本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種耐受高PH的凱氏擬小球藻及其培養(yǎng)應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，大量的化石能源的使用和消耗，導(dǎo)致能源的短缺和環(huán)境的日益惡化，特別是CO₂的急劇增加引起的溫室效應(yīng)越來(lái)越嚴(yán)重，微藻的生長(zhǎng)周期短、光合效率高，CO₂固定效率高，一定條件下可達(dá)陸生植物的10 倍以上，不僅可以減少CO₂排放，同時(shí)也降低了培養(yǎng)成本；除CO₂外，廢氣中的一些SOx、NOx 等成分也隨著微藻的代謝被凈化處理，有效減少有害氣體排放，因此利用微藻油脂作為原料生產(chǎn)的生物柴油是目前最有可能滿足世界運(yùn)輸所需燃料的可再生能源。

目前對(duì)于小球藻、柵藻等產(chǎn)油微藻研究的較多。CN20110144545.6公開了一株?yáng)旁逶逯辏撛逯甑纳L(zhǎng)可利用人工培養(yǎng)基或經(jīng)適當(dāng)處理的廢水生長(zhǎng)，其特點(diǎn)是油脂產(chǎn)率高于目前大多數(shù)分藻株，該藻株應(yīng)用領(lǐng)域包括CO₂的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質(zhì)、色素、淀粉、多糖、核酸的生產(chǎn)。CN20120154470.4公開了一株富油海洋微藻微擬球藻( Nannochloropsis gaditana )藻株及其應(yīng)用，該藻株可在pH=4.5的環(huán)境下正常生長(zhǎng)，其油脂含量可達(dá)35%。CN20111019480.X公開了一株微藻藻株（Mychonases sp .）及其用于生產(chǎn)生物柴油的應(yīng)用，利用該藻株可生產(chǎn)高附加值的多不飽和脂肪酸，包括亞麻酸 C18:3和神經(jīng)酸C24:1，其在獲得生物柴油的同時(shí)，獲得高附加值的副產(chǎn)品。CN102703326A公開了一種高CO₂耐受性和固定率的微藻及其選育方法，但該專利所提供的藻株并未涉及該藻株的油脂含量。上述專利要么不能高效利用CO₂生產(chǎn)油脂，要么獲得的生物質(zhì)中油脂含量不夠高。特別是在實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)環(huán)境中CO₂體積分?jǐn)?shù)大于5v%時(shí)，大部分微藻的生長(zhǎng)將受到抑制，固碳效率低；同時(shí)一般微藻在中性條件下適宜生長(zhǎng)，在偏酸性或者偏堿性的條件下不利于微藻的生長(zhǎng)，而微藻利用CO₂一般是以溶解在水中的HCO₃^-離子形式存在的，二氧化碳在中性環(huán)境下溶解度低，不利于藻類吸收利用。

擬小球藻屬是由Krienitz, et al.提出的一個(gè)新的屬，他通過(guò)對(duì)小球藻屬的凱氏小球藻科核糖體小亞基團(tuán)（SSU rDNA）進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，提出將小球藻屬中的凱氏小球藻（C. kessleri）劃分到小球藻屬，改名為凱氏擬小球藻，與擬小球藻（P. beijerinckii）、胡斯擬小球藻（P.hussii）共同構(gòu)成了一個(gè)新屬擬小球藻屬。擬小球藻屬與小球藻屬之間的形態(tài)極為相似，僅在細(xì)胞壁的超微結(jié)構(gòu)方面有細(xì)微差異，與小球藻屬相比，凱氏擬小球藻細(xì)胞壁的電子透明度較低。但在18S rDNA及ITS序列上差異明顯。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于凱氏擬小球藻的報(bào)道比較少，江麗麗等人在（一株產(chǎn)油微藻的篩選及分子鑒定，水生生物學(xué)報(bào)，2013年第4期 606-612頁(yè)）報(bào)道一株產(chǎn)油微藻HY-6，為球狀單細(xì)胞，具有1個(gè)明顯的蛋白核，杯狀色素體周生，從而初步判斷該藻株可能屬于小球藻屬（Chlorella）或擬小球藻屬（Parachlorella）；18S rDNA及ITS系統(tǒng)學(xué)分析表明HY-6與小球藻屬分為兩個(gè)不同的進(jìn)化支，但與凱氏擬小球藻（Parachlorella kessleri）的親緣關(guān)系較近，且具有較高的自展支持率，因此將其鑒定為凱氏擬小球藻（P.kessleri），總脂單位體積產(chǎn)率最高達(dá)50.8mg/(L.d)，是一株具有潛力的產(chǎn)油微藻。但是，該凱氏擬小球藻只適合在中性PH下生長(zhǎng)，并未涉及該凱氏小球藻耐受高PH的能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種耐受高PH的凱氏擬小球藻及其培養(yǎng)應(yīng)用。本發(fā)明選育的凱氏擬小球藻在高PH值下能夠更好的吸收利用二氧化碳，快速生長(zhǎng)繁殖，解決了現(xiàn)有凱氏擬小球藻只能在中性PH下生長(zhǎng)，而中性PH條件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的問(wèn)題。

