一種高效檢測禽肉中哌嗪殘留的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測領(lǐng)域，具體涉及一種高效檢測禽肉中哌嗪殘留的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前國內(nèi)外對哌嗪的殘留檢測方法主要有重量分析法、比色法、非水滴定法、氣相 色譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。重量分析法、比色法和非水滴定 法不適合生物樣品中哌嗪的檢測，靈敏度較低。哌嗪無發(fā)光基團(tuán)，不能直接被紫外檢測器和 熒光檢測器檢測，需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)使其攜帶發(fā)光基團(tuán)，試驗(yàn)步驟繁瑣，且衍生化產(chǎn)物不 穩(wěn)定，所得數(shù)據(jù)誤差較大。到目前為止，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC)和高效液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS)對豬組織、牛組織、雞蛋、蜂蜜中哌嗪殘留檢測方法雖有報(bào)道，但檢測 豬組織、牛組織、雞蛋、蜂蜜和禽肉中哌嗪殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/ MS)的研宄尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了能檢測并確證哌嗪在禽肉中的殘留，滿足歐盟標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明提供了一種超高 效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS)，能快速、高效地檢測禽肉中哌嗪的殘留。
[0004] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種高效檢測禽肉中哌嗪殘留的方法，是將禽肉經(jīng) 過提取和凈化后，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS)檢測。以0. 1 %甲酸水溶 液-甲醇為流動相，流速為0. 2mL/min，梯度洗脫，進(jìn)樣量為5. 0 μ L。采用電噴霧正離子模 式電離（ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描（MRM)，外標(biāo)法定量分析。
[0005] 所述的禽肉提取和凈化是以5. 0%三氯乙酸水溶液和乙腈的混合溶液為提取劑處 理禽肉樣品得提取液，提取液中加入乙腈飽和的正己烷去除脂肪后，用固相萃取法凈化。具 體可采用下述操作：將禽肉樣品均質(zhì)后，加入5.0%三氯乙酸水溶液和乙腈混合溶液（體積 比3:1)振蕩、混勻直接提取，離心，將上清液轉(zhuǎn)移。重復(fù)提取1-2次，合并上清液，即得提取 液。
[0006] 向提取液中加入乙腈飽和的正己烷去除脂肪后，過混合陽離子固相萃取小柱 (Strata-X-C)，先依次用甲醇、超純水、2. 0%甲酸水溶液將SPE小柱活化平衡，上樣后待 提取液勻速流干后，再依次用2. 0%甲酸水溶液、超純水、甲醇淋洗，待小柱干燥后，最終用 10.0%氨水乙腈進(jìn)行洗脫。最后洗脫液用氮?dú)獯蹈?，上機(jī)前用2. OmL 20.0%甲醇水溶液渦 旋振蕩溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移2. OmL復(fù)溶液至離心管中，常溫離心10min，將上層清液過0. 22 μ m濾 膜，濾液供UPLC-MS/MS測定分析。
[0007] 本發(fā)明在回收率、精密度和靈敏度三個方面與其他檢測方法進(jìn)行比較，本方法具 有簡單、快速、準(zhǔn)確和靈敏的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0008] 圖1哌嗪的電噴霧一級質(zhì)譜掃描圖。
[0009] 圖2哌嗪的電噴霧二級質(zhì)譜掃描圖。
[0010] 圖3雞肌肉中哌嗪的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0011] 圖4空白雞肌肉的總離子流色譜圖（TIC)和提取離子色譜圖（XIC)。
[0012] 圖5空白雞肌肉樣品添加1 μ g/kg (LOQ)標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖（TIC)和提取 離子色譜圖（XIC)。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例只是為 了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0015] 在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相 同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0016] 本發(fā)明中所涉及到的溶液百分濃度，除特別說明外均為質(zhì)量百分濃度。
[0017] 1.實(shí)驗(yàn)家禽的飼養(yǎng)和樣品采集
[0018] 分別選取銷往各活禽農(nóng)貿(mào)市場和超市的上市日齡肉用家禽，即16周齡京海黃雞、 10周齡揚(yáng)州鵝和8周齡櫻桃谷鴨各12羽，公、母各半，單籠飼養(yǎng)，飼喂不含任何藥物的全價 飼料，自由飲水。飼養(yǎng)2周后屠宰時分別取兩側(cè)胸肌作為空白肌肉樣品，-35°C保存，使用時 將該樣品絞碎使之均質(zhì)。
[0019] 2.本發(fā)明提取與凈化步驟
[0020] 1)用粉碎機(jī)將禽肉均質(zhì)；
