專利名稱：牛支原體刺激模型及施用牛支原體的方法以及誘導(dǎo)肺炎損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛支原體(Mycoplasma bovis，M.bovis)刺激模型方法以及施用牛支原體、誘導(dǎo)并建立動物中牛支原體引起的疾病或失調(diào)的方法。本發(fā)明的牛支原體刺激模型可用來評價(jià)潛在的疫苗的效價(jià)。
背景技術(shù)：
牛支原體使一種在家養(yǎng)或集中養(yǎng)殖的肉牛和奶牛家畜的致病的重要全球性牛病原體。最常見的報(bào)道的癥狀是牛犢肺炎，常常伴隨關(guān)節(jié)炎，也為肺炎-關(guān)節(jié)炎綜合征。已經(jīng)確證其病因?qū)W作用與母牛和公牛乳腺炎、耳炎和生殖性疾病或失調(diào)相關(guān)。牛支原體誘導(dǎo)的呼吸疾病引起重要的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)知道由于牛的呼吸疾病(BRD)，牛支原體引起多達(dá)36％死亡率。由于目前沒有完全許可的牛支原體疫苗可供使用，為了降低死亡率，常常使用抗生素治療。預(yù)防牛支原體疾病也可降低動物患上其他呼吸疾病。對年輕牛犢有效并安全的牛支原體菌苗對家畜工業(yè)非常有價(jià)值。因此，需要研制誘導(dǎo)明顯的肺損傷以及其他臨床癥狀的可重復(fù)牛支原體刺激模型，以評價(jià)潛在的牛支原體疫苗的效價(jià)。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了可重復(fù)的牛支原體刺激模型以及用來可靠地誘導(dǎo)病建立牛支原體感染引起的疾病或失調(diào)的方法，通過對動物施用有效量的牛支原體培養(yǎng)物。本發(fā)明刺激培養(yǎng)物的施用量足以誘導(dǎo)牛支原體特異的細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)。一方面，所述動物為牛犢。本發(fā)明的牛支原體刺激模型可用來評價(jià)潛在疫苗的效價(jià)。
本發(fā)明還提供了一種制備牛支原體刺激培養(yǎng)物的方法，該方法包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)分離的牛支原體以達(dá)到足夠的活菌計(jì)數(shù)，以及用于實(shí)驗(yàn)性地將培養(yǎng)物施用到動物以引起肺炎損傷以及疾病的臨床癥狀的方法。
附圖簡述

