一株馬氏副球菌及其在促進(jìn)聚球藻生長中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一株馬氏副球菌及其在促進(jìn)聚球藻生 長中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)藻是一類地球上古老的能夠進(jìn)行產(chǎn)氧光合作用的原核微生物，通過基因工程 改造，它們在醫(yī)藥、能源、環(huán)保等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用優(yōu)勢，具體體現(xiàn)在（1)藍(lán)藻能夠吸收 太陽能、固定二氧化碳作為碳源進(jìn)行自養(yǎng)生長，培養(yǎng)成本低；(2)藍(lán)藻作為一類古老的微生 物，已在地球上存在了幾十億年，它們對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，生長迅速；（3)藍(lán)藻遺傳操作方 便，遺傳背景清晰，并且許多種類的藍(lán)藻的基因組測序工作也已經(jīng)陸續(xù)完成，運(yùn)使得利用基 因工程手段改造藍(lán)藻非常方便。
[0003] 聚球藻7002作為一種單細(xì)胞海洋藍(lán)藻，具有生長快、結(jié)構(gòu)簡單的特點(diǎn)，且全基因 組序列已破譯，是一種表達(dá)外源基因的最理想基因研究材料和宿主之一，其基礎(chǔ)研究已較 為成熟。當(dāng)前通過基因工程改造，利用聚球藻7002在制備蠟醋、嗜鐵素、人腫瘤壞死因子a 口服劑、W及通過微藻培養(yǎng)進(jìn)行產(chǎn)氨與制備生物乙醇等方面已開展較多深入研究，并取得 關(guān)鍵進(jìn)展，部分已進(jìn)入中試放大階段，在生物基因工程改造產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面具有十分重要 的潛力和價值。
[0004] 然而微藻相對于細(xì)菌等微生物而言，其培養(yǎng)周期較長，生長相對緩慢，成為實際生 產(chǎn)環(huán)節(jié)中影響時間和金錢成本的重要制約因素之一，如何有效改進(jìn)聚球藻的培養(yǎng)方式，提 高藻體光合生長的效率，縮短其培養(yǎng)周期，具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用前景。
[0005] 傳統(tǒng)的微藻培養(yǎng)往往是通過改善光照條件與培養(yǎng)溫度、W及調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中二氧化 碳濃度、抑值與營養(yǎng)鹽成分等對藻類生長條件進(jìn)行優(yōu)化，然而，通過改進(jìn)培養(yǎng)條件在一定程 度上雖然可提高微藻生長速度，但改進(jìn)結(jié)果往往并不是十分理想。而在傳統(tǒng)優(yōu)化培養(yǎng)條件 的基礎(chǔ)上，若能增加利用生物因子促進(jìn)微藻生長，將是一種十分具有重要意義的創(chuàng)新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，篩選出一株馬氏副球菌，并發(fā)現(xiàn)其能明顯地提高聚 球藻的光合生長速率，從而促進(jìn)聚球藻生長。
[0007] 自然界中微藻自身周圍總是附生大量細(xì)菌等微生物。藻類與細(xì)菌之間的關(guān)系錯綜 復(fù)雜，既對立又統(tǒng)一。一方面細(xì)菌可為藻類的生長提供營養(yǎng)鹽和必要的生長因子，從而調(diào)節(jié) 藻類的生長環(huán)境；另一方面細(xì)菌也可通過直接的或間接的作用抑制藻細(xì)胞的生長，甚至裂 解藻細(xì)胞，主要體現(xiàn)在營養(yǎng)競爭、毒素釋放W及溶藻酶類的產(chǎn)生等。
[0008] 細(xì)菌對藻類生長的促進(jìn)作用主要集中在營養(yǎng)改善（生源要素的提供、生長因子的 轉(zhuǎn)化）、信息素調(diào)節(jié)和協(xié)同保護(hù)。對生源要素的改善中，主要體現(xiàn)為通過固N(yùn)作用、還原=價 鐵為溶解度較高的二價鐵、還原產(chǎn)生無機(jī)憐、產(chǎn)生和分泌維生素（如VBi2)等方式促進(jìn)藻類 生長。在為藻類提供生長因子方面，主要體現(xiàn)為細(xì)菌可轉(zhuǎn)化和加工各種激素和生長促進(jìn)劑。 例如一些海洋細(xì)菌能產(chǎn)生植物激素（如植物細(xì)胞分裂素和巧長素）促進(jìn)藻類生長。此外， 細(xì)菌對維持藻細(xì)胞個體形態(tài)也有調(diào)節(jié)作用。另外，細(xì)菌通過對毒物進(jìn)行吸附、分解和轉(zhuǎn)化， 可減少或消除重金屬W及污染物對藻細(xì)胞的侵害，進(jìn)行協(xié)同保護(hù)。
