本發(fā)明涉及一種內(nèi)生真菌菌株及其代謝產(chǎn)物提取方法和用途，屬于微生物及微生物藥物領域。

背景技術：

細菌耐藥性在世界范圍內(nèi)日趨嚴重，涌現(xiàn)出了一些具有高度多重耐藥能力的“超級細菌”。2010年世界著名醫(yī)學雜志《The Lancet Infectious Diseases》（《柳葉刀-傳染病》）報道了一種攜帶“新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1”（New Delhi metallo-β-lactamase-1，簡寫為NDM-1）耐藥基因的新型“超級細菌”，該“超級細菌”能夠耐受幾乎所有的抗生素，僅對多粘菌素（colistin）和替加環(huán)素（tigecycline）敏感，有的菌株甚至也能夠耐受這兩種藥物。該耐藥基因可通過質(zhì)粒在菌株間傳遞，從而使其快速傳播和蔓延。此類細菌相繼在包括我國在內(nèi)的世界多國被發(fā)現(xiàn)，引起了人們極大的震動和關注。

NDM-1是一種新型β-內(nèi)酰胺酶。產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細菌產(chǎn)生耐藥性的主要機制之一，該類酶能夠分解β-內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類等分子結構上含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的藥物），從而使其失去活性。β-內(nèi)酰胺酶種類繁多，目前臨床危害嚴重的酶包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、AmpC類β-內(nèi)酰胺酶、絲氨酸碳青霉烯酶及金屬β-內(nèi)酰胺酶等，上述NDM-1即是一種金屬β-內(nèi)酰胺酶。細菌可同時攜帶多種β-內(nèi)酰胺酶基因，有些菌株還連鎖攜帶其它耐藥基因，如對氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素耐藥的基因，從而導致多重耐藥。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, 簡寫為MRSA）是另一類“超級細菌”。該類細菌早在上世紀六十年代已被發(fā)現(xiàn)，但至今尚未被控制，且其耐藥性及危害愈來愈嚴重，已發(fā)展成為全球性致病菌，是院內(nèi)感染最常見的病原菌之一，并逐漸向社區(qū)擴散。MRSA對絕大多數(shù)臨床常用抗生素均有耐受性，包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等藥物。糖肽類抗生素萬古霉素治療MRSA感染的效果較好，但近年來出現(xiàn)了耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌菌株（Vancomycin-resistant S. aureus, 簡寫為VRSA）。另外利奈唑胺（linezolid）、達托霉素（daptomycin）及替加環(huán)素等也具有一定的療效，但均有各自的不足。

上述耐藥菌在臨床上危害嚴重。面對這些耐藥菌的感染，目前可選用的治療方案和治療藥物非常有限，甚至無藥可用，特別是對于免疫缺陷、年老體弱、大手術后、長期住院、存在嚴重基礎疾病、長期大量應用廣譜抗菌藥物、入住ICU病房、多臟器功能不全、接受化療或放療等患者，治療困難，病死率高。因此，研發(fā)新型抗生素刻不容緩。我們從藥用植物十大功勞Mahoniafortunei的健康葉片中分離到一株內(nèi)生真菌PF1167，體外實驗表明，該菌株的代謝產(chǎn)物提取物對攜帶上述β-內(nèi)酰胺酶基因的菌株及MRSA具有顯著的抑制活性。該菌株易于培養(yǎng)，具有開發(fā)新抗生素的潛力。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為研制新型抗菌藥物提供了一種內(nèi)生真菌菌株及其代謝產(chǎn)物提取方法和用途，該菌株的代謝產(chǎn)物提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌等野生型菌株以及攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌或肺炎克雷伯菌等耐藥菌株具有顯著的抑菌活性，對臨床分離的同時攜帶NDM-1等多種β-內(nèi)酰胺酶基因的大腸桿菌、陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌，以及MRSA等“超級細菌”均具有顯著的抑制活性。該菌株易于培養(yǎng)，具有開發(fā)新抗生素的潛力。