圖1為接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激之前和之后的組平均體溫曲線圖。與未刺激的對照動物(處理組D)相比，牛支原體刺激牛犢(處理組A和C)在第1天～第20天具有較高的平均體溫。與組D(未刺激對照動物)相比，組B刺激的牛犢在第3天～第5天，第7天～第14天以及第17天具有較高的平均體溫。
圖2為接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激之前和之后的組平均體溫曲線圖。與未刺激對照動物(處理組B)相比，牛支原體刺激牛犢(處理組A)在第15、17和18天具有較高的平均體溫。
圖3為接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激之前和之后的組平均體溫曲線圖。與未刺激的對照動物(處理組D)相比，牛支原體刺激的牛犢(處理組B和C)在第4天～第21天具有較高的平均體溫。與組D(未刺激d對照動物)相比，組A刺激的牛犢在第7天～第21天具有較高的平均體溫。
圖4為接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激第3天～第20天的組平均體溫曲線圖。與安慰劑刺激組(處理組D)相比，施用2劑牛支原體菌苗的牛犢(處理組A和C)以及組E中的動物(未刺激的對照動物)在第7天～第20天具有較低的平均體溫。與安慰劑刺激組(處理組D)相比，處理組B中的接種牛犢在7天～第12天以及第14天～第20天具有較低的平均體溫。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括刺激模型以及在動物中誘導(dǎo)由牛支原體感染引起的疾病或失調(diào)的方法，該方法包括對動物施用有效量的牛支原體培養(yǎng)物。本發(fā)明包括制備和施用牛支原體培養(yǎng)物的方法。牛支原體株實(shí)例為ATCC25025(由R.G.Wittler在1968年10月8日保藏)、25523(由R.G.Wittler在1969年10月22日保藏)和27368(由R.G.Wittler在1972年7月5日保藏)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，刺激培養(yǎng)物的牛支原體分離物包括一或多種下列菌株2300(ATCCPTA-3558)、3625(ATCC PTA-3559)、16150(ATCC PTA-3560)、20518(ATCCPTA-3561)或5063。
本發(fā)明包括任何可用作有效的刺激培養(yǎng)物的牛支原體分離物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，牛支原體分離物在Beg4培養(yǎng)基中生長直至達(dá)到足夠的細(xì)胞密度，并且施用有效量后可以誘導(dǎo)動物出現(xiàn)肺炎損傷以及疾病的臨床癥狀。牛支原體株2300(ATCC PTA-3558)、3625(ATCC PTA-3559)、16150(ATCCPTA-3560)、20518(ATCC PTA-3561)以及5063分離物的保藏符合theBudapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purpose of Patent Procedure，with the American TyPeCell Collection，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209.
為了使公開更清楚，但不以被限制的方式，本發(fā)明的詳細(xì)描述將分成下述幾個(gè)小節(jié)，后者描述或舉例說明本發(fā)明的特征、實(shí)施方案或應(yīng)用。
定義及縮寫種名之前的縮寫M.，指支原體屬。
這里使用的與牛支原體感染相關(guān)的術(shù)語“疾病或失調(diào)”指引起牛支原體細(xì)菌的復(fù)制、誘導(dǎo)牛支原體脫落或傳播，或在其宿主中建立牛支原體感染，并引起出現(xiàn)牛支原體感染的癥狀。如果出現(xiàn)細(xì)菌滴度增加、肺部感染增加、肺損傷增加、臨床癥狀增加，即結(jié)腸溫度上升和/或體重下降和/或生長放緩，就認(rèn)為刺激模型是有效的。本發(fā)明方法可有效用來，例如，在動物特別是在家畜中誘導(dǎo)肺炎、呼吸感染以及肺損傷、增加肺中牛支原體的水平、增加溫度、減輕體重增加。本發(fā)明還包括對動物并優(yōu)選家畜有效量的牛支原體刺激培養(yǎng)物的施用，將在所述動物中誘導(dǎo)失調(diào)包括肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、耳炎以及生殖性失調(diào)。
這里使用的術(shù)語″牛支原體刺激培養(yǎng)物″指可用于產(chǎn)生牛支原體感染引起的失調(diào)或疾病的培養(yǎng)物。牛支原體培養(yǎng)物可包括任何有效的能引起家畜感染牛支原體的培養(yǎng)物?？捎糜诒景l(fā)明的牛支原體培養(yǎng)物可包括，例如，新鮮的、凍存的或冰凍的牛支原體細(xì)胞制劑。
這里使用的術(shù)語″牛支原體刺激模型″指一種施用牛支原體培養(yǎng)物的方法，該培養(yǎng)物可用來產(chǎn)生牛支原體感染引起的失調(diào)或疾病。牛支原體刺激模型可包括任何施用方法，所述方法有效地引起家畜感染牛支原體?？捎糜诒景l(fā)明的施用方法可包括，例如，經(jīng)口、鼻內(nèi)、口鼻(oranasal)、局部、透皮、氣溶膠以及腸胃外(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))。
這里使用的術(shù)語″動物″指所有的非人動物，包括哺乳動物。
