本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物能源領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)淀粉和油脂的單針藻及其培養(yǎng)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由于世界石油資源的枯竭和價(jià)格逐漸走高、環(huán)保問題日益嚴(yán)峻，以及全球氣候變化引發(fā)一系列的影響，20世紀(jì)70年代以來，許多國(guó)家日益重視生物能源和生物基化學(xué)品的發(fā)展。在眾多的生物質(zhì)能和生物質(zhì)化學(xué)品中，微藻憑借其“不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”的優(yōu)勢(shì)得到了越來越多的關(guān)注。藻類是最原始的生物之一，分布很廣，大多數(shù)藻類生活在水中，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有光合效率高、生長(zhǎng)周期短和速度快等特點(diǎn)。藻類包括微藻（單細(xì)胞真核生物）、大型藻（海藻）和藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)綠藻）。不同藻類可通過光合作用將CO2和水轉(zhuǎn)化為O2和大分子有機(jī)物，如碳水化合物和油脂。微藻可以利用廢水中N、P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而降低水體的富營(yíng)養(yǎng)化，節(jié)約水資源和營(yíng)養(yǎng)鹽成本。因此，利用非糧且可再生的微藻為原料生產(chǎn)能源和化學(xué)品，與其它生物質(zhì)相比，一定程度上能夠降低成本，同時(shí)也為微藻下游產(chǎn)品的開發(fā)提供了一個(gè)新的途徑。單針藻是綠藻的一種，為不規(guī)則的紡錘形，目前發(fā)現(xiàn)的單針藻僅用于積累油脂。CN103540533A公開了一種產(chǎn)油單針藻LB59的獲得及應(yīng)用，自野外環(huán)境分離獲得，能夠耐受高濃度碳酸氫鈉，易于進(jìn)行開放式培養(yǎng)，富含油脂，油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重的30.2%。CN103555584A公開了一種產(chǎn)油單針藻LB50的獲得及應(yīng)用，能夠耐受高濃度碳酸氫鈉，油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重的30.4%。CN104073437A公開了一種單針藻C29，其生長(zhǎng)速度快，油脂產(chǎn)率高，是生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良菌株；該發(fā)明還提供了一種單針藻的開放式養(yǎng)方法，此方法采用特定培養(yǎng)基培養(yǎng)，更利于單針藻C29的生長(zhǎng)及油脂的積累。CN104611228A公開了一種富含油脂的單針藻（Monoraphidiumsp）SS-B1及其培養(yǎng)應(yīng)用，保藏編號(hào)為CGMCCNo.7479，該藻株能夠耐受高濃度的CO2和SO2，可以利用含CO2和SO2的廢氣或煙氣進(jìn)行光照自養(yǎng)生長(zhǎng)獲取富含油脂的生物質(zhì)，固碳效率高，細(xì)胞總脂含量占細(xì)胞干重的40%以上，能夠進(jìn)行生物柴油的生產(chǎn)。但是，上述單針藻僅用于生產(chǎn)油脂，產(chǎn)品單一，應(yīng)用范圍窄。目前還沒有發(fā)現(xiàn)既可以高產(chǎn)淀粉又可以高產(chǎn)油脂的單針藻。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有單針藻產(chǎn)品單一，應(yīng)用范圍窄的不足，本發(fā)明提供一種高產(chǎn)淀粉和油脂的單針藻及其培養(yǎng)應(yīng)用。該藻株在適宜條件下既可以高產(chǎn)淀粉又可以高產(chǎn)油脂，可以滿足下游生產(chǎn)的不同需求，拓寬其應(yīng)用范圍。本發(fā)明高產(chǎn)淀粉和油脂的單針藻SS-06，其分類命名為單針藻（Monoraphidiumsp.），已于2015年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.10765。本發(fā)明提供的單針藻SS-06在顯微鏡下藻細(xì)胞呈紡錘形，綠色，短軸2-4微米，長(zhǎng)軸55-65微米。本發(fā)明提供的單針藻SS-06的18SrDNA基因測(cè)序分析結(jié)果見序列表。根據(jù)序列比對(duì)，本發(fā)明的單針藻SS-06與已公布的單針藻的18SrDNA數(shù)據(jù)存在差異。本發(fā)明所述單針藻SS-06的培養(yǎng)方法，采用的培養(yǎng)基可以是BG11、SE、TAP或D1等淡水微藻培養(yǎng)基，通氣量0.1-1.0vvm，CO2含量為1v%-3v%，光照強(qiáng)度為1000-10000lux，光暗比為10:14-14:10，溫度為15-35℃，pH6-11。