本發(fā)明涉及分子生物技術領域，特別涉及一株牛支原體及其應用。

背景技術：

牛支原體(mycoplasmabovis)主要引起牛的肺炎、關節(jié)炎、乳房炎、角膜結膜炎、生殖道炎癥以及流產和不孕等疾病。1961年，美國人hale等首次從在患乳房炎奶牛的牛奶中分離出牛支原體。1976年牛支原體被描述為致呼吸道疾病的主要病因，之后，牛支原體及其相關疾病迅速擴散至世界各個國家和地區(qū)的牛群，對世界養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展造成了極大的威脅和了嚴重的經濟損失。2008年以來，我國多地相繼發(fā)生并廣泛流行的以發(fā)熱、咳嗽和流鼻涕為主要癥狀，以壞死性肺炎為主要病變的牛呼吸道傳染病亦被確定為牛支原體感染所致的牛支原體肺炎，由于該病常規(guī)藥物療效不佳，且無有效疫苗進行預防，因此給我國的養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重經濟損失。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一株牛支原體及其應用，該菌株毒力強，制備的疫苗免疫性好。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

一株牛支原體，所述的牛支原體為牛支原體(mycoplasmabovis)hnmb1，保藏編號：cgmccno：13295，保藏日期：2016年11月28日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

一種牛支原體在制備牛支原體滅活疫苗方面的應用。

所述的牛支原體滅活疫苗中，牛支原體菌量為1×10⁹cfu/ml。

所述的牛支原體滅活疫苗的制備方法為：將所述的牛支原體依次經過培養(yǎng)、收獲和滅活得到疫苗原液后，加入佐劑即得疫苗。

所述的佐劑為氫氧化鋁佐劑。

所述的牛支原體滅活疫苗的制備方法為：將牛支原體接種到pplo液體培養(yǎng)基，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后收取培養(yǎng)物，測定濃度，調整培養(yǎng)物中的菌數(shù)為2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至終濃度為0.2％，于37℃滅活12h；滅活后的培養(yǎng)物按體積比1:1加入氫氧化鋁佐劑，混合制得牛支原體滅活疫苗。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明中的菌株hnmb1分離自發(fā)生典型呼吸道癥狀死亡的奶犢牛，在pplo固體培養(yǎng)基上分離時無其它細菌生長，只有支原體生長，在pplo液體培養(yǎng)基中增殖滴度高，達10⁹cfu/ml以上。

2、本發(fā)明中的菌株hnmb1對犢牛具有較強的致病力，引起犢牛發(fā)病死亡，具有良好的免疫原性。

3、根據(jù)本發(fā)明中的菌株hnmb1制備的疫苗對牛的支原體肺炎具有較好的保護效果。

附圖說明

圖1為菌株hnmb1菌落4×顯微鏡下形態(tài)。

圖2為菌株hnmb1菌體吉姆薩染色100×顯微鏡下形態(tài)。

圖3為菌株hnmb1的pcr鑒定結果，圖中的marker為dl2000bp，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1為引物mb1，mb2對牛支原體標準株的擴增結果；2為引物mb1，mb2對菌株hnmb1的擴增結果；3為引物mb3，mb4對菌株hnmb1的擴增結果；從圖中可以看出，模板pcr擴增片段約為1390bp，證明擴增片段為目的片段，符合預期設計大小。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1、牛支原體的分離和鑒定

1.1病料采集

病料來自于2016年11月在河南省濟源市某大型奶牛場發(fā)生重癥肺炎呼吸困難死亡的2月齡黑白花奶牛。

1.2培養(yǎng)基的制備

pplo液體培養(yǎng)基：pplo肉湯粉10.5g，葡萄糖2.5g，酵母粉2.5g，溶于440ml超純水中，115℃滅菌15min，加mem培養(yǎng)基5ml、馬血清50ml、青霉素8萬單位、無菌10％精氨酸10ml和1％(w/v)酚紅500μl。培養(yǎng)基于115℃滅菌15min后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

pplo固體培養(yǎng)基：1.5％(w/v)瓊脂粉的pplo液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基于115℃滅菌15min后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3支原體的分離培養(yǎng)

