專利名稱：一株哌嗪降解副球菌pq-01及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一株哌嗪降解副球菌PQ-Ol及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胺類化合物可看成是氨分子中的氫原子被烴基取代后所得到的產(chǎn)物。許多胺類化合物在醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。有機(jī)胺的大量使用，勢必會對環(huán)境造成污染進(jìn)而危害人類健康。低級胺有濃重的像氨的難聞氣味，如三甲胺則有難聞魚腥味。低級脂肪胺易溶于水，它們在水中的溶解度和氣味則隨分子量的增加而減小。芳香胺為液體或固體，有難聞的氣味。結(jié)構(gòu)較簡單的芳胺微溶于水、較復(fù)雜的不溶。芳胺有較大的毒性，吸入蒸氣或經(jīng)皮膚滲入都能導(dǎo)致中毒。聯(lián)苯胺還有致癌的作用。有機(jī)胺進(jìn)入環(huán)境中，一些易被生物降解，另些不易被降解的便對環(huán)境產(chǎn)生破壞。哌嗪是一種有機(jī)胺類化合物，是重要的醫(yī)藥中間體和精細(xì)化工原料，哌嗪與有機(jī)酸或無機(jī)酸生成的鹽廣泛用作人和動物的驅(qū)蟲劑，有機(jī)酸鹽主要用于人體，而無機(jī)鹽則多作為獸藥。哌嗪主要用途是用作醫(yī)藥中間體，用于生產(chǎn)氟哌酸、吡哌酸、強(qiáng)痛定、利福平等藥物。哌嗪衍生物中的N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、2-甲基哌嗪、氨乙基哌嗪、輕乙基哌嗪等，也在制藥、表面活性劑、合成纖維中有廣泛應(yīng)用。此外，哌嗪還可作為橡膠硫化劑、抗氧劑、防腐劑、表面活性劑、合成樹脂、合成纖維、合成皮革等的原料，用途極為廣泛。近年來，隨著我國醫(yī)藥工業(yè)和精細(xì)化工的迅速發(fā)展，對哌嗪及其衍生物的需求量急劇上升，其中以無水哌嗪價(jià)值為最高，應(yīng)用最廣。生物降解是自然界中胺類物質(zhì)去除的主要途徑，目前國內(nèi)尚沒有哌嗪高效降解菌的研究報(bào)道，因此，從哌嗪污染的環(huán)境中分離出高效降解哌嗪的微生物菌株，利用微生物的作用修復(fù)環(huán)境中的哌嗪污染具有重大的理論意義和潛在的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，開發(fā)研制出一種新型的哌嗪降解菌劑，使用本菌劑可以降解廢水中的哌嗪，使哌嗪殘留量大大降低，使廢水達(dá)標(biāo)排放，同時(shí)降低處理成本，適用于現(xiàn)代廢水處理工藝。本發(fā)明提供的哌嗪降解菌株P(guān)Q-Ol是通過馴化、富集、稀釋涂布分離篩選到的一株革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌，于2013年I月15日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC N0.7141，經(jīng)鑒定為副球菌屬)。主要生物學(xué)特性為G_，球狀或球桿狀，無芽孢，無運(yùn)動性。哌嗪降解菌PQ-Ol在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后的特征是:菌落表明突起，光滑，邊緣整齊，乳黃色，不透明。所述的LB培養(yǎng)基的成分是:酵母膏 5.00，蛋白胨 10.00，NaCl 10.00，pH 7.0。本發(fā)明提供了含有所述副球菌PQ-Ol的菌劑。
本發(fā)明還提供了一種所述副球菌PQ-Ol生產(chǎn)菌劑的方法，包括:斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品，包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑。所述副球菌PQ-Ol生產(chǎn)菌劑的方法，具體步驟為:
O活化培養(yǎng):將哌嗪降解菌PQ-Ol的試管種接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；
2)種子液制備:將上述培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即為種子液；
3)菌劑制備:將種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)發(fā)酵，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液即為菌劑。步驟I)中所述的LB培養(yǎng)基配方為=NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉
5.00g/L, pH7.0。步驟2)中所述種子罐所用的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.8%，(NH4) 2S04 1%，K2HPO4
0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。所述步驟2)中種子罐和步驟3)中生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量均為1:
0.6-1.2，攪拌速度均為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度均為30_35°C，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。本發(fā)明提供了上述方法所制備的菌劑在哌嗪降解中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種消除哌嗪污染的降解菌，可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)，且該菌能以哌嗪為唯一碳源和`氮源進(jìn)行生長，實(shí)驗(yàn)室生物降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對IOOmg/L哌嗪的降解率達(dá)到100%。該發(fā)明生產(chǎn)的降解菌劑具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在含有哌嗪的廢水處理中推廣使用。本發(fā)明對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人類的身體健康，降低廢水處理成本具有重要的意義。


圖1為顯微鏡下降解菌PQ-01菌落照片；
圖2為菌株P(guān)Q-01菌體結(jié)晶紫染色照片；
圖3為菌株P(guān)Q-01對哌嗪的降解；
圖4為溫度對哌嗪降解效率的影響；
圖5為pH對哌嗪降解效率的影響；
圖6為不同初始濃度下菌劑對哌嗪的降解；
其中:Λ代表哌嗪的降解，〇代表哌嗪降解菌PQ-01的生長。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1哌嗪降解菌PQ-01的分離和鑒定
取哌嗪富集菌液，進(jìn)行梯度稀釋。稀釋液涂布于含100mg/L哌嗪的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為:每升含 1.5 g K2HP04、0.5 g ΚΗ2Ρ04、0.2 g MgSO4X 7H20、1.0 g NaCl、18g瓊脂，pH =7.0，30°C培養(yǎng)數(shù)天。從中挑取單菌落，利用HPLC驗(yàn)證其降解效果，將降解效率較高的一株菌株用30%的甘油保存于-20°C冰箱中。其菌落圖片見圖1，鑒定為副球菌屬(.Paracoccus);命名為:PQ_01。其結(jié)晶紫染色照片如圖2所示，主要生物學(xué)特性為G_，對數(shù)生長期菌體為球狀或球桿狀，無芽孢，無運(yùn)動性。能以哌嗪為唯一碳源和氮源進(jìn)行生長，并將其徹底礦化。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶實(shí)驗(yàn)中，30°C、160rpm轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)30h，通過液相測定，結(jié)果顯示對250mg/L的哌嗪的降解率達(dá)100%，如圖3所示。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)室生物降解實(shí)驗(yàn)
1.溫度對哌嗪降解效率的影響
在無氮基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(NaCl 1.0 g.I/1，K2HPO4 1.5 g. Λ KH2PO4 0.5 g. ΛMgSO4.7Η20 0.2 g.L_\ pH 7.0，下同)中加入IOOmg.Γ1的哌嗪，以1%的接種量接入降解菌株種子液(OD600 ^ 1.6)，于不同溫度下(15°〇，251:，301:，351:，40°0，搖床 160r.min—1培養(yǎng)，24h后取樣，測定哌嗪濃度。結(jié)果如圖4所示。表明PQ-Ol的最適降解溫度為30°C;在較低的溫度下仍具有一定的降解能力，而過低或過高的環(huán)境溫度會抑制哌嗪的生物降解。2.pH對哌嗪降解效率的影響
在pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的磷酸緩沖體系配制的無氮基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，加入IOOmg -Γ1的哌嗪，以1%的接種量接入降解菌株種子液(OD6tltl ^ 1.6)，于30 °C、160r -min^1搖床培養(yǎng)，28h后取樣，測定哌嗪濃度。結(jié)果如圖5所示。表明PQ-Ol的最適降解pH為8，在較低或較高PH的情況下都會抑制其對哌嗪的降解。實(shí)施例3哌嗪降解菌PQ-Ol生產(chǎn)菌劑的方法
將本發(fā)明的哌嗪降解菌PQ-Ol的原種在培養(yǎng)皿上與培養(yǎng)箱中活化，30°C 30h，并測定降解性能，帶菌落成熟后接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml LB培養(yǎng)基的IOOOml搖瓶中，LB培養(yǎng)基配方 g/L:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，pH 7.0，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.8%，(NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%，酵母膏 0.02%, pH 值
7.2-7.5。投料完畢后121 °C高壓濕熱滅菌，冷卻至33°C后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1:1。將到達(dá)對數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1 kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.6，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/分，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。實(shí)施例4哌嗪降解菌PQ-Ol生產(chǎn)菌劑的方法