培養(yǎng)結(jié)束后，收獲藻細(xì)胞，測(cè)定其蛋白含量為20%-30%，脂質(zhì)含量為20%-30%，淀粉含量為10%-30%。本發(fā)明提供的單針藻SS-06在產(chǎn)淀粉中的應(yīng)用。在富含N元素的微藻培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，通氣量0.1-1.0vvm，CO2含量為1v%-3v%，光照強(qiáng)度5000-10000lux，光暗比10:14-14:10，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，更換低N微藻培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中添加0-50mmol/L的3-磷酸甘油酸，連續(xù)光照培養(yǎng)至穩(wěn)定期。通過上述培養(yǎng)，有助于加速微藻對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和快速增殖，同時(shí)也有助于提高藻細(xì)胞中的淀粉含量。本發(fā)明提供的單針藻SS-06在產(chǎn)油脂中的應(yīng)用。在富含N元素的微藻培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，通氣量0.1-1.0vvm，CO2含量為1v%-3v%，光照強(qiáng)度5000-10000lux，光暗比10:14-14:10，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，更換低N微藻培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中添加0-10mmol/L的焦磷酸鈉，連續(xù)光照培養(yǎng)至穩(wěn)定期。通過上述培養(yǎng)，有助于加速微藻對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和快速增殖，同時(shí)也有助于提高藻細(xì)胞中的油脂含量。本發(fā)明所述的富含N元素的微藻培養(yǎng)基是指在常規(guī)微藻培養(yǎng)基中加入過量無機(jī)氮，加入量為2.0-5.0g/L。所述低N微藻培養(yǎng)基是指在常規(guī)微藻培養(yǎng)基中加入微量無機(jī)氮，加入量為0-0.5g/L。所述的無機(jī)氮是NaNO3、NH4NO3、NH4Cl等中的一種或幾種，優(yōu)選為NaNO3。與現(xiàn)有單針藻相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明提供的單針藻SS-06在適宜條件下既可以高產(chǎn)淀粉又可以高產(chǎn)油脂，可以滿足下游生產(chǎn)的不同需求，拓寬其應(yīng)用范圍。2、本發(fā)明選育的單針藻SS-06應(yīng)用潛力好，環(huán)境適應(yīng)性較廣，適合培養(yǎng)溫度和pH范圍較廣，分別是15-35℃（常見微藻培養(yǎng)溫度為20-30℃）和pH為6-11（常見微藻pH為7-9）。3、本發(fā)明提供的單針藻SS-06產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，在普通培養(yǎng)條件下，蛋白含量為20-30%，油脂含量為20-30%，淀粉含量為10-30%。可根據(jù)不同需求改變培養(yǎng)條件，從而獲得高產(chǎn)量的油脂或淀粉。生物材料保藏說明本發(fā)明提供的單針藻（Monoraphidiumsp.）SS-06，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏編號(hào)：CGMCCNo.10765；保藏日期：2015年4月24日。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不因此限制本發(fā)明。本發(fā)明中，v%為體積分?jǐn)?shù)。實(shí)施例1分離篩選獲得單針藻SS-06（1）富集培養(yǎng)：2011年10月從黑龍江杜博爾特蒙古族自治縣壽山休閑度假村龍虎湖采集水樣，采用紗布過濾后，將100mL水樣接種到200mL的BG11培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為7000lux，溫度為25℃，光暗周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，培養(yǎng)約半個(gè)月后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)明顯綠色，顯微鏡觀察到大量藻體存在。所述BG11培養(yǎng)基的配方見表1、表2。表1BG11培養(yǎng)基*表2表1中A5+Cosolution的組成（2）純?cè)逯甑墨@得：將富集培養(yǎng)的水樣稀釋至10-5倍，在無菌條件下涂布到BG11固體平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為7000lux，溫度為25℃，培養(yǎng)約10天后平板上出現(xiàn)綠色的單藻落，挑取單藻落在搖瓶上培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后，顯微鏡觀察確定是否為純?cè)宸N，若不是純種，重復(fù)上述步驟，直到確定為純培養(yǎng)藻株為止。