本發(fā)明耐受高PH的凱氏擬小球藻，為凱氏擬小球藻突變株FSH-Y3，其分類命名為Parachlorella kessleri，已于2014年5月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9238。

本發(fā)明提供的凱氏擬小球藻FSH-Y3在顯微鏡下藻細(xì)胞為球形、橢圓形，內(nèi)有一個(gè)周生、杯狀或片狀的色素體；無(wú)性繁殖，每個(gè)細(xì)胞可以產(chǎn)生2、4、8或16個(gè)似親孢子，成熟時(shí)母細(xì)胞破裂，孢子逸出，長(zhǎng)大后即為新個(gè)體。

本發(fā)明提供的凱氏擬小球藻FSH-Y3可以耐受的PH值為10～12，在此PH值條件下的生長(zhǎng)速率比原始凱氏擬小球藻快2～5倍。

本發(fā)明提供的凱氏擬小球藻FSH-Y3藻株的18S rDNA基因測(cè)序分析結(jié)果見序列表。根據(jù)序列比對(duì)，本發(fā)明FSH-Y3藻株與已公布的擬小球藻藻株的18S rDNA數(shù)據(jù)存在差異。

本發(fā)明提供的凱氏擬小球藻FSH-Y3，在高PH生長(zhǎng)時(shí)能增加二氧化碳的溶解度，增加擬小球藻光合作用中對(duì)二氧化碳的固定，對(duì)二氧化碳的減排有顯著作用。凱氏擬小球藻的生長(zhǎng)需要吸收二氧化碳，一般來(lái)說(shuō)，二氧化碳的溶解性與溶液的酸堿性有一定的關(guān)系，二氧化碳在堿性溶液中溶解度顯著升高。因此，所獲得凱氏擬小球藻FSH-Y3可耐受高PH值的環(huán)境，而在高PH值環(huán)境下可以溶解更多的二氧化碳，提高了藻株對(duì)二氧化碳的固定效率，對(duì)控制二氧化碳污染的溫室效應(yīng)具有重要意義。

本發(fā)明耐受高PH的凱氏擬小球藻的選育方法，包括以下內(nèi)容：

（1）配制凱氏擬小球藻生長(zhǎng)的BG11培養(yǎng)基；

（2）接種原始凱氏擬小球藻，經(jīng)光照和黑暗周期誘導(dǎo)，對(duì)原始凱氏擬小球藻進(jìn)行活化；

（3）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的凱氏擬小球藻進(jìn)行紫外誘變，然后進(jìn)行暗培養(yǎng)；

（4）將暗培養(yǎng)后的藻液用新鮮培養(yǎng)液稀釋后涂布到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行光照培養(yǎng)；

（5）挑取生長(zhǎng)迅速的單藻落接種到BG11培養(yǎng)液中進(jìn)行初篩，培養(yǎng)液的PH為8.0～9.0；

（6）將步驟（5）初篩的藻液，接種到逐級(jí)提高PH的培養(yǎng)液中進(jìn)行馴化培養(yǎng)，每次PH提高0.5～1.0，篩選獲得耐受高PH的藻株。

在步驟（1）中，將配制好的BG11培養(yǎng)基分裝在50～250mL的錐形瓶中，每瓶裝液量為20～100mL，用透氣膜封口，包上牛皮紙。將上述培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，在溫度121℃，壓力0.1MPa下滅菌20～30分鐘。

在步驟（2）中，按接種液與培養(yǎng)液的體積比為1:10～1:5接種，操作在無(wú)菌間進(jìn)行，接種后將培養(yǎng)液搖勻，用透氣膜包好。所述的光照和黑暗周期誘導(dǎo)是在22～32℃的恒溫光照反應(yīng)搖床中進(jìn)行，光暗反應(yīng)周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10；搖床轉(zhuǎn)速為80～160rpm，培養(yǎng)4～7天，獲得活化的原始凱氏擬小球藻藻液。