[0009] 本發(fā)明篩選出一株馬氏副球菌，命名為ParacoccusmarcusiiSYN7002-084;于 2015年10月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（地址：北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCCNo. 11548。
[0010] 1)菌株的篩選及分離純化
[0011] W城市濱海水體作為促生菌分離源，采用微藻選擇壓力法進(jìn)行藻際細(xì)菌富集，隨 后采用涂布平板及分區(qū)劃線法經(jīng)多次純化分離，最終篩選出具有較高促進(jìn)微藻生長效能的 菌株，編號SYN7002-084;將其接入斜面培養(yǎng)基，于冰箱4°C保存；細(xì)菌培養(yǎng)基采用2216E培 養(yǎng)基；
[0012] 2)菌株的分子生物學(xué)鑒定：
[0013]使用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R巧'-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-3'），并應(yīng)用PCR技術(shù)，從該菌株總DNA中擴(kuò)增16SrDNA片段。經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)具有一條約為1. 5化大小的PCR特征性條帶，運(yùn)與該菌株的16SrDNA 的理論估計值相符。進(jìn)一步利用雙向引物測序，最終得到菌株的16SrDNA的序列為：SEQ. ID.NO. 1。
[0014] 將SYN7002-084的測序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)SYN7002-0845和 Paracoccusmarcusii同源性為 99%，命名為ParacoccusmarcusiiSYN7002-084。
[0015] 該菌株為好氧、革蘭氏陰性菌，短桿狀，無鞭毛，細(xì)胞大小為0.5~0.9ym，在 2216E培養(yǎng)基上生長時，菌落呈圓形，隆起，表面光滑，濕潤，邊緣不整齊，黃色。電鏡圖片如 圖1所示。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的在于公開馬氏副球菌在提高聚球藻產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0017] 所述馬氏副球菌的菌液濃度為2. 16XIO9個/111以按照5%的體積比添加到聚球藻 的培養(yǎng)液中。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019]W聚球藻培養(yǎng)液中的葉綠素巧光值與藻細(xì)胞密度為度量指標(biāo)，結(jié)果表明該菌株具 有較強(qiáng)的促進(jìn)微藻生長的作用，一定時間內(nèi)可使聚球藻光合生長效率提高3. 19倍，大大縮 短微藻培養(yǎng)周期，單位時間內(nèi)可明顯提高微藻產(chǎn)量，節(jié)約時間和金錢成本，提高收益。
【附圖說明】
[0020] 附圖 1 為本發(fā)明ParacoccusmarcusiiSYN7002-084 電鏡圖片； 1^0021]附圖2為聚球藻P(X7002培養(yǎng)液中加入促生菌Paracoccusmarcusii SYN7002-084后藻液中的葉綠素巧光值變化（可度量藻類光合生長效率）；
[0022] 附圖 3 聚球藻PCC7002 培養(yǎng)液中加入促生菌ParacoccusmarcusiiSYN7002-084 后藻液中的藻細(xì)胞密度變化。
【具體實施方式】
[0023] 本發(fā)明的【具體實施方式】如下： 陽〇24] 實施例I:
[0025] 本實施例W青島石老人城市濱海水體作為促生菌分離源，采用微藻選擇壓力法進(jìn) 行藻際細(xì)菌富集，隨后采用涂布平板及分區(qū)劃線法經(jīng)多次純化分離，最終獲得325株細(xì)菌 株系，分別將每株細(xì)菌至于50mL液體培養(yǎng)基中，25°C，200巧m條件下培養(yǎng)1-3天，然后從 中取出5mL分別加入到50mL聚球藻培養(yǎng)液中，考察、比較各菌對藻類生長的促進(jìn)效果，最 終篩選出具有較高促進(jìn)微藻光合生長能力的菌株SYN-084。經(jīng)鑒定為馬氏副球菌，命名為 ParacoccusmarcusiiSYN7002-084,將其接入斜面培養(yǎng)基，于冰箱4°C保存。 陽0%] 細(xì)菌培養(yǎng)采樣2216E培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方構(gòu)成為表1 :
