專利名稱：一種屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因核苷酸序列的表達(dá)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(fugalimmunomodulatory proteins, FIPs)是從靈芝中分離得到的繼多糖和三萜類化合物后，又一類活性物質(zhì)。自從1989年Kino等首次從赤芝(Ganoderma Iucidum)子實(shí)體中分離得到了這種蛋白，并命名為Ling Zh1-8 (LZ-8或FIP-glu)。到目前為止，已分別從赤靈芝(G.1ucidum)、松杉靈芝(G.tsugae)、金針恭(Flammulina velutipes)、草 (Volvariella volvacea)、紫靈芝(G.japoncium)、小孢靈芝(G.microsporum)及紫芝(G.sinensis)中克隆得到了 7種FIPs,分別為命名為LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FlP-gja (AY987805)、FlP-gmi 和 FlP-gsi,形成了一個(gè)新的蛋白質(zhì)家族真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIPs)家族[Li QZ, Wang XF, ZhouXff.Recent status and prospects of the fungal immunomodulatory protein family.Critical Reviews in Biotechnology.2011，31 (4):365-375]。在這個(gè)蛋白家族中，直接從天然蕈菌中分離得到的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白僅有四種，它們分別是:LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo，其余的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白則是通過基因重組技術(shù)表達(dá)而來，其氨基酸序列是由基因序列翻譯后得到的。Wang XF等經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IPs的氨基酸序列同源性較高，一般可達(dá) 60-70% 左右[Wang XF, Su KQ, Bao Tff, Cong WR, Chen YF, Li QZ, ZhouXff.Fungal immunomodulatory proteins and immunomodulation effects.CurrentTopics in Nutraceutical Research.2012, 10(I):1-11.]FIPs具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，在抗過敏、抗腫瘤、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和抗移植排斥等方面均有重要作用，其中抗腫瘤作用尤其引起大家興趣。Lin JW等經(jīng)MTT (四唑鹽)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測，在畢赤酵母中表達(dá)的FIP-glu可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人類白血病NB4的表達(dá)水平(32 μ g/mL FIP-glu可誘導(dǎo)約35%的人類白血病NB4細(xì)胞凋亡)，具有一定的抗癌活性[Lin Jff, Hao LX, Xu GX, et al.MolecularCloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatoryprotein from Ganoderma lucidum in Pichia pastoris.World Journal MicrobiolBiotechnol, 2008，25 (3):383-390]。Liao CH 等在大腸桿菌中表達(dá)的 FIP-gts 在人類肺腺癌A549細(xì)胞中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。當(dāng)FIP-gts的濃度達(dá)到4-10 μ g/mL時(shí)，可有效控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，具有很好的抗腫瘤效果[Liao CH, Hsiao YM, Lin CH.1nduction ofpremature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatory proteinfrom Ganoderma tsugae.Food and Chemical Toxicology, 2008，46(5):1851-1859]。石開究認(rèn)為，F(xiàn)IP-gts雖能顯著抑制人類肺腺癌A549癌細(xì)胞的生長，但是不會(huì)影響正常MRC-5纖維原細(xì)胞的生長，它在mRNA水平下調(diào)端粒 酶催化亞基的表達(dá)，抑制端粒酶的活性并具有劑量依賴效應(yīng)。端粒酶在正常的體細(xì)胞里一般不被活化，它的活性有無往往會(huì)成為決定細(xì)胞無限增殖的關(guān)鍵因素。同時(shí)，F(xiàn)IP-gts可以促進(jìn)NK細(xì)胞(natural killer cell)、巨噬細(xì)胞以及活化血清抗體的生成，有效地調(diào)節(jié)免疫功能，一定程度上也可以抑制癌細(xì)胞的生長[Liao CH, Hsiao YM, Hsu CP, et al.Transcriptionally mediated inhibitionof telomerase of fungal immunomodulatory protein from Ganoderma tsugae inA549human lung adenocarcinoma cell line.Molecular Carcinogenesis, 2006, 45(4):220-229] 0但由于真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在天然蘑菇(或蕈菌)中的含量非常低(20-80mg/Kg)[林景衛(wèi)，孫非，張韌，張春玉，劉立俠.真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的研究進(jìn)展.中華免疫學(xué)雜志.2005, 21 (6):477-480.]，人們設(shè)想通過異源表達(dá)和發(fā)酵工業(yè)過程大量生產(chǎn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，并開發(fā)健康產(chǎn)品或藥物。