一種內(nèi)生真菌菌株PF1167，經(jīng)形態(tài)學特征觀察及其rDNA ITS序列分析鑒定為鐮孢菌Fusariumsp.，其微生物保藏編號為：CGMCC No.11815。保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2016年1月08日。

本發(fā)明所述內(nèi)生真菌菌株PF1167分離于十大功勞的健康葉片。該菌株的形態(tài)學特征如下：將內(nèi)生真菌PF1167接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar ，簡寫為PDA）培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)8天，可見白色菌落，菌絲絨毛狀，菌落直徑6.5cm，邊緣規(guī)則，菌落背面初無色，培養(yǎng)7日后中部開始呈暗紅色（圖1-2），并逐漸加深；分生孢子梗不一，細長、簡單，分枝不規(guī)則，分生孢子無色，不一，有大小型兩種，大型分生孢子長棒形，小型分生孢子卵圓形，常聚生（圖3-4）。提取該菌株的基因組總DNA，利用真菌通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）對獲得的基因組DNA進行PCR擴增，然后對PCR產(chǎn)物進行測序，獲得該菌株的核糖體DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer, ITS）數(shù)據(jù)。進入美國國家生物技術信息中心（National Center forBiotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，對測序數(shù)據(jù)進行核酸Blast分析，結果表明所測序列與一株Fusariumsp.的ITS序列（登錄號：KM513579.1）相似度達99%。應用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結果表明，該菌株與上述Fusariumsp.聚類于同一末端分支。結合菌株PF1167的形態(tài)學特征與ITS序列分析，鑒定該菌株為Fusarium屬菌種，本菌株定名為Fusariumsp.PF1167。

將菌株PF1167接種于裝有馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的瓶中，于25℃下靜置培養(yǎng)21天，將培養(yǎng)物過濾，得上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮，向濃縮液中加入3倍體積的無水乙醇，充分震蕩后過濾，得上清液，將上清液濃縮干燥，溶于無菌水后制得代謝產(chǎn)物提取物。

所述的代謝產(chǎn)物提取物，具有抑菌活性。

所述的抑菌活性：被該菌株的代謝產(chǎn)物提取物抑制的菌株包括以下菌株：

（1）野生型大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌；

（2）攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌或肺炎克雷伯菌菌株，上述基因包括臨床危害嚴重的β-內(nèi)酰胺酶基因：a. 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，包括TEM-10、TEM-12、TEM-26、SHV-5、SHV-12、SHV-18、OXA-2、OXA-10、OXA-48、CTX-M-3、CTX-M-14、CTX-M-15；b. Amc類β-內(nèi)酰胺酶基因，包括DHA-1、CMY-2、FOX-5；c. 絲氨酸碳青霉烯酶基因，包括NMC-A、KPC-2、KPC-3；d.金屬β-內(nèi)酰胺酶基因，包括VIM-1和NDM-1；

（3）臨床分離的同時攜帶包括NDM-1在內(nèi)的多種β-內(nèi)酰胺酶基因的大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌；

（4）MRSA

經(jīng)pH試紙測試，上述提取物pH值為中性。以苯/甲醇（4:1）作為展層劑，0.5M磷酸緩沖液（pH 7.0）處理過的新華3號濾紙條為載體對上述提取物進行紙層析，結果提示活性成分的Rf值在0.40-0.53之間。

本發(fā)明為研制新型抗菌藥物，特別是新型抗耐藥菌藥物提供了一株容易培養(yǎng)、發(fā)酵成本低的內(nèi)生真菌菌株，具有較高的開發(fā)價值和應用前景。

本發(fā)明工作得到了國家自然科學基金（No. 31300067）、江蘇省高校自然科學研究重大項目（No.15KJA180002）和江蘇省海洋生物技術重點實驗室開放課題項目（No. 2015HS003）的資助。