在步驟（3）中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液5～10mL置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行紫外誘變，藻液在培養(yǎng)皿底面鋪一薄層，培養(yǎng)皿放在無(wú)菌的暗室中，打開皿蓋。在磁力攪拌下，用30w的紫外燈照射誘變，照射時(shí)間為10～20min，紫外燈與培養(yǎng)皿的距離為15～25cm，照射致死率為60%～80%。照射后蓋上皿蓋，用不透光的紙包好培養(yǎng)皿進(jìn)行暗培養(yǎng)，暗反應(yīng)的培養(yǎng)溫度為20～30℃，培養(yǎng)時(shí)間為24～72h。

在步驟（4）中，將步驟（3）暗反應(yīng)后的藻液用BG11新鮮培養(yǎng)基稀釋10～10000倍，吸取0.1～0.3mL涂布到BG11固體瓊脂平板（瓊脂含量為1%～2%）上。在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～30℃，光照強(qiáng)度為1000～5000Lux，光暗反應(yīng)周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，培養(yǎng)時(shí)間為10～15d。挑選在平板上長(zhǎng)得比較大、顏色比較深、生長(zhǎng)迅速的單藻落進(jìn)行篩選。

在步驟（5）中，在恒溫光照搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為60～180rpm，光照強(qiáng)度為1000～5000Lux，光暗反應(yīng)周期為24h，培養(yǎng)溫度為20～30℃，光暗時(shí)間比為14:10，培養(yǎng)時(shí)間為10～15d天。培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定藻液的OD₆₈₀值，由于與生物量細(xì)胞干重具有很好的線性關(guān)系，根據(jù)OD₆₈₀的大小來(lái)進(jìn)行藻種的篩選，選出OD值比較大的耐受高PH的藻株，進(jìn)行馴化篩選。

在步驟（6）中，以1:10～1:5的比例將步驟（5）中挑選的藻落接種到培養(yǎng)基中。采用逐級(jí)提高PH值的方式進(jìn)行馴化培養(yǎng)，初始PH為8.0～9.0，每次PH提高0.5～1.0，每提高一次在相同條件下培養(yǎng)24～96h，選擇出OD值比較大的耐受高PH的藻液，獲得耐受PH為10～12的藻株。

本發(fā)明的凱氏擬小球藻在固定CO₂中的應(yīng)用。該藻株能夠耐受高達(dá)40v%的CO₂濃度，具有較高的CO₂固定效率。

本發(fā)明的凱氏擬小球藻在生產(chǎn)微藻油脂中的應(yīng)用。該藻株在PH為10～12的生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞總脂含量可占細(xì)胞干重的40%以上，能夠進(jìn)行生物柴油的生產(chǎn)。

本發(fā)明的凱氏擬小球藻在高PH下生產(chǎn)微藻油脂同時(shí)固定CO₂中的應(yīng)用。該藻株可以在PH為10～12的生長(zhǎng)條件下固定二氧化碳并進(jìn)行光照自養(yǎng)生長(zhǎng)獲取富含油脂的生物質(zhì)，該藻株可以利用BG11、SE等淡水培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)的光照強(qiáng)度1500～20000Lux，溫度為15～40℃，培養(yǎng)液的初始PH為8.0～9.0，每次PH提高0.5～1.0，直至提高至10～12，培養(yǎng)7天進(jìn)入穩(wěn)定期，收獲藻細(xì)胞。經(jīng)檢測(cè)，細(xì)胞總脂含量占細(xì)胞干重的40%以上。

與現(xiàn)有藻株相比，本發(fā)明可以帶來(lái)以下有益效果：

1、通過(guò)紫外誘變和逐級(jí)提高PH馴化篩選的方法選育獲得凱氏擬小球藻，獲得耐受高PH的凱氏擬小球藻突變株。與原始藻株相比，原始藻株在PH達(dá)到10以上時(shí)生長(zhǎng)緩慢，或者停止生長(zhǎng)甚至死亡，而本發(fā)明選育的凱氏擬小球藻能夠耐受的PH可達(dá)10～12，在PH值為10～12的條件下生長(zhǎng)速率提高了2～5倍。

2、本發(fā)明的凱氏擬小球藻在高PH值下能夠增加二氧化碳的溶解度，增加光合作用中對(duì)二氧化碳的固定，更好的吸收利用二氧化碳，對(duì)二氧化碳的減排有顯著作用，解決了現(xiàn)有凱氏擬小球藻只能在中性PH下生長(zhǎng)，而中性PH條件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的問(wèn)題。同時(shí)，在高PH值培養(yǎng)凱氏擬小球藻時(shí)，可以有效抑制凱氏擬小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中雜菌的生長(zhǎng)。