在真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的異源表達(dá)中，最早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。常用的表達(dá)載體有pET-28a、pET-28b和pET_30等，表達(dá)的宿主細(xì)胞包括有大腸桿菌TGl細(xì)胞、大腸桿菌M15細(xì)胞、大腸桿菌BL21細(xì)胞等。李奇璋等將來源于紫芝(Ganoderma sineses)的FlP-gsi轉(zhuǎn)入pET_30a表達(dá)載體中同樣可以在大腸桿菌BL21細(xì)胞中得到表達(dá)，獲得了重組的紫芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白[李奇璋，王雪飛，黃蕾，等.紫芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的原核表達(dá)與功能分析.西北植物學(xué)報(bào)，2010，30(1):35-40]。同樣在大腸桿菌BL21細(xì)胞中表達(dá)，徐貴雪從金針菇基因組中克隆出編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因FIP-fve，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28 (+)-FIP-fve，轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21中，經(jīng)過培養(yǎng)篩選穩(wěn)定表達(dá)的重組子，有效的表達(dá)了重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)菌中的表達(dá)量為30mg/L[徐貴雪.金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組表達(dá)及生物學(xué)特性的初探[D].東北師范大學(xué)，2009]。大腸桿菌M15細(xì)胞也是目前表達(dá)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因主要宿主之一，Li QZ等把來源于紅靈芝的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因LZ-8 (FIP-glu)克隆到pQE-30表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌M15細(xì)胞中，同樣獲得了重組的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白 FIP_glu[Li QZ, Wang XF, Bao Tff, et al.1n vitro synthesis of arecombinant fungal immunomodulatory protein from Lingzhi or Reishi medicinalmushroom,Ganoderma lucidum(ff.Curt.:Fr.) P.Karst.(Aphyllophoromycetideae) andanalysis of its immunomodulatory activity.1nternational Journal of MedicinalMushrooms, 2010, 12(4):347-358]用于進(jìn)一步的科學(xué)研究或產(chǎn)品研發(fā)。同樣，Li QZ等人還把來源于紫芝(Ganoderma sinensis)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gsi,轉(zhuǎn)入pQE-30表達(dá)載體中，同樣在大腸桿菌M15細(xì)胞中表達(dá)，也獲得了重組的紫芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gsi[Li QZ, Wang XF, Chen YY, et al.Cytokines expression induced by Ganodermasinensis fungal immunomodulatory proteins(FlP-gsi)in mouse spleen cells.Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010，162 (5): 1403-1413]。于此同時(shí)，在某些時(shí)候大腸桿菌TGl細(xì)胞同樣也可以作為FIPs表達(dá)的宿主細(xì)胞，1997年Lin等人通過將FIP-gts基因連接到大腸桿菌細(xì)胞TGl中，獲得了與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶組成融合蛋白標(biāo)記物(GST)，再被凝血酶消化后FIP-gts產(chǎn)量高達(dá)20mg/L[Lin W H, Hung C H, Hsu C I, etal.Dimerization of the N-terminal amphipathic a -helix domain of the fungalimmunomodulatory protein from Ganoderma tsugae(Fip-gts)defined by a yeasttwo-hybrid system and site-directed mutagenesis[J].Journal of Biological Chemistry, 1997，272 (32):20044-20048]。綜上述所，現(xiàn)有的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)，其表達(dá)量大約在約20 30mg/L[葉波平，王凡，梁亦馨，金國虔，吳梧桐.LZ-8基因在大腸桿菌中的表達(dá).藥物生物技術(shù)，2002，9 (I):21-23 ;白杰英，曾林，李彥舫，林忠平.真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及其抗體制備.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2006，23 (10):1205-1207],表達(dá)的載體和宿主細(xì)胞不同，表達(dá)蛋白的修飾也不盡相同，因而也表現(xiàn)出不同的生理活性。在先前的實(shí)驗(yàn)中，我們利用DNA shuffling技術(shù)對(duì)不同來源的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因在DNA水平上進(jìn)行重組，構(gòu)建得到改組文庫，利用斑點(diǎn)雜交技術(shù)和特異性抗體對(duì)改組文庫進(jìn)行篩選，分別得到屬內(nèi)重組菌株[周選圍，王雪飛，李奇璋，蘇愷琪等.靈芝屬內(nèi)重組的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因、該基因編碼的蛋白及其應(yīng)用。