附圖說明

圖1 為菌株PF1167在PDA平板上的正面菌落形態(tài)照片。

圖2為菌株PF1167在PDA平板上的反面菌落形態(tài)照片。

圖3為菌株PF1167的產(chǎn)孢結構顯微照片（放大倍數(shù)：600倍）。

圖4為菌株PF1167的孢子形態(tài)顯微照片（放大倍數(shù)：600倍）。

圖5為基于菌株PF1167的ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖6為菌株PF1167代謝產(chǎn)物提取物活性成分的初步分離實驗結果照片。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步詳細描述本發(fā)明，但這些實施例僅是范例性的，本發(fā)明的保護范圍并不限于下述實施例。本領域的普通技術人員很容易根據(jù)本文說明對本發(fā)明進行復制或做出各種替換、修改或改變，這些復制、替換、修改或改變均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例1：內(nèi)生真菌菌株PF1167的分離、純化及保存。

實驗方法與步驟如下：

1. 樣本的采集：采集十大功勞健康葉片，立即帶回實驗室用于內(nèi)生真菌的分離。

2. 內(nèi)生真菌的分離：將采集的葉片于流水下沖洗，去除表面的灰塵，晾干后將葉片剪切成約0.5×0.5 cm大小的小方塊，按如下方法對其進行表面滅菌：先用70% 乙醇浸泡葉片小塊樣本l min，之后轉(zhuǎn)入稀釋40倍的84消毒液（愛特?；鶊F）中浸泡10 min，最后用無菌水沖洗3次（每次1 min）。將表面滅菌的葉片小塊接至含有PDA培養(yǎng)基的平板上，每一平板均勻放置5個小塊，將上述平板置于25 ℃下培養(yǎng)3 - 7天，每日觀察葉片邊緣是否有菌絲長出。

3. 內(nèi)生真菌的純化：葉片邊緣長出菌絲后，用無菌接種針切取大小為0.5 × 0.5 cm的菌餅（菌絲及其下方培養(yǎng)基）轉(zhuǎn)至新PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)3 - 7天，觀察菌落形態(tài)是否為純菌落。如不是純菌落，則從菌落邊緣切取大小為0.5 × 0.5 cm的菌餅，按上述方法繼續(xù)純化，直至獲得純菌落。

4. 內(nèi)生真菌的保藏：用無菌接種針從內(nèi)生真菌純菌落中切取5個大小為0.5 × 0.5 cm的菌餅，轉(zhuǎn)至滅菌的裝有石蠟油的冷凍管中，置于4 ℃冰箱中保存。

實施例2. 內(nèi)生真菌菌株PF1167的鑒定。

1. 形態(tài)學鑒定：將內(nèi)生真菌菌株PF1167接種至新PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃下培養(yǎng)7 - 30天，每日觀察菌落正反面特征。待其生成孢子后，取一張載玻片，在其中央滴一滴乳酚油（配方：加熱融化的苯酚20 mL；乳酸20 mL；甘油40 mL；水20 mL），挑取少許菌絲，置于乳酚油中，用接種針將菌絲撥散，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察其孢子及產(chǎn)孢結構形態(tài)特征，對照《真菌鑒定手冊》（魏景超 1979）及《Illustrated genera of imeprfect fungi》（Barnett HL，Hunter BB 1998）進行形態(tài)學鑒定。菌落正反面形態(tài)見附圖1、2，菌株孢子及產(chǎn)孢結構形態(tài)特征見附圖3、4。根據(jù)其形態(tài)學特征，鑒定為：Fusarium屬菌種。

2. ITS序列分析：

a)實驗所用的緩沖液的配制方法：

（1）1M Tris-HCl (pH 8.0) 緩沖液

稱取12.11 g 三羥甲基氨基甲烷（Tris）放于燒杯中，加入約80 mL的去離子水，充分攪拌使其溶解。用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，再將溶液定容至100 mL。高溫高壓滅菌后，于室溫保存。

（2）0.1M EDTA緩沖液（pH 8.0）

稱取3.72g 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉）放于燒杯中，加入約80 ml去離子水中，充分攪拌使其溶解，調(diào)節(jié)pH至8.0，再將溶液定容至100 mL。高溫高壓滅菌后，于室溫保存。