無菌條件下將采集的病肺組織切成小塊。將小塊組織的切面涂于pplo固體培養(yǎng)基表面，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5d后，無明顯的其它細菌生長，肉眼見極小的針尖狀菌落，低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)，形態(tài)為典型的支原體“煎荷包蛋樣”(見圖1)。挑取pplo固體培養(yǎng)基上具有“煎荷包蛋樣”典型特征的菌落，純化。吉姆薩染色(見圖2)，油鏡下觀察支原體菌體形態(tài)，為多形態(tài)，呈球菌樣、彎曲的絲狀、螺旋狀，命名為菌株hnmb1。

1.4菌株的鑒定

1.4.1設計引物

根據(jù)牛支原體16srrna的序列設計一對通用引物，用于牛支原體的擴增，引物序列如下：

mb1：5’-ccttaggcagtttctttataa-3’(seqidno.1)

mb2：5’-catgcatgtcgagcgatgat-3’(seqidno.2)

擴增片段大小為1390bp。

同時設計一對牛傳染性胸膜肺炎支原體的特異性引物，用于牛傳染性胸膜肺炎支原體的擴增，引物序列如下：

mb3：5’-atatacttctgttctagtaatatg-3’(seqidno.3)

mb4：5’-ctgattatgatgacagtggtca-3’(seqidno.4)

擴增片段大小為277bp。

1.4.2pcr鑒定

將菌株hnmb1接種pplo液體培養(yǎng)基，置于37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，收集菌體，按照dna提取試劑盒的操作步驟提取出菌株hnmb1的dna，分光光度計測定濃度為100μg/ml，分別用mb1，mb2和mb3，mb4擴增進行pcr鑒定。同時，設置牛支原體標準株為陽性對照。

pcr擴增反應體系為25μl：10×緩沖液2.5μl，2.5mm(each)dntpsmix0.5μl，10μm/l通用引物mb1，mb2(或mb3，mb4)各1μl，5u/μlrtaq1μl，100μg/mldna模板1μl，加入ddh2o至25μl。

反應條件：95℃預變性5min，進入循環(huán)：95℃1min，57℃1min，72℃30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，pcr產物4℃保存。

擴增產物分別進行電泳，每孔加樣10μl，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結果(見圖3)。圖3看出，mb1，mb2擴增出符合預期大小片段，經測序與牛支原體hb0801-p180株(genbankno.cp007591)同源性100％，測序結果如下。mb3，mb4未擴增出片段，證明所分離的毒株hnmb1為牛支原體(mycoplasmabovis)，不是牛傳染性胸膜肺炎支原體。

ccttaggcagtttctttataaaccgacttcgggcattaccagctcccatggtttgacgggcggtgtgtacaagacccgagaacgtattcaccgtagcgtagctgatctacgattactagcgattccgacttcatgaagtcgagttgcagacttcaatccgaactgagaacggttttttgaggtttgctccatgtcaccacttcgcttctctttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagccccactcgtaagaggcatgatgatttgacgtcgtccccaccttcctcccgattactcgggcagtctccttagagtgctcaactaaatggtagtaactaaggataagggttgcgctcgttgcaggacttaaccgaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccatctgtcattctgttaacctccactatgtctccatagctttgcagaagatgtcaagagtgggtaaggttctacgcgtaacatcaaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcggatccccgtcaattcctttaagttttattcttgcgaacgtactactcaggcggatcatttaatgcgttagctgcgtcgatgagttccccatcaactaatgatcatcgtttagggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgtctctcagtgtcagtgtatgcccagttagctgccttcgccatattgatgttcttccttatatctacgcatttcaccgcttcacaaggaattccgctaacctctacataactctagtctgccagtatccaacgcgttttggggttgagccccaaaatttaacgccagacttaacaaacaacctacagacgctttacgcccaataatttcggataacgcttgcaacctatgtattaccgcggctgctggcacatagttagccgttgctttctaatcaggtaccgtcaaggtagcatcatttcctatgctactttttcttccctaaccacagcagtttacaacccatagggccttcatcctgcacgctgtgtcgctccatcagactttcgtccattgtggaatattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtatctcagtcccagtgtggcggatcaatctctcaaccccgctaaacatcatcgccttggtgggccgttacctcaccaactagctaatgttgcgcactccgatcttttagcgaagcaaacgcttccttttatattactttcatgcaaaaataataagtattcggtattatcggatgtttccatccgctatcccaatctaaaaggtacgttgagtacgtgttactcacccattcgccgctatgatattgctatcatcgctcgacatgcatg(seqidno.5)