這里使用的術(shù)語″家畜″指牛類動物，包括但不限于食用牛、公牛、母牛和牛犢。優(yōu)選地，本發(fā)明方法用于非人哺乳動物的動物，更優(yōu)選地，牛犢。
術(shù)語″有效量″指牛支原體培養(yǎng)物的量足以在施用的對象中誘導(dǎo)或建立疾病。牛支原體刺激培養(yǎng)物的有效量指，例如，刺激培養(yǎng)物引起支原體肺炎。
術(shù)語″牛支原體疫苗″這里使用的指可用于預(yù)防或治療牛支原體感染引起的失調(diào)或疾病的疫苗。牛支原體疫苗可包括有效治療或預(yù)防家畜感染烈性牛支原體的任何疫苗?？捎糜诒景l(fā)明的牛支原體疫苗可包括，例如，全或部分的牛支原體細(xì)胞制劑、滅活的或修飾的活疫苗、具有一或多種牛支原體衍生多肽或蛋白的亞基疫苗、或所述蛋白或多肽的免疫源性片段，或編碼一或多種牛支原體衍生多肽或蛋白的一或多種牛支原體基因或核酸，或其免疫源性片段，并且該基因或核酸能在家畜體內(nèi)表達(dá)。牛支原體多肽、蛋白、所述多肽和蛋白的免疫片段，或牛支原體基因或核酸可用本技術(shù)領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行合成或重組的方法進(jìn)行制備。
這里使用的術(shù)語″佐劑″，為免疫反應(yīng)的增效劑。適當(dāng)?shù)淖魟┛瓢?，但不限于礦物凝膠，如氫氧化鋁、表面活性劑如溶血卯磷脂；糖苷，如，皂甙衍生物如Quil A或GPI-0100；陽離子表面活性劑如DDA、聚醚多羥基化合物；聚陰離子；非離子性嵌段共聚物，如聚醚F-127(B.A.S.F.，USA)；肽；礦物油，如Montanide ISA-50(Seppic，Paris，F(xiàn)rance)，carbopol，Amphigen(Hydronics Omaha，NE.USA)，Alhydrogel(Superfos Biosector，F(xiàn)rederikssund，Denmark)油乳劑如礦物油的乳劑如Bayol F/Arlacel A和水，或植物油、水以及乳化劑如卵磷脂的乳劑；明礬、膽固醇、細(xì)胞因子以及佐劑的組合。免疫源可摻入到脂肪體中或偶聯(lián)到多糖和/或其他聚合物上以用于疫苗配制。
刺激培養(yǎng)物本發(fā)明提供了牛支原體刺激模型以及制備和施用牛支原體刺激培養(yǎng)物的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)牛支原體分離物以達(dá)到足夠的細(xì)胞密度；以及實(shí)驗(yàn)性地將培養(yǎng)物施用給動物以誘導(dǎo)肺損傷以及疾病的臨床癥狀的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，牛支原體從肺組織分離得到。在另一個(gè)實(shí)施方案中，牛支原體從淋巴節(jié)組織分離得到。已知本領(lǐng)域有許多培養(yǎng)基并包括Friis、Beg4、Hayflick′s以及MHP。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，刺激培養(yǎng)物的牛支原體分離物包括一或多種下列菌株2300、3625、16150、20518或5063。
牛支原體分離物的生長條件可依據(jù)培養(yǎng)基成分以及生長的特定分離物而定。但是，分離物通常按下列方式進(jìn)行培養(yǎng)。將分離物的凍存小瓶快速解凍或?qū)龈傻男∑吭賾腋≡?～10ml的Beg4培養(yǎng)基中。用0.1％～30％的牛支原體接種液接種無菌Beg4培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)物在30℃～40℃培養(yǎng)12～約72小時(shí)，從培養(yǎng)時(shí)間～富集時(shí)間計(jì)量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，牛支原體培養(yǎng)物在37℃生長24～48小時(shí)。對每一刺激天，配制單獨(dú)的刺激接種體。在刺激的每天，活菌計(jì)數(shù)，刺激培養(yǎng)物的菌落形成單位(CFU)按照下列方式測定，在Beg4培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)稀釋并將各連續(xù)稀釋在Heart InfusionAgar(HIA)瓊脂板上進(jìn)行鋪板。然后將HIA板在37℃培養(yǎng)48～168小時(shí)，優(yōu)選地120小時(shí)，并測定菌落數(shù)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
可將得到的牛支原體刺激培養(yǎng)物濃縮。本領(lǐng)域多種已知技術(shù)可用來濃縮所述的有機(jī)體。例如，有機(jī)體可通過下列方式進(jìn)行濃縮，如離心、超速離心，或通過過濾如超濾。然后用本領(lǐng)域已知的方法回收濃縮的牛支原體培養(yǎng)物。刺激培養(yǎng)物液可以用前述方法的改進(jìn)方法進(jìn)行制備，這對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是很易知道的。
可用于本發(fā)明的牛支原體培養(yǎng)物可包括，例如，新鮮、凍存、凍干的牛支原體細(xì)胞制劑。
牛支原體分離物也可從感染的家畜肺損傷處利用已知的技術(shù)直接得到。也可利用已知的技術(shù)從感染家畜的下列組織處直接牛支原體分離物鼻腔、氣管、肺灌洗流體、淋巴節(jié)、肝、脾、腎、心臟、血液以及關(guān)節(jié)。
