⑵菌落形態(tài)特性
[0012] 在牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基平板上好氧培養(yǎng)24小時(shí)后，菌落形態(tài)為圓形，表 面凸起，邊緣整齊，橙黃色，菌落大?。╠)為1?2mm;在上述培養(yǎng)基上好氧培養(yǎng)48小時(shí)后， 菌落形態(tài)為圓形，表面光滑扁平，邊緣整齊，紅色，菌落大?。╠)為2?3_。
[0013] (3)主要的生理、生化特性
[0014] 在好氧條件下氧化酶反應(yīng)為陽性，硝酸鹽還原為陽性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陰性。 具有兼性厭氧生長(zhǎng)的能力；在好氧條件下，用API 32GN鑒定后發(fā)現(xiàn)，在32種不同碳源中，該 菌能利用其中的12種。在厭氧條件下能氧化的電子供體有：甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸 鹽。
[0015] (4) 16S rRNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析
[0016] 采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇（體積比24:1)抽提，0.6體積異丙醇沉淀的 方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16SrRNA通用引物F27和R1492擴(kuò)增細(xì)菌的16SrRNA， 在1500bp附近出現(xiàn)明顯的條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行序列測(cè)定，將獲得的DNA 序列輸入GenBank，以Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比對(duì)。該菌株與副球菌 屬的所有細(xì)菌的同源性均小于97%，該菌株是副球菌屬的一株新種。結(jié)合上述的生 理生化特性、16 S r RNA序列的結(jié)果，該菌株應(yīng)歸屬于副球菌屬，命名為砷氧化副球菌 (Paracoccusarsenicoxydans)SY 0
[0017] (5)砷氧化酶基因鑒定
[0018] 先用兼并引物（Qu6m6neur et al. Diversity surveys and evolutionary relationships of aoxB genes in aerobic arsenite-〇xidizing bacteria.Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74 (14)，4567-4573)擴(kuò)增 I. Ikb 的砷氧化酶基因的保守片段，再 用SEFA-PCR的方法擴(kuò)增出側(cè)翼的砷氧化酶基因（aioA)，該序列已經(jīng)提交至NCBI GenBank， 注冊(cè)號(hào)為KM594555。
[0019] 本發(fā)明所述的砷氧化副球菌SY在修復(fù)三價(jià)砷污染水體或土壤中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明所述的砷氧化副球菌SY在淹水砷污染水稻土壤中砷氧化的應(yīng)用。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0022] 1)提供一株兼性厭氧砷氧化副球菌SY，能夠在好氧和反硝化條件下固定0)2氧化 As(III) 〇
[0023] 2)砷氧化副球菌SY可以將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷，可以用于砷污染土壤的污染治 理，降低土壤中砷的毒害，尤其是應(yīng)用于淹水砷污染水稻土壤中氧化三價(jià)砷。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :砷氧化菌株S Y的掃描電鏡圖片。
[0025] 圖2 :砷氧化菌株SY系統(tǒng)發(fā)育分析。
[0026] 圖3 :好氧條件下菌株SY氧化As (III)的曲線。
[0027] 圖4 :反硝化條件下菌株SY氧化As (III)的曲線。
[0028] 圖5 :土壤溶液（A)和土壤磷酸提取液（B)中砷的含量。
[0029] 生物材料保藏信息
[0030] SY，分類命名為Paracoccus sp. SY，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為 中國(guó)武漢?武漢大學(xué)，保藏日期為2014年10月8日，保藏編號(hào)為：CCTCCN0 :M2014456。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例I :菌種的分離、純化
[0032] 取5g浙江上虞砷污染水稻土壤樣品于60mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為（g/L): 7. 9g Na2HPO4 · 7H20,1. 5g KH2PO4, 0· 3g NH4Cl，0· Ig MgSO4 · 7H20,維生素溶液 10. OmL (每升 維生素溶液含：生物素2. Omg，葉酸2. Omg，維生素 B6IO. Omg，核黃素5. Omg，維生素 BjOmg， 煙酸5. Omg，泛酸5. Omg，維生素 B12O. lmg，硫辛酸5. Omg)，微量元素溶液5. OmL (每升微量元 素溶液中含：三乙酸鈉鹽 I. 5g，MgS04 ·7Η20 3. 0g，MnS04 ·Η20 0· 5g，NaCl I. 0g，F(xiàn)eS04 ·7Η20 0· lg，CoCl2 · 6H20 0· lg，CaCl2O. lg，ZnSO4 · 7H20 0· lg，CuSO4 · 5H20 0· Olg，AlKSO4 · 12H20 0· Olg，H3BO3O. Olg，Na2M0O4O. Olg，NiCl2 · 6H20 0· 024g)，10mMHC(V(NaHC03)，ImM As(III) (NaAsO2)和5mM NO,（KNO3)。接種前往培養(yǎng)液中鼓充高純混合氣體（N2/C02= 80/20)彡I 小時(shí)，鋁蓋密封，培養(yǎng)液置于厭氧工作站（N2AX)2= 80/20)，30°C靜置培養(yǎng)。
[0033] 每隔一周檢測(cè)溶液中的As (III)和N03_的轉(zhuǎn)化效果。當(dāng)As (V)含量不斷增加時(shí)， 以5 %的接種量富集培養(yǎng)三次，然后稀釋，均勻涂布于固體培養(yǎng)基上（每升培養(yǎng)液加10克瓊 月旨，其它成分同上述液體培養(yǎng)基），置于厭氧工作站（N 2AX)2= 80/20) 30°C培養(yǎng)一周，挑取單 菌落進(jìn)行分離、純化，得到一株兼性厭氧砷氧化菌SY。
[0034] 實(shí)施例2 :菌種的鑒定
[0035] (1)生理生化性質(zhì)的測(cè)定：
[0036] 表1.菌株SY的生理生化特性
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株兼性厭氧砷氧化副球菌（Paracoccus arsenicoxydans)SY，保藏于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年10月8日，保藏編號(hào)為：CCTCC N0:M2014456。
2. 權(quán)利要求1所述的兼性厭氧砷氧化副球菌SY在修復(fù)三價(jià)砷污染水體或土壤中的應(yīng) 用。
3. 權(quán)利要求1所述的兼性厭氧砷氧化副球菌SY在淹水砷污染水稻土壤中砷氧化的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株厭氧砷氧化副球菌及其應(yīng)用。砷氧化副球菌(Paracoccus？arsenicoxydans)SY，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年10月8日，保藏編號(hào)為：CCTCC？NO：M2014456。本發(fā)明中的SY可以在好氧和厭氧的條件下氧化三價(jià)砷，具有很強(qiáng)的砷氧化速率，同時(shí)可以修復(fù)砷污染水稻土壤。CCTCC NO：M201445620141008
【IPC分類】C02F3-34, C02F101-20, B09C1-10, C12R1-01, C12N1-20
【公開號(hào)】CN104560812
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410840941
【發(fā)明人】趙方杰, 張雋, 周武先, 劉冰冰
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日