3、本發(fā)明方法采用逐級(jí)提高PH值的方式馴化篩選耐受高PH的藻種，避免了一次提高PH篩選帶來(lái)藻種的損傷，造成誘變篩選的失敗，保證了逐級(jí)馴化的可靠性和提高了誘變?cè)逯甑倪z傳穩(wěn)定性。以O(shè)D₆₈₀值作為生物量和生長(zhǎng)速率的衡量指標(biāo)，具有直觀便捷的特征，保證了在較短時(shí)間內(nèi)較高的篩選量。

生物材料保藏說(shuō)明

本發(fā)明提供的凱氏擬小球藻突變株（Parachlorella kessleri）FSH-Y3，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏編號(hào)：CGMCC No. 9238；保藏日期：2014年5月26日。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明中，v%為體積分?jǐn)?shù)。

實(shí)施例1 凱氏擬小球藻突變株FSH-Y3分離和篩選

本發(fā)明原始凱氏擬小球藻藻株是2011年11月從遼寧省撫順市渾河采集的水樣中通過(guò)平板劃線的方式分離出來(lái)的野生凱氏擬小球藻，編號(hào)為FSH-3。對(duì)原始凱氏擬小球藻藻株FSH-3進(jìn)行紫外誘變和馴化培養(yǎng)選育耐受高PH的凱氏擬小球藻突變株FSH-Y3。

本發(fā)明凱氏擬小球藻突變株FSH-Y3的獲得方式具體如下：

（1）配制BG11培養(yǎng)基，將配制好的BG11培養(yǎng)基分裝在250mL搖瓶中，每瓶裝液量為100mL，用透氣膜封口，牛皮紙包好，置于121℃，0.1MPa下滅菌30分鐘。所述BG11培養(yǎng)基組成如表1、表2所示。

表1 BG11培養(yǎng)基

*表2 表1中A5+Co solution的組成

（2）在無(wú)菌條件下，吸取原始凱氏擬小球藻藻液FSH-3約10mL接種到上述滅菌后的搖瓶中，將搖瓶置于恒溫光照搖床中培養(yǎng)。搖床的轉(zhuǎn)速設(shè)置為120rpm，溫度為25℃，設(shè)置光暗培養(yǎng)周期為24h，光暗反應(yīng)時(shí)間比為14:10，光照強(qiáng)度為5000Lux。

（3）在光照搖床中培養(yǎng)5天后，藻液進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)吸取藻液10mL于滅菌后的培養(yǎng)皿中，使藻液在培養(yǎng)皿底部平鋪一薄層，在磁力攪拌下放在紫外燈下進(jìn)行照射，紫外燈功率為30w，照射距離為15cm，照射時(shí)間15min，照射完后蓋上皿蓋，用不透光的紙包好，在25℃下暗培養(yǎng)2天，致死率為75%。

（4）將暗反應(yīng)培養(yǎng)的藻液用新鮮培養(yǎng)液稀釋10000倍，吸取0.2ml涂布到PH為11的BG11瓊脂固體平板（瓊脂含量為1.5%）上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為5000Lux，培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光暗反應(yīng)周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，培養(yǎng)時(shí)間15天。

（5）挑選平板上體積較大、顏色較綠的藻落進(jìn)行篩選，將其單藻落接種于裝有培養(yǎng)體積為20mL、PH值為9的BG11的培養(yǎng)基的50mL的搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，光照強(qiáng)度為5000Lux，光暗周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，培養(yǎng)10天后，測(cè)定搖瓶中藻液的OD₆₈₀值，根據(jù)OD₆₈₀的大小，選擇出OD值比較大的耐受PH9的藻株進(jìn)行馴化篩選。

（6）將篩選出的藻株按1:10的比例接入含有100mL的PH為10的BG11培養(yǎng)液的250mL的搖瓶中進(jìn)行馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，光照強(qiáng)度為3000Lux，光暗周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，培養(yǎng)3天后，剔除顏色發(fā)黃已經(jīng)死了的藻液，測(cè)定剩余搖瓶中藻液的OD₆₈₀值，根據(jù)OD₆₈₀的大小，選擇出OD值比較大的耐受PH10的藻株進(jìn)一步馴化。將PH提高至10.5、11.0、11.5，在上述相同條件下進(jìn)一步馴化，選擇出OD值比較大的藻株，此藻株即耐受高PH的目標(biāo)藻株FSH-Y3。