申請?zhí)?201110068761.7]和屬間重組菌株[周選圍，王雪飛，李奇璋，蘇愷琪等.靈芝屬內(nèi)重組的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因、該基因編碼的蛋白及其應(yīng)用。申請?zhí)?201110068813.0]，在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了前述屬內(nèi)重組中的reFIP-SN15基因，進(jìn)一步研究其表達(dá)產(chǎn)物的制備方法及表達(dá)產(chǎn)物在開發(fā)抗腫瘤藥物產(chǎn)品中的應(yīng)用。在對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，至今尚未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明主題相同的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供reFIP_SN15基因表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，具體包括一種針對(duì)reFIP-SN15基因有效的原核表達(dá)載體、大腸桿菌宿主細(xì)胞，利用該載體和宿主細(xì)胞表達(dá)的reFIP-SN15蛋白的分離純化方法；另一目的是提供，reFIP_SN15基因表達(dá)蛋白在開發(fā)抗癌藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP_SN15基因序列，是通過DNAshuf Iling技術(shù)從赤芝(Ganoderma lucidum)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FIP-glu和紫芝(Ganoderma sinensis)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gsi重組而來的(申請?zhí)?201110068761.7)。將通過基因重組的新的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP_SN15基因構(gòu)建成原核表達(dá)載體pET-30a-reFI P-SN15轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)；原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)金屬鎳離子螯合柱純化后，用MTT法測定了 reFIP-SN15蛋白對(duì)不同人類癌癥細(xì)胞株的毒性。在體外毒性試驗(yàn)中選取四株人類癌細(xì)胞:肺癌細(xì)胞A549 (Lungcarcinoma)、結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29 (Colon cancer)、肝癌細(xì)胞 HCC-LM3 (Hepatocellularcarcinoma)、乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)進(jìn)行試驗(yàn)。本發(fā)明的具體操作方法包括如下步驟:(I)構(gòu)建表達(dá)載體；(2)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌；(3)擴(kuò)大培養(yǎng)；(4) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)；(5)分離純化；所述屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白為屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP_SN15的表達(dá)產(chǎn)物，其序列如SEQ ID N0.1所示；所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21菌株。優(yōu)選地，所述步驟(I)構(gòu)建表達(dá)載體的具體方法為:
a.根據(jù)屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP_SN15的序列，設(shè)計(jì)引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Bam H I和Hind III，以構(gòu)建原核表達(dá)載體；b.以reFIP_SN15基因?yàn)槟０?，?jīng)PCR擴(kuò)增后，將reFIP_SN15基因克隆至中間載體；c.用雙酶切將reFIP_SN15片斷從中間載體上切下，回收相應(yīng)片段，用T4連接酶16 0C連接過夜得表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述步驟b中的所述中間體為pMD18_T simple vector或pET_30a。優(yōu)選地，所述步驟(2)的具體方法為:將所述表達(dá)載體加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞冰上放置30min，之后42°C循環(huán)水浴熱擊90s，迅速冰浴2min。加入800 μ L LB培養(yǎng)液37°C慢搖復(fù)蘇lh。取200 μ L菌液菌液涂布在含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板，篩選轉(zhuǎn)化子并挑取陽性克隆。優(yōu)選地，所述步驟(3)的具體方法為:將獲得的陽性克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日以2%接種量接種，37°C繼續(xù)發(fā)酵。優(yōu)選地，所述步驟(4)的具體方法為:當(dāng)發(fā)酵液OD6tltl達(dá)到0.5 0.7時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG的終濃度為ImM。優(yōu)選地，所述步驟(5)的具體方法為:a.將經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的菌液離心收集細(xì)胞，懸浮于緩沖液中；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化； b.將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎；c.超聲處理過的菌液離心取上清，上N1-NTA柱，用緩沖液I洗柱后，用緩沖液2將目的蛋白洗脫出來；所述緩沖液I 為 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole,pH 為 8.0 的水溶液；所述緩沖液2 為 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole, ρΗ8.0 的水溶液。