將本發(fā)明的哌嗪降解菌PQ-Ol的原種在培養(yǎng)皿上與培養(yǎng)箱中活化，30°C 30h，并測定降解性能，帶菌落成熟后接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml LB培養(yǎng)基的IOOOml搖瓶中，LB培養(yǎng)基配方g/L:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，pH 7.0，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.8%，(NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%，酵母膏 0.02%, pH 值7.2-7.5。投料完畢后121 °C高壓濕熱滅菌，冷卻至33°C后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1:0.8。將到達(dá)對數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在35°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1: 1.2，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。實(shí)施例5添加菌劑于不同初始濃度哌嗪廢水中的降解實(shí)驗(yàn)
在無氮基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中分別加入100，200，300，400mg.L—1的不同初始濃度哌嗪，以5%的接種量接入實(shí)施例3或4制備的菌劑，于30°C，搖床160r.HiirT1培養(yǎng)，每隔4h取樣，測定哌嗪濃度。結(jié)果如圖6所示。測定結(jié)果表明，加入降解菌劑可以快速降解哌嗪，并且降解菌對哌嗪的耐受濃度 范圍很廣。
權(quán)利要求
1.一株哌嗪降解副球菌sp.)菌株P(guān)Q-Ol，其保藏編號為CGMCC N0.7141。
2.權(quán)利要求1所述副球菌PQ-Ol在哌嗪降解中的應(yīng)用。
3.含有權(quán)利要求1所述副球菌PQ-Ol的菌劑。
4.一種所述副球菌PQ-Ol生產(chǎn)菌劑的方法，包括:斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品，包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)菌劑的方法，具體步驟為: 活化培養(yǎng):將哌嗪降解菌PQ-Ol的試管種接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期； 種子液制備:將上述培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即為種子液； 菌劑制備:將種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)發(fā)酵，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液即為菌劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述的LB培養(yǎng)基配方為=NaCl10.00g/L,蛋白胨 10.00g/L,酵母粉 5.00g/L, pH7.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述種子罐所用的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖 0.8%, (NH4)2SO4 1%, K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%, pH 值 7.2-7.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中種子罐和步驟3)中生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量均為1:0.6-1.2，攪拌速度均為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度均為30-35°C，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。
9.權(quán)利要求5-8任 一項(xiàng)所述的方法制備的菌劑在哌嗪降解中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種消除哌嗪殘留的降解菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域。所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌PQ-01，經(jīng)鑒定為副球菌屬(Paracoccussp.)。主要生物學(xué)特性為革蘭氏陰性，球狀或球桿狀，無芽孢，非運(yùn)動性。該菌能以哌嗪為唯一碳源和氮源進(jìn)行生長，并將其徹底礦化。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下該菌株能在24小時(shí)之內(nèi)將100mg/L哌嗪降解到檢測不到的水平，解決了廢水處理中哌嗪難生物降解的問題。
文檔編號C02F101/38GK103114065SQ20131008313
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者蔡舒, 陳立偉, 蔡天明, 李欣, 胡江, 楊倩, 邱滬生 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)