1.5毒力試驗

試驗牛為2月齡健康的黑白花奶牛，公牛、母牛各8頭。試驗動物分為兩組，對照組8頭，試驗組8頭。兩組試驗動物各包括隨機分組的公牛2頭、母牛2頭。將hnmb1接種pplo液體培養(yǎng)基，37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，測定菌體濃度，連續(xù)10倍稀釋涂布固體平板，低倍鏡下活菌計數(shù)，計算原液菌體濃度，為3.1×10⁹cfu/ml，再調整至10⁸cfu/ml，試驗組動物通過喉氣管接種3ml支原體液體培養(yǎng)物，對照組動物通過喉氣管接種3ml滅菌的pplo液體培養(yǎng)基。試驗期為15d，每天觀察試驗動物的臨床表現(xiàn)，測量體溫，如試驗動物死亡則立即進行剖殺，觀察呼吸道病變病采集病料。于15d試驗結束時，剖殺所有試驗動物。

試驗組動物在接種支原體24h后表現(xiàn)出呼吸道分泌物增多、咳嗽等癥狀，體溫升高，不食，反芻停止，7天后死亡1頭，10天后死亡2頭。對照組動物在試驗期間體溫正常且無明顯的呼吸道癥狀。試驗結束后剖殺試驗組動物，同時剖殺4頭對照組動物。采集病料，進行支原體分離。試驗組剖檢胸膜有大量纖素樣滲出，肺隔葉部分出現(xiàn)肉樣實變，胸腔積液。對照組剖檢均未發(fā)生明顯的病理變化，對照組的4份病料均未分離到支原體，試驗組的4份病料中均分離到牛支原體，菌落形態(tài)表現(xiàn)為“煎荷包蛋樣”，pcr鑒定結果與hnmb1一致。

實施例2、疫苗的制備、安全性和效力試驗

2.1疫苗的制備

將牛支原體菌株hnmb1接種到pplo液體培養(yǎng)基，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后收取培養(yǎng)物，測定濃度，調整培養(yǎng)物中的菌數(shù)為2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至終濃度為0.2％，于37℃滅活12h。滅活后的培養(yǎng)物按體積比1:1加入氫氧化鋁佐劑，混合制得牛支原體滅活疫苗。

2.2疫苗的安全性試驗：

選取60日齡健康黑白花奶牛10頭，分為2組，每組5頭。疫苗組：頸部肌肉注射10ml本疫苗；對照組：頸部肌肉注射10ml滅菌生理鹽水。觀察30天。觀察期間，疫苗組和對照組的奶牛均健康活潑，早晚體溫、采食量差異均不顯著，說明本發(fā)明的滅活疫苗安全。

2.3疫苗的效力試驗

選取30日齡健康黑白花奶牛30頭，分為6組，每組5頭。具體為：疫苗1-4組：每組分別注射本疫苗0.5ml、1ml、1.5ml和2ml，第5組為未免疫組，第6組為健康對照組，注射2ml滅菌生理鹽水。疫苗組和健康對照組60日后二免注射同等劑量的疫苗或滅菌生理鹽水。二免后1個月各組用10⁹cfu的hnmb1采取氣管注射的攻毒方式進行攻毒。攻毒后第2天開始每天采集鼻拭子，第10天開始每3天采一次鼻拭子，鼻拭子過濾后，做固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。在攻毒后10天，40天，結合臨床情況，剖檢實驗動物，采集喉拭子，肺臟等器官進行牛支原體分離培養(yǎng)。

觀察結果：疫苗組與未免疫組奶牛有明顯的差異，攻毒后，未免疫組第二天開始出現(xiàn)臨床癥狀，體溫升高，流涕，呼吸困難，減食甚至絕食，反芻停止，7天后開始出現(xiàn)死亡，2周后共死亡4頭。剖檢結果：肺臟與胸腔發(fā)生粘連嚴重，胸腔積液，肺實變。健康對照組的奶牛均未發(fā)病。而疫苗組中，0.5ml疫苗組的5頭奶牛中有2頭出現(xiàn)臨床癥狀和病例變化；1ml疫苗組的5頭奶牛中有1頭出現(xiàn)臨床癥狀和病例變化；1.5ml和2ml疫苗組的5頭奶牛沒有發(fā)病。免疫攻毒保護情況見下表。

注：“—”表示不適用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保護劑量為0.5ml含菌量為1×10⁹cfu/ml。說明本發(fā)明的滅活苗具有良好的保護效果。

以上所述僅為本發(fā)明最佳的實施例，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>一株牛支原體及其應用

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<213>牛支原體（mycoplasmabovis）

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