經(jīng)過反復(fù)培養(yǎng)，獲得單藻落。（3）目的藻株的獲得：對(duì)獲得的單藻落挑取到50mL搖瓶中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)光照強(qiáng)度為7000lux，溫度為25℃，光暗周期為24小時(shí)，光暗時(shí)間比為14:10，每天搖動(dòng)至少3次，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以5v%的接種量接種到管式光照反應(yīng)器中，培養(yǎng)光照強(qiáng)度為7000lux，通入CO23v%（v/v），連續(xù)光照。對(duì)藻株進(jìn)行溫度和pH馴化，先從15℃開始馴化，以5℃為一個(gè)溫度梯度，同時(shí)提高培養(yǎng)基中的pH，從pH6.0開始，以pH1為一個(gè)梯度，馴化周期為3-5d；當(dāng)微藻穩(wěn)定后再同時(shí)提高溫度和pH，如此反復(fù)，當(dāng)微藻減少時(shí),降低溫度和pH，延長(zhǎng)馴化周期，直至微藻明顯減少，馴化停止，取部分液體在BG11平板上進(jìn)行劃線，從而獲得目標(biāo)藻株SS-06。實(shí)施例2藻株的鑒定將獲得的SS-06藻細(xì)胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18SrDNA基因克隆，將得到的3個(gè)陽性克隆送至上海生工公司測(cè)序。18SrDNA基因測(cè)序分析結(jié)果見序列表。將18SrDNA序列登錄到Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示與Monoraphidiumsp.有最大的相似性，其BLASTn值為2591，Maxindex值為99%，可以確定SS-06為單針藻（Monoraphidiumsp.）。實(shí)施例3單針藻SS-06的培養(yǎng)應(yīng)用單針藻SS-06在管式光照反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度15℃，pH6.0，光照強(qiáng)度為5000lux，通氣量0.25vvm，CO2含量為3v%，連續(xù)光照培養(yǎng)7天后，離心收集藻液，冷凍干燥后測(cè)得微藻生物量為2.0g/L，蛋白含量為20%，油脂含量22%，淀粉含量11%。其中蛋白質(zhì)檢測(cè)方法為Bradford法測(cè)定。油脂檢測(cè)方法為稱量干燥的藻粉，重量計(jì)為m，放入瓷研缽中，加入適量石英砂和液氮，待液氮揮發(fā)后，研磨破壁；加入10mL乙酸乙酯:正己烷=1:1的混合有機(jī)溶劑，超聲清洗儀處理20min，50-60℃恒溫水浴中提取45分鐘；離心15分鐘，收集上清液至離心管中，重復(fù)提取兩次，合并提取液；向提取液中加入等體積的蒸餾水，震蕩混勻后離心4分鐘，收集上層有機(jī)相至已烘干并準(zhǔn)確稱量?jī)糁兀ㄓ?jì)為W1）的試管中；70-80℃水浴蒸發(fā)試管中的溶劑1.5h，70-80℃烘箱烘干至恒重，計(jì)為W2。計(jì)算藻細(xì)胞的總脂含量C（%）：C=100×(W2-W1)/m。淀粉檢測(cè)方法取藻粉（W）經(jīng)600W超聲破碎，超聲時(shí)間1s，間歇時(shí)間2s，超聲60次，得到完全破碎的藻液；調(diào)節(jié)pH到6.5，分別加入0.20μlLiquozymeSupra85-95℃保溫液化1h；調(diào)節(jié)pH到4.5，分別加入0.4μlDextrozymeDX60℃保溫液化10h，水解完全后離心棄沉淀，上清液定容100mL，檢測(cè)水解液中葡萄糖含量C；以去離子水加等量酶水解為對(duì)照；淀粉含量(g/g)=C(g/L)×V(L)×0.9/W(g)。實(shí)施例4單針藻SS-06在生產(chǎn)淀粉中的應(yīng)用挑取平板單藻落在50mL搖瓶中光照培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以5v%接種到富含N元素的微藻培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通氣量0.25vvm，CO2含量為1v%-3v%，光照強(qiáng)度5000-10000lux，光暗比14:10，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，更換無氮微藻培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中添加20mmol/L的3-磷酸甘油酸，連續(xù)光照培養(yǎng)至穩(wěn)定期。所述的富含N元素的微藻培養(yǎng)基是指在BG11培養(yǎng)基中加入3.0g/LNaNO3；無N微藻培養(yǎng)基是指采用常規(guī)的BG11培養(yǎng)基。