分別培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞Α549 (Lung carcinoma)、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 (Coloncancer)、人肝癌細(xì)胞 HCC-LM3 (Hepatocellular carcinoma)、人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231(Breast adenocarcinoma),檢測重組蛋白FIP-SN15對(duì)各細(xì)胞株的抑制效果。結(jié)果表明重組基因表達(dá)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP-SN15，在體外可抑制人肺癌細(xì)胞A549 (Lungcarcinoma)和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)的繁殖，說明該蛋白對(duì)這兩種腫瘤細(xì)胞株有抑制作用。本發(fā)明中所涉及的生物材料及試劑除特別注明外，均能夠從市售獲得。本發(fā)明中所述的屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP_SN15基因序列，見于專利:201110068761.7，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本發(fā)明中所涉及的大腸桿菌BL21已在[李奇璋，王雪飛，黃蕾，周選圍.紫芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的原核表達(dá)與功能分析，西北植物學(xué)報(bào)，2010，30 (I):0035 - 0040]中公開；BL21大腸桿菌菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如北京博邁德科技發(fā)展有限公司，公司地址:北京市海淀區(qū)西四環(huán)中路甲59號(hào)。本發(fā)明中所述金屬鎳離子螯合(N1-NTA)柱適用于從細(xì)菌中抽提通常含有連續(xù)6個(gè)組氨酸尾(His Tag Protein)的具有天然結(jié)構(gòu)的可溶性重組蛋白質(zhì)(Native Protein)。本發(fā)明中所述納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀型號(hào)為impactQ-tof ultimate3000,購自Bruker公司和Dionex公司，為上海交通大學(xué)分析測試中心所有。本發(fā)明中所述MTT法根據(jù)SOP PL-B10002標(biāo)準(zhǔn)化流程操作。其中選用的肺癌細(xì)胞 A549 (Lung carcinoma)、結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29 (Colon cancer)、肝癌細(xì)胞 HCC-LM3(Hepatocellular carcinoma)、乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)均購自澎立生物醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司，公司地址:上市海伽利略路388號(hào)，7號(hào)樓。在本發(fā)明中，可包括含有重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP_SN15的載體、所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明利用重組基因表達(dá)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP_SN15，在體外可抑制人肺癌細(xì)胞 A549 (Lung carcinoma)和乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)的繁殖，說明該蛋白對(duì)這兩種腫瘤細(xì)胞株有抑制作用。該基因?qū)⑼ㄟ^轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過蛋白表達(dá)和純化，在抗肺癌和乳腺癌藥物的開發(fā)中有巨大的應(yīng)用潛力。


圖1重組靈芝屬內(nèi) 真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白電泳圖(A)及Western Blot檢測圖(B)圖2重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白抗腫瘤活性測定和其對(duì)人肺癌細(xì)胞A549 (Lung carcinoma)、人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29 (Colon cancer)、人肝癌細(xì)胞 HCC-LM3(Hepatocellular carcinoma)、人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)細(xì)胞
毒性影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體過程。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP_SN15原核表達(dá)載體的構(gòu)建:(I)根據(jù)屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP_SN15的序列，設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出其基因全長的引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Bam H I和Hind III，以構(gòu)建原核表達(dá)載體。(2)以屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP_SN15為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將reFIP_SN15基因克隆至中間載體(如pMD18_T simple vector),測序結(jié)果與所報(bào)道的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP-SN15序列比較，一致性為100%，表明擴(kuò)增沒有出現(xiàn)錯(cuò)配。