給藥、施用方式以及處理根據(jù)本發(fā)明，對動物并優(yōu)選地約3～28周齡的牛犢施用至少一劑有效量的牛支原體培養(yǎng)物以引起牛支原體感染。優(yōu)選地，牛支原體培養(yǎng)物連續(xù)施用3天。每刺激劑的有效量牛支原體刺激培養(yǎng)物含約1×106～約5×1011菌落形成單位(CFU)。優(yōu)選地，提供充分疾病的牛支原體刺激培養(yǎng)物含約1×108～約1×1011CFU/劑，并更優(yōu)選地，約1×1010～約5×1011CFU/劑。根據(jù)本發(fā)明，牛支原體感染可被可重復(fù)性地誘導(dǎo)，并且在約1～49天在家畜中形成臨床疾病。優(yōu)選地，牛支原體臨床疾病在約1～21天可重復(fù)性地形成并更優(yōu)選地在約1～14天形成。
根據(jù)本發(fā)明，施用的牛支原體刺激培養(yǎng)物的有效量為約0.5～約30.0ml，優(yōu)選地約5ml～約20ml，并更優(yōu)選地，約10～12ml。
根據(jù)本發(fā)明，施用可用已知的途徑實(shí)現(xiàn)，包括經(jīng)口、鼻內(nèi)、口鼻、局部、透皮、氣溶膠以及胃腸外(如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))。優(yōu)選的給藥途徑是鼻內(nèi)給藥。
本發(fā)明可包括單劑刺激方法，該方法消去了對牛犢施用另外刺激劑的必要性，施用另外劑的目的在于產(chǎn)生牛支原體誘導(dǎo)疾病。
根據(jù)本發(fā)明，對約3～28周齡的牛犢施用有效量的牛支原體刺激，提供了有效的呼吸感染，包括肺炎、肺中牛支原體水平增加、體溫上升以及體重增加下降。刺激培養(yǎng)物中牛支原體的量，即約1×106～約5×1011，被首次證實(shí)在約1～49天可在家畜中可靠地并可重復(fù)地誘導(dǎo)感染并形成臨床疾病。
本發(fā)明提供了一種在牛犢中進(jìn)行牛支原體感染的方法，包括對牛犢施用至少一劑，并優(yōu)選地3個(gè)刺激劑的培養(yǎng)物以引起牛犢的牛支原體感染。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，刺激培養(yǎng)物經(jīng)鼻內(nèi)施用。并且，優(yōu)選地刺激劑包括約10～12ml的培養(yǎng)物，每ml包含約1.0×109牛支原體菌落形成單位。合適地用刺激培養(yǎng)物對牛犢連續(xù)施用3天。
本發(fā)明還包括對動物并優(yōu)選地家畜施用有效量的牛支原體刺激培養(yǎng)物以在該動物中引起失調(diào)包括但不限于肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、耳炎以及生殖性失調(diào)。
實(shí)施例本發(fā)明將通過下列實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的舉例說明。
實(shí)施例1材料和方法動物健康雜種奶牛或肉牛牛犢用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)刺激。各實(shí)驗(yàn)開始之前，使牛犢適應(yīng)環(huán)境至少7天。所有的牛犢每天接受濃縮的未加藥食物，不包含任何已知的污染物或殺蟲劑并自由飲水。
刺激方法每頭牛犢經(jīng)鼻內(nèi)途徑連續(xù)三天接受10～20ml的新鮮牛支原體培養(yǎng)物[約1×108～1×1010菌落形成單位(CFU/ml)]。每次實(shí)驗(yàn)刺激結(jié)束后，立即測定刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)。刺激培養(yǎng)物的活菌計(jì)數(shù)按下列方式測定在Beg4培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)稀釋并將各連續(xù)稀釋樣品在HIA瓊脂板上進(jìn)行鋪板。然后將HIA板在37℃培養(yǎng)120小時(shí)并測定菌落數(shù)以進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
實(shí)驗(yàn)過程用獨(dú)特的耳標(biāo)記數(shù)確定每頭牛犢。動物根據(jù)年齡隨機(jī)分組成圈養(yǎng)組和處理組。
在刺激前1天、刺激后第7天、刺激后第14天以及刺激后的約第3周稱重所有動物。
刺激前1天、剛要刺激前以及刺激后連續(xù)20天的每天清晨測量結(jié)腸溫度。
從每頭牛犢的頸靜脈采集血樣。牛犢在刺激前1天、刺激后第7天、刺激后第14天采血，并檢驗(yàn)尸體(刺激后約3周)。從各血樣分離的血清在-20℃凍存直至用牛支原體ELISA kit(Chekit M bovis Sero)進(jìn)行評價(jià)，該試劑盒由Bommeli AG(Hoechst Roussel Vet Diagnostics，Liebefeld-Bern，Switzerland)制備。ELISA板利用Multiscan reader在405nm進(jìn)行讀數(shù)。光密度(OD)值轉(zhuǎn)換成相對于陽性對照血清OD的百分比，利用下式計(jì)算百分比＝(樣品OD-陰性血清OD)/(陽性血清OD-陰性血清OD)×100。低于60％的值認(rèn)為為陰性。百分比在60～80％的血清認(rèn)作可疑樣品，OD顯示大于80％的血清認(rèn)作陽性。
所有的動物在實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后約3周接受尸體檢查。將牛犢實(shí)施無痛處死并對所有的主要器官，但不包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行檢查。
取出肺并評價(jià)牛支原體感染的特征性損傷。損傷依照標(biāo)準(zhǔn)肺圖標(biāo)進(jìn)行判分。利用下列各肺葉對總肺重的比率，稱重各肺葉百分涉及部分。