[0021] 2)準(zhǔn)確稱?。?. 0±0. 02) g均質(zhì)好的空白禽肉樣品，置于50.0 mL聚丙烯帶蓋離心 管內(nèi)；
[0022] 3)加入6. OmL 5. 0%三氯乙酸水溶液和2. OmL乙腈，渦旋混勻2min，水浴超聲振蕩 輔助萃取IOmin ;
[0023] 4)以12000\8,4°〇離心10111丨11，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50.01^離心管中；
[0024] 5)重復(fù)提?。?. OmL 5. 0 %三氯乙酸水溶液和2. OmL乙腈再次提取沉淀物，渦旋振 蕩2111；[11，超聲振蕩輔助萃取10111；[11)，12000\〖，4<€離心10111；[11，合并兩次上清液 ；
[0025] 6)向上清液中添加10.0 mL乙腈飽和的正己燒，渦旋振蕩3min，6000Xg，4°C離心 5min，棄去上層正己烷，重復(fù)去脂一次，最終得到提取液；
[0026] 7)依次分別用3. OmL甲醇、3. OmL超純水、3. OmL 2. 0%甲酸水溶液將混合陽離子 固相萃取小柱（Strata-X-C)活化；
[0027] 8)向活化后的固相萃取小柱中加入提取液，勻速流干；
[0028] 9)依次用3. OmL 2. 0%甲酸水溶液、3. OmL超純水、3. OmL甲醇淋洗；
[0029] 10)待固相萃取小柱干燥后，用10.0 mL 10. 0%氨水乙腈洗脫至IOmL離心管中；
[0030] 11)將離心管置于干浴氮吹儀中，40°C氮?dú)獯蹈桑?br>[0031] 12)取2. OmL 20. 0%甲醇水溶液渦旋振蕩溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移至2. OmL具塞離心管 中；
[0032] 13) 12000\8，常溫下離心101^11，上清液經(jīng)0.22 4111濾膜過濾，濾液供詘^：-]^/]^ 測定。
[0033] 3試驗(yàn)條件
[0034] 3. 1液相色譜條件
[0035] 色譜柱！Waters ACQUITY UPLCk HSS T3,1. 8 μm，100.0 mmX2. Imm i. d.;保護(hù) 柱：ACQUITY UPLCk BHl C18,1. 7 μ m，2· I X 5mm i. d.;流動相：A 液為 0· I % (體積分?jǐn)?shù)） 甲酸水溶液，B液為甲醇，梯度洗脫程序見表1 ;流速：0. 2mL/min ;柱溫：35. (TC ;樣品室溫 度：4°C;進(jìn)樣體積：5. 0 μ L ;六通閥：0~I. 3min -質(zhì)譜（B位），1. 3~4min -廢液（A位）， 4~8min -質(zhì)譜（B位）。
[0036] 表1梯度洗脫程序
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效檢測禽肉中哌嗪殘留的方法，其特征在于，將禽肉經(jīng)過提取和凈化后，用超 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的條件是：以 0. 1 %甲酸水溶液-甲醇為流動相，流速為0. 2mL/min，梯度洗脫，進(jìn)樣量為5. O y L ;采用電 噴霧正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描，外標(biāo)法定量分析。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的禽肉提取和凈化是：以5. 0 %三氯 乙酸水溶液和乙腈的混合溶液為提取劑處理禽肉樣品得提取液，提取液中加入乙腈飽和的 正己烷去除脂肪后，用固相萃取法凈化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的禽肉提取和凈化具體步驟是：將禽 肉樣品均質(zhì)后，加入5. 0%三氯乙酸水溶液和乙腈混合溶液振蕩、混勻直接提取，離心，將上 清液轉(zhuǎn)移；重復(fù)提取1-2次，合并上清液，即得提取液； 向提取液中加入乙腈飽和的正己烷去除脂肪后，過混合陽離子固相萃取小柱 Strata-X-C，先依次用甲醇、超純水、2. 0%甲酸水溶液將SPE小柱活化平衡，上樣后待提 取液勻速流干后，再依次用2. 0 %甲酸水溶液、超純水、甲醇淋洗，待小柱干燥后，最終用 10.0%氨水乙腈進(jìn)行洗脫。最后洗脫液用氮?dú)獯蹈?，上機(jī)前用2. OmL 20.0%甲醇水溶液渦 旋振蕩溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移2. OmL復(fù)溶液至離心管中，常溫離心10min，將上層清液過0. 22 y m濾 膜，濾液供UPLC-MS/MS測定分析。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述5. 0%三氯乙酸水溶液和乙腈的混合 溶液，其中5. 0%三氯乙酸水溶液和乙腈的體積比為3 :1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測領(lǐng)域，具體涉及一種高效檢測禽肉中哌嗪殘留的方法。該方法是將禽肉經(jīng)過提取和凈化后，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。本發(fā)明在回收率、精密度和靈敏度三個方面與其他檢測方法進(jìn)行比較，具有簡單、快速、準(zhǔn)確和靈敏的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N30-06, G01N30-02
【公開號】CN104807906
【申請?zhí)枴緾N201510228890
【發(fā)明人】謝愷舟, 孫禮瑞, 龐茂達(dá), 王冉, 王劍鋒, 崔璐璐, 劉建宇, 高強(qiáng), 劉亞楠, 王波, 張跟喜, 戴國俊, 卜仕金, 王金玉
【申請人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月7日