(3)根據(jù)引物兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用雙酶切(pET_30a載體可用Hind III和Bam HI)將reFIP-SN15片斷從pMD18-T simple vector上切下，回收相應(yīng)片段，用T4連接酶16°C連接過夜。(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主細(xì)胞，用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子并挑取陽性克隆，測序。(5)提取克隆質(zhì)粒，即得到重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)載體pET30a-reFIP-SN15o實(shí)施例2靈芝屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP_SN15的誘導(dǎo)表達(dá)與純化:1.重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP_SN15的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot檢測(I)將實(shí)施例1中獲得的單克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。(2)次日以2%接種量接種于較大體積培養(yǎng)液。37°C繼續(xù)培養(yǎng)，至OD6tltl達(dá)到0.5
0.7時(shí)，加入IPTG，使IPTG的終濃度達(dá)到ImM。(3)每0、l、2、3、4、5h取出ImL至-20°C保存?zhèn)溆谩⑺〉镁簶悠?，OOOrpm離心 20min 以收集菌體，去上清，菌體用 100 μ L2 X SDS-PAGE Sample buffer (IOOmMρΗ6.8Tris-Cl，4%(ff/V) SDS, 0.2%(ff/V) BPB, 20%(ff/V) glycerine, 2%(ff/V) β -ME)懸浮，并在95°C水浴鍋中保 溫5min。之后再分別用兩塊15%SDS_PAGE膠檢測。一塊用于考馬斯亮藍(lán)染色，另一塊用于Western blot檢測(圖1)。圖1所示，上方(A)為含有重組表達(dá)載體pET30-reFIP-SN15的大腸桿菌BL21細(xì)胞經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)電泳圖，下方(B)為靈芝屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP-SN15的Western Blot檢測。泳道M為marker,泳道1_6分別為誘導(dǎo)時(shí)間O、1、2、3、4、5小時(shí)的大腸桿菌細(xì)胞，箭頭所示即為靈芝屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP-SN15。誘導(dǎo)4小時(shí)時(shí),重組蛋白表達(dá)量為最高。經(jīng)大腸桿菌發(fā)酵，重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)量高達(dá)35.95mg/L02.重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的分離純化(I)將經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的菌液5，OOOrpm離心20min以收集細(xì)胞，用1/10體積的Lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM imidazole, ρΗ8.0)懸?。粚⒒旌衔镏糜谝旱欣鋬?，之后再于冰水中融化；(2)將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎，200 300W超聲6次，每次10s，期間間隔IOs ；(3)超聲處理過的菌液于4°C下12，OOOrpm離心20 30min ;取上清,使用N1-NTA柱純化(預(yù)先用10倍柱體積的Lysis buffer平衡);用20倍柱體積的Wash buffer (50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH8.0)洗柱；目的蛋白由 Elution buffer (50mMNaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole, pH8.0)洗脫出來。實(shí)施例3重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP_SN15的Q_tof MS分析1.重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白reFIP_SN15前處理(I)用干凈刀片割下SDS-PAGE凝膠目的條帶，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，并用200 μ L槍頭將膠片粉碎成l_2mm2大小的膠塊；(2)超純水洗膠兩次，加入500 μ L脫色液(50%乙腈，25mM NH4HCO3),室溫振蕩15-20min,離心棄上清液。重復(fù)此步驟1_2次至膠塊無色；(3)加入500 μ L50%乙腈,室溫振蕩10_15min,離心棄上清液；
(4)樣品置于濃縮干燥儀中干燥(50-55°C 5min或室溫IOmin)；(5)加入 100 μ LlOmM DTT (25mM NH4HCO3 溶解或稀釋)，60°C水浴放置 20min，離心
棄掉上清液；(6)加入300 μ L50%乙腈，震蕩5-lOmin，離心并棄掉上清液；(7)加新配置的 IAA (4.62mg/mL 1doacetimide, 25mM NH4HCO3 溶解)室溫避光放置15-20min,離心Imin,棄去上清液；(8)加 ΙΟΟμ L50mM NH4HCO3 震蕩 5-lOmin，離心棄上清，加入 300 μ L50% 乙腈，震蕩5-10min,離心去上清；(9)沉淀在濃縮干燥儀中干燥(50-55°C 5min或室溫IOmin)；2.消化(I)干燥產(chǎn)物中加入70 μ L Trypsin酶液(常用測序級(jí)Trypsin, Promega,濃度為IOng/ μ L,溶于 50mM NH4HCO3)；(2) 37°C恒溫箱中倒置過夜；3.萃取(I) 10-100 μ L 乙腈:水:甲酸(60:35:5)，超聲粉碎 5min，37°C 放置 lh。(2)將液體吸凈至另一干凈的離心管中，加入IO-1OOyL乙腈，超聲粉碎5min，37°C靜置40-60min，將液體吸凈轉(zhuǎn)移至以上步驟離心管，合并提取液；(3)濃縮干燥儀中50_55°C干燥l_2h，干燥樣品可_20°C保存；4.上樣(I)干燥樣品加入適量(40-60 μ L)的 solution A (98%Mi I iQ-H20, 2%CH3CN,0.1%FA)，震蕩5-10min重新溶解；(2)上樣溶液離心1011^11，取適量(2(^1^左右)樣品加入樣品瓶上樣分析。Q-tof MS驗(yàn)證了 25條肽段。經(jīng)過拼接后證實(shí)，共有3條肽段與預(yù)測序列重合，重合序列中包含102個(gè)氨基酸殘基，匹配率超過90% (如下表所示，其中下劃線部分為肽段碎片重合部分)。該結(jié)果證實(shí)，在大腸桿菌中表達(dá)并且純化得到的分子量約為19kD的蛋白為重組的reFIP-SN15蛋白。