[0027]表1Zobell2216E培養(yǎng)基配方
[0030] 固體2216E培養(yǎng)基需加入1.5%的瓊脂粉，121°(：，2〇111111高溫高壓滅菌后倒平板備 用。2216E液體培養(yǎng)基由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供。
[0031] 將保藏培養(yǎng)基菌種活化后接種到裝有培養(yǎng)基的50mL無菌S角瓶中，在25°C、 20化pm條件下震蕩培養(yǎng)4化后，細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)增長期，將2血菌液化16XIO9個/Ml倒入 50ml含對數(shù)生長期聚球藻的A+培養(yǎng)液中（藻密度為1. 84XIO7個/Ml)，溫度為30°C，光照 強(qiáng)度：1化光照：1化黑暗，葉綠素巧光值為27. 446,設(shè)空白對照。
[0032]聚球藻PCC7002培養(yǎng)基mediumA
[0033] 主要成分如下：
[0034]聚球藻PCC7002培養(yǎng)基mediumA
[0035] Abase:配制10倍混合液，然后混合稀釋成Ix工作濃度
[0037] *注：如果沒有無水氯化巧，可用二水合氯化巧
[0038] D7 微量元素（1000Xg/L)
[0040]AFMBase: =ABase+Fe-邸TA+微量元素（1000血）
[0041 ]
陽O創(chuàng)完全A培養(yǎng)基：分別將下列溶液高壓濕熱滅菌，然后加到IxAFMBase,混勻。
[0044] 在光照培養(yǎng)條件下使用A+培養(yǎng)基培養(yǎng)藻種，培養(yǎng)條件如下，培養(yǎng)溫度：2(TC，光照 強(qiáng)度為3000LUX，光照間隙是白天12h:黑夜12h，每隔1天測定受試藻液的葉綠素巧光值和 藻細(xì)胞密度，連續(xù)監(jiān)測8天。
[0045] 葉綠素巧光值采用檢測藻液在激發(fā)波長440nm、發(fā)射波長680nm處的巧光強(qiáng)度，與 對照組比較，藻細(xì)胞密度采樣流式細(xì)胞計數(shù)法（使用配有488皿氣激光器的化icsAltra II型流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)側(cè)向散射光VS紅色巧光和澄色巧光VS紅色巧光來確 定聚球藻的位置，加入直徑為1ym的巧光微球作為內(nèi)參。 W46] 結(jié)果表明，如圖1和2所示，葉綠素巧光值在添加馬氏副球菌Paracoccus marcusiiSYN7002-084細(xì)菌后表現(xiàn)出明顯的快速增高趨勢，在培養(yǎng)六天時間內(nèi)，其聚球藻 光合生長效率相對于對照組提高了 3. 19倍，藻細(xì)胞密度和藻細(xì)胞體積亦明顯提高。
【主權(quán)項】
1. 一株馬氏副球菌（fflarcysii)，它的保藏號是CGMCCNo. 11548。2. 如權(quán)利要求1所述的馬氏副球菌，其特征在于，它的16SrDNA序列如SEQIDNO. 1 所示。3. -種如權(quán)利要求1所述的馬氏副球菌在提高聚球藻產(chǎn)量中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述馬氏副球菌在提高聚球藻產(chǎn)量中的應(yīng)用，其特征在于，所述馬氏 副球菌的菌液濃度為2. 16X109個/mL，按照5%的體積比添加到聚球藻的培養(yǎng)液中。
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株馬氏副球菌及其在促進(jìn)聚球藻生長中的應(yīng)用。本發(fā)明篩選出一株馬氏副球菌，命名為<i>Paracoccus</i><i>？marcusii</i>？SYN7002-084；于2015年10月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號為？CGMCC？No.11548。該菌株具有較強(qiáng)的促進(jìn)微藻生長的作用，一定時間內(nèi)可使聚球藻光合生長效率提高3.19倍，大大縮短微藻培養(yǎng)周期，單位時間內(nèi)可明顯提高微藻產(chǎn)量，節(jié)約時間和金錢成本，提高收益。CGMCC No.1154820151028
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/01
【公開號】CN105296399
【申請?zhí)枴緾N201510829667
【發(fā)明人】張永雨, 唐麗麗, 梁彥韜, 解瑞澤
【申請人】中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月25日