（3）10×TE 緩沖液配方

Tris-Cl緩沖液（pH 8.0） 100 mM/L

EDTA緩沖液（pH 8.0） 10 mM /L

調(diào)節(jié)酸堿度至所需pH值，分裝后高壓蒸汽滅菌20 min，置于冰箱中保存?zhèn)溆?，用時將其稀釋10倍。

（4）10% SDS溶液

稱取10 g 十二烷基磺酸鈉（SDS），溶于100 ml去離子水中，混勻備用。

（5）溴化乙錠（EB）溶液 (10 mg/mL)

在100 mL去離子水中溶解1 g EB。磁力攪拌數(shù)小時，以確保其完全溶解，然后用鋁箔紙包裹容器或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫保存。

b)菌株PF1167基因組總DNA的提?。簩⒃赑DA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的內(nèi)生真菌PF1167的菌絲從平板上小心刮取下來，用氯化芐法提取菌株基因組總DNA。步驟如下：①將菌絲放入1.5 ml 塑料小管中，加入450 μl TE緩沖液（pH 9.0），充分振蕩混勻后加入150 μL 10％ SDS緩沖液和450 μL氯化芐。②振蕩混勻后50 ℃水浴1 h，期間每隔10 min振蕩混合一次。③取出小管，13000 r/min離心10 min。離心完成后吸取上清液至一新小管中。④加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（體積比為25:24:1）混合液，反復振蕩混勻后13000 r/min離心10 min，離心結束后吸取上清液至一新管中，重復此步驟一次。向取出的上清液中加入氯仿/異戊醇（體積比為24:1）混合液，反復振蕩后13000 r/min離心10 min，吸出上清液轉(zhuǎn)移至新小管。⑤加入1/10體積的醋酸鉀溶液（5 M），再加入等體積的異丙醇后于-20 ℃過夜（或室溫靜置30min）。⑥取出上述小管，13000 r/min離心10 min，輕輕倒掉上清液，將離心管口放在衛(wèi)生紙上吸取殘留水分，保留沉淀部分。向含沉淀的小管中加入1 ml 70%乙醇，渦旋震蕩，13000 r/min離心10 min，離心后小心倒掉小管中的乙醇，再重復此步驟2次。⑦將小管置于金屬浴中，50 ℃烘干乙醇（不可殘留任何乙醇），將沉淀溶于30 μl TE緩沖液（pH7.4）中，于-20 ℃保存、備用。

c)菌株PF1167的ITS序列擴增：采用真菌通用引物ITS1/TIS4及DreamTaq Green PCR Master Mix(Thermo Scientific)進行其ITS序列的PCR擴增，引物序列分別為：

ITS1(5'to3')：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；

TIS4(5'to3')：TCCTCCGCTTATTGATATGC

反應體系如下：

PCR的反應程序如下：95℃預變性5min，依次進入：95℃變性20s，45℃退火30s，68℃延伸1min；95℃變性20s，50℃退火30s，68℃延伸1min，然后開始進入循環(huán)：95℃變性20s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后68℃延伸10min。

d)PCR反應產(chǎn)物的確認：配置1% 瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物和GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder各5 μl上樣，在110v、160mA條件下電泳30 min。電泳結束后將凝膠置于EB溶液（0.5 μg/ml）中染色30 min，然后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶。如出現(xiàn)500 bp - 700 bp條帶，則初步判斷擴增成功。

e)PCR反應產(chǎn)物的測序：將PCR產(chǎn)物送生工生物工程上海（股份）有限公司進行測序。

f) 數(shù)據(jù)分析：將菌株PF1167的ITS序列在NCBI網(wǎng)頁（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行在線比對分析（blastn），找到與其最相似的已知序列。用軟件MEGA 6.0對目的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，用鄰位連接法（Neighbor-Joining， NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹的評估用Bootstrap檢驗，共進行1000 次重復。系統(tǒng)發(fā)育樹見附圖5，結果表明所測序列與一株Fusariumsp.的ITS序列（登錄號：KM513579.1）相似度達99%。系統(tǒng)進化樹結果表明，該菌株與上述Fusariumsp.聚類于同一末端分支。