權(quán)利要求
1.一種屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法，包括如下步驟: (1)構(gòu)建表達(dá)載體； (2)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌； (3)擴(kuò)大培養(yǎng)； (4)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； (5)分離純化； 所述屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白為屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP-SN15的表達(dá)產(chǎn)物，其序列如SEQ ID N0.1所示； 所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法，其中，所述步驟(I)構(gòu)建表達(dá)載體的具體方法為: a.根據(jù)屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因reFIP-SN15的序列，設(shè)計(jì)引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Bam H I和Hind III，以構(gòu)建原核表達(dá)載體； b.以reFIP-SN15 基因?yàn)槟０?，?jīng)PCR擴(kuò)增后，將reFIP-SN15基因克隆至中間載體； c.用雙酶切將reFIP-SN15片斷從中間載體上切下，回收相應(yīng)片段，用T4連接酶16°C連接過夜得表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求2所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的制備方法，其中，所述步驟b中的所述中間體為pMD18_T simple vector或pET_30a。
4.如權(quán)利要求1所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的表達(dá)方法，其中，所述步驟(2)的具體方法為:將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主細(xì)胞，用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子并挑取陽性克?。? 所述轉(zhuǎn)化條件為:表達(dá)載體加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞冰上放置30min，之后42°C循環(huán)水浴熱擊90s，迅速冰浴2min。之后加入800 μ LLB培養(yǎng)液37°C慢搖復(fù)蘇lh。
5.如權(quán)利要求1所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法，其中，所述步驟(3)的具體方法為:將獲得的陽性克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日以2%接種量接種，37°C繼續(xù)發(fā)酵。
6.如權(quán)利要求1所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法，其中，所述步驟(4)的具體方法為:當(dāng)發(fā)酵液OD6tltl達(dá)到0.5 0.7時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG的終濃度為ImM。
7.如權(quán)利要求1所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法，其中，所述步驟(5)的具體方法為: a.將經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的菌液離心收集細(xì)胞，懸浮于緩沖液中；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化； b.將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎； c.超聲處理過的菌液離心取上清，上N1-NTA柱，用緩沖液I洗柱后，用緩沖液2將目的蛋白洗脫出來； 所述緩沖液 I 為 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 為 8.0 的水溶液； 所述緩沖液 2 為 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole, pH8.0 的水溶液。
8.如權(quán)利要求1所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在抗腫瘤藥物研發(fā)中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在抗腫瘤藥物研發(fā)中的應(yīng)用，其中，所述抗腫瘤藥物是指用于抗人肺癌或乳腺癌的藥物。
10.如權(quán)利要求9所述的屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在抗腫瘤藥物研發(fā)中的應(yīng)用，其中，所述抗腫瘤藥物是指用 于抗乳腺癌的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及其應(yīng)用。該屬內(nèi)基因具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO.1。發(fā)明對(duì)該屬內(nèi)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因表達(dá)于大腸桿菌獲得高表達(dá)量目的蛋白，并且證明其對(duì)乳腺癌和肺癌具有很好的抗腫瘤活性。這對(duì)于重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)與開發(fā)成抗腫瘤新藥的應(yīng)用提供了一種新的應(yīng)用方向和探索途徑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103243116SQ20131016720
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者周選圍, 叢蔚然 申請人:上海交通大學(xué)