表3不同培養(yǎng)條件下淀粉含量序號(hào)CO2含量光照強(qiáng)度/lux光暗比溫度/℃pH淀粉產(chǎn)量/%占細(xì)胞干重11v%500014:1015615.322v%850014:1025829.533v%1000014:10351120.1實(shí)施例5單針藻SS-06在生產(chǎn)油脂中的應(yīng)用挑取平板單藻落在50mL搖瓶中光照培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以5v%接種到富含N元素的微藻培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通氣量0.25vvm，CO2含量為1v%-3v%，光照強(qiáng)度5000-10000lux，光暗比14:10，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，更換低氮微藻培養(yǎng)基；并在培養(yǎng)基中添加3mmol/L的焦磷酸鈉，連續(xù)光照培養(yǎng)至穩(wěn)定期。所述的富含N元素的微藻培養(yǎng)基是指在BG11培養(yǎng)基中加入3g/LNaNO3；低N微藻培養(yǎng)基是指在BG11培養(yǎng)基中加入0.2g/LNaNO3。表4不同培養(yǎng)條件下油脂含量表序號(hào)CO2含量光照強(qiáng)度/lux光暗比溫度/℃pH油脂產(chǎn)量/%占細(xì)胞干重11v%500014:1015628.722v%700014:1025832.533v%900014:10351127.4綜上可知，本發(fā)明篩選的單針藻SS-06可根據(jù)不同需求改變培養(yǎng)條件，從而獲得高產(chǎn)量的油脂或淀粉。SEQUENCELISTING<110>中國(guó)石油化工股份有限公司中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院<120>一株高產(chǎn)淀粉和油脂的單針藻及其培養(yǎng)應(yīng)用<130>新專利申請(qǐng)<170>PatentInversion3.5<211>1418<212>DNA<213>Monoraphidiumsp.<400>1gtagtcatatgcttgtctcaaagattaagccatgcatgtctaagtataaactgcttatac60tgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatagtttatttgatggtacctctacacg120gataaccgtagtaattctagagctaatacgtgcgtaaatcccgacttctggaagggacgt180atttattagataaaaggccgaccgagctttgctcgacccgcggtgaatcatgataacttc240acgaatcgcatagccttgtgctggcgatgtttcattcaaatttctgccctatcaactttc300gatggtaggatagaggcctaccatggtggtaacgggtgacggaggattagggttcgattc360cggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaatta420cccaatcctgatacggggaggtagtgacaataaataacaataccgggcatttaatgtctg480gtaattggaatgagtacaatctaaatcccttaacgaggatcaattggagggcaagtctgg540tgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatatctaagttgttgcagttaaaa600agctcgtagttggatttcgggtgggttccagcggtccgcctatggtgagtactgctgtgg660ccctcctttttgtcggggacgggctcctgggcttcattgtccgggactcggagtcgacga720tgatactttgagtaaattagagtgttcaaagcaagcctacgctctgaatactttagcatg780gaatatcgcgataggactctggcctatctcgttggtctgtaggaccggagtaatgattaa840gagggacagtcgggggcattcgtatttcattgtcagaggtgaaattcttggatttatgaa900agacgaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaagaacgaaagttg960ggggctcgaagacgattagataccgtcgaagtctcaaccataaacgatgccgactaggga1020ttggaggatgttcttttgatgacttctccagcaccttatgagaaatcaaagtttttgggt1080tccggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccacca1140ggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaacttaccaggtccagacata1200gtgaggattgacagattgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgtt1260cttagttggtgggttgccttgtcaggttgattccggtaacgaacgagacctcagcctgct1320aaatatgtcacattcgctttttgcggatggccgacttcttagagggactattggcgttta1380gtcaatggaagtatgaggcaataacaggtctgtgatgc1418當(dāng)前第1頁1 2 3