根據(jù)ITS序列分析，鑒定該菌株為：Fusarium屬菌種，與形態(tài)學鑒定結果一致。結合兩種鑒定結果，該菌株鑒定為Fusariumsp.，本株定名為Fusariumsp.PF1167。

實施例3. 內(nèi)生真菌PF1167代謝產(chǎn)物的體外抑菌實驗。

一、實驗方法（微量肉湯二倍稀釋法）

1)涉及的細菌菌種：① 20種攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌或肺炎克雷伯菌菌株；② 3種攜帶NDM-1等多種β-內(nèi)酰胺酶基因的臨床分離菌株；③MRSA；④ 野生型大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌。

2) 菌種的活化：將各菌種從-80 oC冰箱中取出，分別劃線接種于Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基平板上。其中對于攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因重組質(zhì)粒的菌株，所用的培養(yǎng)基中含有相應的抗生素，所含抗生素的類別與濃度與其質(zhì)粒選擇標記一致，具體見表1。對于攜帶NDM-1等多種β-內(nèi)酰胺酶基因的臨床分離菌株，所用培養(yǎng)基含終濃度為100 μg/ml的氨芐青霉素。將各平板置于37 oC培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

3) 菌液的配制：從上述各LB平板上分別挑取單菌落至含LB液體培養(yǎng)基的試管中。其中，對于攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因重組質(zhì)粒的菌株，所用的培養(yǎng)基中含有相應的抗生素，所含抗生素的類別與濃度與其質(zhì)粒選擇標記一致，具體見表1；對于攜帶NDM-1等多種β-內(nèi)酰胺酶基因的臨床分離菌株，所用培養(yǎng)基含終濃度為100 μg/ml的氨芐青霉素。將各試管置于搖床上，于37 oC下振蕩培養(yǎng)，每隔一段時間取出少量菌液用酶標儀測定其在波長600 nm處的光密度 (optical density，OD₆₀₀) 值，當菌液OD₆₀₀ 值為1時取出菌液，用LB培養(yǎng)液稀釋5,000倍，備用。

4) 提取物的制備：將菌株PF1167接種于含20 ml馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于25 ℃下靜置培養(yǎng)21天，將培養(yǎng)物過濾，得上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮。向濃縮液中加入3倍體積的無水乙醇，充分震蕩后過濾，得上清液。將上清液濃縮干燥，獲得粗提物。準確稱量粗提物，將其溶于無菌水中，配成100 mg/ml的溶液，然后依次2倍稀釋，配成系列梯度溶液，最低濃度至0.1 mg/ml。配制溶液的過程中，所用的移液器吸頭及塑料小管均在滅菌后使用。用pH試紙測試提取物的酸堿度。

5) 抑菌實驗：在無菌96-孔板的各孔中分別加入10 μL各濃度提取物溶液和90 μL稀釋后的菌液，混勻。另取3個孔分別加入10 μL無菌水和90 μL稀釋后的菌液作為對照，立即測定各孔菌液OD₆₀₀值。將96-孔板置于37 oC下恒溫培養(yǎng)18~20 h，然后再次測定各孔菌液OD₆₀₀值。根據(jù)每個孔菌液OD₆₀₀值的變化計算提取物的抑菌率。抑菌率的計算公式如下：

抑制率(%)= [1- (樣品OD₆₀₀增加量/對照OD₆₀₀增加量)]×100

以抑菌率等于或超過90%時的提取物濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。上述實驗重復3次，根據(jù)實驗結果確定提取物的MIC。用同樣的方法選測不同抗生素對上述細菌菌株的MIC。