總計(jì)稱重的肺葉值以測定總肺與總損傷的百分比(Pointon等，1992)。此外，下式可用來計(jì)算百分百分肺損傷(損傷)下降。

此外，各肺用50ml的PBS灌洗。進(jìn)行了從支氣管灌洗液中分離并測定活菌牛支原體計(jì)數(shù)的嘗試。牛支原體活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)按下列方式測定配制合適的支氣管灌洗液連續(xù)稀釋液并將樣品鋪板到合適的瓊脂培養(yǎng)基上。
實(shí)施例2在該實(shí)施例中，在年輕牛犢中評價(jià)了不同牛支原體的刺激方法。得到24頭健康的雜種的奶牛牛犢(Holstein/Friesian cross)，約7周齡，對牛支原體無母源性抗體，并根據(jù)年齡隨機(jī)分組，如表1中顯示。開始研究之前，使所有牛犢適應(yīng)周圍環(huán)境。
表1.
實(shí)驗(yàn)處理組

牛犢在約10周齡時(shí)按照上述描述接受刺激。每頭牛犢連續(xù)2或3天接受10ml(每鼻孔5ml)的牛支原體株5063的新鮮培養(yǎng)物。通過面罩用肉湯培養(yǎng)物氣溶膠刺激組A和B中的動物。利用簡單的噴霧裝置(Genesis Industries，Elmwood，WI)刺激組C牛犢，組D動物作為未刺激的對照牛犢。
在每次牛支原體實(shí)驗(yàn)刺激結(jié)束后1小時(shí)內(nèi)測定刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)。結(jié)果顯示在表2中。
表2.
牛支原體刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)

在刺激之前1天、刺激后第7天、刺激后第14天以及接受實(shí)驗(yàn)用牛支原體刺激后第20天，對動物稱重。結(jié)果總結(jié)在表3中。與未刺激的對照動物(處理組D)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激(處理組A、B和C)的牛犢的體重下降。
表3.
實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后體重總結(jié)平均體重(kg)±標(biāo)準(zhǔn)差

在刺激之前第3天、第2天及第1天、剛要刺激之前、接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后連續(xù)19天的每天清晨，測量結(jié)腸溫度，結(jié)果總結(jié)在圖1中。當(dāng)與未刺激的對照動物(處理組D)相比，牛支原體刺激的牛犢(處理組A和C)顯示出臨床癥狀，即在第1天～第20天具有較高的平均體溫。當(dāng)與組D(未刺激的對照動物)相比，組B刺激的牛犢在第3天～第5天、第7天～第14天以及第17天具有較高的平均體溫。
牛支原體特異的血清抗體反應(yīng)(IgG)總結(jié)在表4中。血清樣品與陽性對照血清的百分光密度(OD)值＞0.80的樣品認(rèn)為牛支原體陽性。實(shí)驗(yàn)刺激之前，所有的牛犢為牛支原體陰性。接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激的牛犢(處理組A、B和C)在接受牛支原體刺激后第20天為血清陽性。處理組D動物(未刺激對照動物)在該研究中基本上為陰性。
表4.
牛支原體血清抗體(IgG)的總結(jié)光密度值對陽性對照血清的百分比平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

所有動物在實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第20天進(jìn)行尸體檢查。取出肺并總體評價(jià)牛支原體感染的特征性損傷。百分肺損傷判分總結(jié)在表5中。當(dāng)與未刺激的對照動物(處理組D)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激的牛犢(處理組A、B和C)具有較高的百分肺損傷判分。這些結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激能誘導(dǎo)牛支原體感染的特征性肺損傷。
表5.百分肺損傷評分總結(jié)平均權(quán)重百分比±標(biāo)準(zhǔn)差

每只肺用50ml的PBS灌洗。實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第20天從支氣管灌洗樣品分離的牛支原體結(jié)果總結(jié)在表6中。當(dāng)與未刺激對照動物(處理組D)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激牛犢(處理組A、B和C)的肺灌洗樣品中具有增加的活菌牛支原體發(fā)生率。
表6.肺灌洗液中分離出的牛支原體的總結(jié)

總之，當(dāng)與未刺激對照動物(處理組D)相比，接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激的牛犢(處理組A、B和C)顯示出肺損傷、具有增加的結(jié)腸溫度、體重增加下降、從肺灌洗樣品分離的活菌牛支原體發(fā)生率上升。結(jié)果表明在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)刺激后，牛支原體培養(yǎng)物能誘導(dǎo)血清學(xué)反應(yīng)并能誘導(dǎo)牛支原體感染的特征性肺損傷。
實(shí)施例3在該實(shí)施例中，在5～7月齡牛犢中評價(jià)牛支原體刺激模型。使用22頭健康的雜種奶?；蛉馀Ｅ伲s4周齡，對牛支原體無母源性抗體，并根據(jù)年齡隨機(jī)分組，如表7中所示。在開始研究之前使所有牛犢適應(yīng)環(huán)境。
表7.
實(shí)驗(yàn)處理組