實(shí)施例2 原始藻株與誘變?cè)逯暝诓煌琍H下生長(zhǎng)速率的比較

將篩選的藻株FSH-Y3的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液和原始藻種FSH-3的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液按一定的比例接入裝有BG11培養(yǎng)基的搖瓶中，接種后初始OD₆₈₀值相同，均為0.2。從反應(yīng)器底部通入CO₂含量為5v%的氣體，不同的PH值下培養(yǎng)7天，測(cè)定OD₆₈₀值作為衡量生長(zhǎng)速度的指標(biāo)，所得的結(jié)果如表3所示。

表3 原始藻株與誘變?cè)逯暝诓煌琍H值下的OD值比較

由表3可見，誘變?cè)逯觌S著PH值的升高OD值變化不明顯，而原始藻株OD值迅速下降，生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡。

實(shí)施例3 FSH-Y3和FSH-3的生長(zhǎng)效果的比較

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FSH-Y3和FSH-3的藻液分別接種在BG11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室自制的柱式反應(yīng)器（內(nèi)徑為40mm，高度為500mm）中進(jìn)行，接種后的密度調(diào)整為OD₆₈₀為0.2。根據(jù)試驗(yàn)需要，組配不同含量的CO₂氣體，然后從反應(yīng)器底部通入。培養(yǎng)過(guò)程中光照強(qiáng)度為5000Lux，培養(yǎng)溫度為28℃，PH值控制在11，光照周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，培養(yǎng)時(shí)間為7天，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻細(xì)胞，在-60℃條件下真空冷凍干燥至恒重后測(cè)量藻粉干重，計(jì)算生物質(zhì)產(chǎn)量。結(jié)果如表4所示。

表4 不同CO₂含量的效果比較

從結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)馴化篩選的凱氏擬小球藻FSH-Y3比初始藻株FSH-3對(duì)CO₂和PH有更好的耐受性，生物量穩(wěn)定性好。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)石油化工股份有限公司

中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院

<120> 一種耐受高PH的凱氏擬小球藻及其培養(yǎng)應(yīng)用

<130> 新專利申請(qǐng)

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1421

<212> DNA

<213> Parachlorellakessleri

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgctttata 60

ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatagttt atttgatggt accttactac 120

cggataaccg tagtaattct agagctaata cgtgcgtaaa tcccgacttc tggaagggac 180

gtatttatta gatttaaggc cgacccggct ctgccggtcc cacggtgaat catgataact 240

tcacgaatcg catggccttg cgccggcgat gtttcattca aatttctgcc ctatcaactt 300

tcgatggtag gatagaggcc taccatggtg gtaacgggtg acggaggatt agggttcgat 360

tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg aaggcagcag gcgcgcaaat 420

tacccaatcc tgacacaggg aggtagtgac aataaataac aataccgggc cttttcaggt 480

ctggtaattg gaatgagtac aatctaaacc ccttaacgag gatcaattgg agggcaagtc 540

tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tatttaagtt gctgcagtta 600

aaaagctcgt agttggattt cgggcggggc ctgccggtcc gccgtttcgg tgtgcactgg 660

ccgggcccgc cttgttgccg gggacgggct cctgggcttc actgtccggg actcggagtc 720

ggcgctgtta ctttgagtaa attagagtgt tcaaagcagg cctacgctct gaatacatta 780

gcatggaata acacgatagg actctggcct atcctgttgg tctgtaggac cggagtaatg 840

attaagaggg acagtcgggg gcattcgtat ttcgatgtca gaggtgaaat tcttggattt 900

tcgaaagacg aactactgcg aaagcatttg ccaaggatgt tttcattaat caagaacgaa 960

agttgggggc tcgaagacga ttagataccg tcctagtctc aaccataaac gatgccgact 1020

agggatcggc ggatgtttct tcgatgactc cgccggcacc ttatgagaaa tcaaagtttt 1080

tgggttccgg ggggagtatg gtcgcaaggc tgaaacttaa aggaattgac ggaagggcac 1140

caccaggcgt ggagcctgcg gcttaatttg actcaacacg ggaaaactta ccaggtccag 1200

acatagtgag gattgacaga ttgagagctc tttcttgatt ctatgggtgg tggtgcatgg 1260

ccgttcttag ttggtgggtt gccttgtcag gttgattccg gtaacgaacg agacctcagc 1320

ctgctaaata gtcacggtct cctcgggggc cggcagactt cttagaggga ctattggcga 1380

ctagccaatg gaagcatgag gcaataacag gtctgtgatg c 1421