二、實驗結果：

1.提取物的pH 值

經(jīng)測試，提取液pH值為中性。

2.提取物對攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因重組質(zhì)粒的菌株的抑制作用

提取物對測試的20種攜帶臨床危害嚴重的β-內(nèi)酰胺酶基因的菌株均有抑制作用，對其中18株細菌的MIC等于或低于2.5mg/ml，對另外2株細菌（A10和A11）的MIC為5mg/ml（表1）。氨芐青霉素（ampicillin，簡寫為AMP）、卡那霉素（kanamycin，簡寫為KAN）及慶大霉素（gentamicin，簡寫為GM）對上述菌株的抑菌實驗結果證明測試菌株含有正確的重組質(zhì)粒，同時表明上述菌株普遍對AMP具有耐受性，有些菌株對KAN或GM也有不同程度的耐受性（表1）。

表1提取物對攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因重組質(zhì)粒的菌株的抑制作用

注：“-”表示測試濃度范圍內(nèi)(0.1-100μg/ml)無抑菌作用。

3.提取物對攜帶NDM-1等多種β-內(nèi)酰胺酶基因的臨床分離菌株的抑制作用

我們測試了提取物及AMP、KAN、GM、頭孢他啶（ceftazidime，簡寫為CAZ）、美羅培南（meropenem，簡寫為MEM）和替加環(huán)素（tigecycline，簡寫為TGC）等6種抗生素對3種臨床分離菌株的MIC，結果表明：三種臨床分離菌株具有很強的耐藥性，其中18H3和18H4能夠耐受所有測試的抗生素，18H2能夠耐受除替加環(huán)素外的所有測試抗生素。對于上述耐藥菌，菌株PF1167代謝產(chǎn)物提取物均具有抑制作用（表2）。

表2提取物對攜帶多種β-內(nèi)酰胺酶基因的臨床分離菌株的MIC(μg/ml)

注:“-”表示測試濃度范圍內(nèi)(0.1-100μg/ml)無抑菌作用。

4.提取物對MRSA及野生型金黃色葡萄球菌、枯草桿菌及大腸桿菌的抑制作用。

提取物對MRSA及野生型金黃色葡萄球菌、枯草桿菌及大腸桿菌均有抑制作用，其中對MRSA的抑制作用略低于野生型金黃色葡萄球菌。作為對照，我們同時測定了AMP對上述菌株的抑菌活性，從表3可以看出，AMP對野生型金黃色葡萄球菌、枯草桿菌及大腸桿菌的具有較強的抑制作用，但MRSA對AMP不敏感。

表3提取物對MRSA及野生型金黃色葡萄球菌、枯草桿菌及大腸桿菌的MIC

注:“-”表示測試濃度范圍內(nèi)(0.1-100μg/ml)無抑菌作用。

實施例4 菌株PF1167代謝產(chǎn)物提取物活性成分的初步分離實驗。

1.實驗方法：

剪取新華3號濾紙條（1.5×17 cm），用0.5 M磷酸緩沖液（pH 7.0）處理后晾干，將菌株PF1167代謝產(chǎn)物提取液（100 mg/ml）點樣于濾紙條上，點樣量為80 ul，用展層劑苯/甲醇（4:1）展開，當展層劑遷移至距原點15 cm處取出，將濾紙剪成3段（每段5 cm），分別貼于涂布有A20菌液的LB平板上，置于37 ℃培養(yǎng)過夜后觀察抑菌圈位置。

2. 實驗結果：

實驗結果如圖6所示，可見抑菌圈位于距原點6-8 cm處，提示提取液有效成分在上述條件下的Rf值在0.40-0.53之間。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇師范大學

<120> 一種內(nèi)生真菌菌株及其代謝產(chǎn)物提取方法和用途

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 529

<212> DNA

<213> Fusarium sp.PF1167

<400> 1

gggctagggc ttcactccca acccctgtga cataccaatt gttgcctcgg cggatcagcc 60

cgctcccggt aaaacgggac ggcccgccag aggaccccta aactctgttt ctatatgtaa 120

cttctgagta aaaccataaa taaatcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca 180

tcgatgaaga acgcagcaaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat 240

cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca gtattctggc gggcatgcct gttcgagcgt 300

catttcaacc ctcaagccct cgggtttggt gttggggatc ggcgagccct tgcggcaagc 360

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