牛犢在約在5～7月齡接受按照上述描述方法進(jìn)行的刺激。組A中牛犢接受20ml(每鼻孔10ml)的牛支原體株5063新鮮培養(yǎng)物，連續(xù)3天，并利用簡單的噴霧裝置(Genesis Industries，Elmwood，WI)進(jìn)行刺激。動物組B作為未刺激的對照牛犢。
每次牛支原體實(shí)驗(yàn)刺激之后1小時(shí)內(nèi)測定刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)。結(jié)果顯示在表8中。
表8.
牛支原體刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)

在刺激前1天以及接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第21天，對所有動物稱重。結(jié)果總結(jié)在表9中。當(dāng)與未刺激對照動物(處理組B)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激牛犢(處理組A)具有類似的體重增加。
表9.實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后體重的總結(jié)平均體重(kg)±標(biāo)準(zhǔn)差

刺激前1天、剛要刺激前以及接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后連續(xù)21天的每天清晨測量結(jié)腸溫度。結(jié)果總結(jié)在圖2中。當(dāng)與未刺激的對照動物(處理組B)相比，牛支原體刺激的牛犢(處理組A)在第15、17和18天顯示出臨床癥狀，即較高的平均體溫。
牛支原體特異的血清抗體反應(yīng)(IgG)總結(jié)在表10中。血清樣品與陽性對照血清的百分光密度(OD)值＞0.80的樣品認(rèn)為牛支原體陽性。實(shí)驗(yàn)刺激之前，所有的牛犢為牛支原體陰性。接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激的牛犢(處理組A)在接受牛支原體刺激后第21天為血清陽性。處理組B動物(未刺激對照動物)在第21天為陰性。
表10.
牛支原體血清抗體(IgG)總結(jié)光密度值與陽性對照血清的平均百分比±標(biāo)準(zhǔn)差

所有動物在實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第21天進(jìn)行尸體檢查。取出肺并總體評價(jià)牛支原體感染的特征性損傷。百分肺損傷判分總結(jié)在表11中。當(dāng)與未刺激的對照動物(處理組B)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激的牛犢(處理組A)具有較高的百分肺損傷判分。這些結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激能誘導(dǎo)牛支原體感染的特征性肺損傷。
表11.
百分肺損傷判分總結(jié)平均權(quán)重百分比±標(biāo)準(zhǔn)差

每只肺用50ml的PBS灌洗。實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第20天從支氣管灌洗樣品分離的牛支原體結(jié)果總結(jié)在表12中。當(dāng)與未刺激對照動物(處理組B)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激牛犢(處理組A)的肺灌洗樣品中具有增加的活菌牛支原體發(fā)生率。
表12.
從肺灌洗液分離的牛支原體總結(jié)

總之，當(dāng)與未刺激對照動物(處理組B)相比，接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激的牛犢(處理組A)顯示出肺損傷、在刺激后第15、17和18天具有增加的結(jié)腸溫度、體重增加下降、從肺灌洗樣品分離的活菌牛支原體發(fā)生率上升。結(jié)果表明在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)刺激后，牛支原體培養(yǎng)物能誘導(dǎo)血清學(xué)反應(yīng)并能誘導(dǎo)牛支原體感染的特征性肺損傷。
實(shí)施例4在該實(shí)施例中，在年輕牛犢中評價(jià)牛支原體刺激模型。使用24頭健康的雜種奶牛牛犢(Holstein/Friesian cross)，約6周齡，對牛支原體無母源性抗體，并根據(jù)年齡隨機(jī)分組，如表13中所示。在開始研究之前使所有牛犢適應(yīng)環(huán)境。
表13.
實(shí)驗(yàn)處理組

牛犢在約9月齡接受按照上述描述方法進(jìn)行的刺激。組A、B、C中的每只牛犢接受12ml(每鼻孔6ml)的牛支原體株的新鮮培養(yǎng)物，連續(xù)3天，并利用簡單的噴霧裝置(Genesis Industries，Elmwood，WI)進(jìn)行刺激。動物組D作為未刺激的對照牛犢。
每次牛支原體實(shí)驗(yàn)刺激之后1小時(shí)內(nèi)測定刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)。結(jié)果顯示在表14中。
表14.
牛支原體刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)

在刺激前1天以及接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第21天，對所有動物稱重。結(jié)果總結(jié)在表15中。當(dāng)與未刺激對照動物(處理組D)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激牛犢(處理組A、B和C)體重下降。
表15.
實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后體重總結(jié)平均體重(kg)±標(biāo)準(zhǔn)差

刺激前1天、剛要刺激前以及接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后連續(xù)21天的每天清晨測量結(jié)腸溫度。結(jié)果總結(jié)在圖3中。與未刺激的對照動物(處理組D)相比，牛支原體刺激的牛犢(處理組B和C)在第4天～第21天顯示出臨床癥狀，即較高的平均體溫。與未刺激的對照動物(處理組D)相比，牛支原體刺激的牛犢(處理組A)在第7天～第21天顯示出較高的平均體溫。
牛支原體特異的血清抗體反應(yīng)(IgG)總結(jié)在表16中。血清樣品與陽性對照血清的百分光密度(OD)值＞0.80的樣品認(rèn)為牛支原體陽性。實(shí)驗(yàn)刺激之前，所有的牛犢為牛支原體陰性。接受牛支原體菌株5063、3625或16150刺激培養(yǎng)物的牛犢(處理組A、B和C)在接受牛支原體刺激后第20天具有血清反應(yīng)。處理組D動物(未刺激對照動物)在第20天為陰性。
表16.
牛支原體血清抗體(IgG)的總結(jié)光密度值相對對照血清的平均百分比±標(biāo)準(zhǔn)差

所有動物在實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第21天進(jìn)行尸體檢查。取出肺并總體評價(jià)牛支原體感染的特征性損傷。百分肺損傷判分總結(jié)在表17中。當(dāng)與未刺激的對照動物(處理組D)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激的牛犢(處理組A、B和C)具有較高的百分肺損傷判分。這些結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激能誘導(dǎo)牛支原體感染的特征性肺損傷。
表17.
百分肺損傷判分總結(jié)平均權(quán)重百分比±標(biāo)準(zhǔn)差

實(shí)施例5在該實(shí)施例中，在牛支原體刺激模型中評價(jià)多種牛支原體菌苗的效價(jià)。使用66頭健康的雜種奶牛牛犢(Holstein/Friesian cross)，約14周齡，對牛支原體無母源性抗體，并根據(jù)年齡隨機(jī)分組所示。在開始研究之前使所有牛犢適應(yīng)環(huán)境1周。
包含BEI滅活的全細(xì)胞牛支原體細(xì)菌的菌苗每劑包含合適的濃度。此外，各菌苗制劑包含磷酸鹽緩沖液(PBS)以及合適的佐劑(參見表18.)。安慰劑含PBS。
動物用2ml的合適菌苗或安慰劑經(jīng)皮下途徑在第0天(左側(cè)頸部)和第21天(右側(cè)頸部)進(jìn)行接種。實(shí)驗(yàn)處理組以及使用的菌苗顯示在表19中。
表18.
實(shí)驗(yàn)處理組

牛犢在約9月齡時(shí)，2次接種后3周接受按照上述描述方法進(jìn)行的刺激(第42天)。用簡單的噴霧裝置(Genesis Industries，Elmwood，WI)，使用肉湯培養(yǎng)物刺激組A、B、C和D中的動物。每頭牛犢接受12ml(每鼻孔6ml)的牛支原體株5063的新鮮培養(yǎng)物，連續(xù)3天。動物組E作為未刺激的對照牛犢。
每次牛支原體實(shí)驗(yàn)刺激之后1小時(shí)內(nèi)測定刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)。結(jié)果顯示在表19中。
表19.
牛支原體刺激接種體的活菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)

在刺激前1天、刺激后第7天、刺激后第14天以及接受實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第20天，對所有動物稱重。結(jié)果總結(jié)在表20中。與刺激對照組(處理組D)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激牛犢(處理組A、B和C)以及組E中的動物的體重增加。
表20.
實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后體重總結(jié)平均體重(kg)±標(biāo)準(zhǔn)差


請確認(rèn)處理組D的體重增加數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后的第3天～第20天的每天清晨，測量結(jié)腸溫度。結(jié)果總結(jié)在圖4中。與刺激對照組(處理組D)相比，施用2劑牛支原體疫苗(處理組A和C)的牛犢以及組E中的動物(未刺激對照動物)在第7天～第20天顯示出臨床癥狀，即下降的平均體溫。與刺激照組(處理組D)相比，處理組B中的接種牛犢在第7天～第12天以及第14天～第20天具有下降的平均體溫。
牛支原體特異的血清抗體反應(yīng)(IgG)總結(jié)在表21中。血清樣品與陽性對照血清的百分光密度(OD)值＞0.80的樣品認(rèn)為牛支原體陽性。接種前，所有的牛犢為牛支原體陰性。接受實(shí)驗(yàn)用牛支原體菌苗的牛犢(處理組A、B和C)在第二次接種之前使牛支原體血清陽性的，并在該研究中保持血清陽性。處理組E動物(未刺激對照動物)在整個(gè)研究中為血清陰性。
表21.
牛支原體血清抗體(IgG)的總結(jié)光密度值對陽性對照血清的平均百分比±標(biāo)準(zhǔn)差

所有動物在實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第20天進(jìn)行尸體檢查。取出肺并總體評價(jià)牛支原體感染的特征性損傷。百分肺損傷判分以及肺損傷百分下降總結(jié)在表22中。與刺激的對照動物(處理組D)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體疫苗的牛犢(處理組A、B，和C)以及組E中的動物(未刺激對照動物)具有下降的百分肺損傷判分。這些結(jié)果證實(shí)2劑的實(shí)驗(yàn)牛支原體菌苗能在接受實(shí)驗(yàn)刺激的牛犢中誘導(dǎo)作用。
表22.
百分肺損傷判分的總結(jié)平均權(quán)重百分比±標(biāo)準(zhǔn)差

每只肺用50ml的PBS灌洗。實(shí)驗(yàn)牛支原體刺激后第20天從支氣管灌洗樣品分離的牛支原體結(jié)果總結(jié)在表23中。與刺激的對照牛犢(處理組D)相比，施用實(shí)驗(yàn)牛支原體疫苗的牛犢(處理組A、B和C)以及組E中的動物(未刺激的對照動物)的肺灌洗樣品中具有下降的活菌牛支原體發(fā)生率。
表23.
肺灌洗液分離的牛支原體的總結(jié)

請確認(rèn)處理組B的cfu/ml數(shù)據(jù)?？傊?，與刺激的對照動物(處理組D)相比，接受實(shí)驗(yàn)牛支原體菌苗的牛犢(處理組A、B和C)以及組E中的動物(未刺激的對照動物)顯示較輕的肺損傷、具有下降的結(jié)腸溫度、增加的體重增加以及從肺灌洗樣品中分離出的活菌牛支原體水平下降。結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)刺激模型體系中，2劑的牛支原體菌苗能誘導(dǎo)血清反應(yīng)并對牛支原體的感染具有保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種在動物中誘導(dǎo)疾病或失調(diào)的方法，包括施用有效量的牛支原體培養(yǎng)物，并判斷所述疾病的臨床癥狀。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病或失調(diào)選自肺炎、呼吸感染、肺損傷、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、耳炎以及生殖性失調(diào)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述動物選自食用牛、公牛、母牛以及牛犢。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述動物為母牛。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述動物為牛犢。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述有效量的牛支原體培養(yǎng)物包括約1×106～約5×1011菌落形成單位(CFU)每刺激劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述有效量的牛支原體培養(yǎng)物包括約1×108～約1×1011CFU/劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述有效量的牛支原體培養(yǎng)物包括約1×1010～約5×1011CFU/劑。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病臨床癥狀包括肺中牛支原體水平增加、溫度升高或體重下降。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述溫度升高為結(jié)腸溫度。
11.一種評價(jià)對抗牛支原體疫苗的方法，包括a.對第一頭動物施用牛支原體疫苗；b.用有效量的牛支原體刺激培養(yǎng)物刺激該動物；c.用有效量的牛支原體刺激培養(yǎng)物刺激第二頭動物；d.判斷所述牛支原體引起的疾病的臨床癥狀；以及e.將所述第一頭動物中疾病的臨床癥狀與第二頭動物中疾病的臨床癥狀進(jìn)行比較。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的刺激培養(yǎng)物包括約1×106～約5×1011菌落形成單位(CFU)每刺激劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的刺激培養(yǎng)物包括約1×108～約1×1011CFU/劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的刺激培養(yǎng)物包括約1×1010～約5×1010CFU/劑。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述疾病的臨床癥狀包括肺中牛支原體水平增加、溫度升高或體重下降。
全文摘要
本發(fā)明提供了可重復(fù)的牛支原體刺激模型和方法，以可靠地誘導(dǎo)并建立牛支原體感染引起的疾病或失調(diào)，通過向動物施用有效量的牛支原體培養(yǎng)物。本發(fā)明刺激培養(yǎng)物的施用量足以引起牛支原體特異的細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)。本發(fā)明的牛支原體刺激模型可用來評價(jià)潛在的疫苗的效價(jià)。
文檔編號G01N33/68GK1571633SQ02820385
公開日2005年1月26日 申請日期2002年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月28日
發(fā)明者羅賓·L·凱奇, 拉茲洛·P·斯蒂普科維茨 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司