本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于gpc1mrna表達(dá)的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來明顯上升。5年生存率<1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。手術(shù)是惟一可能根治的方法，但因胰腺癌的早期診斷困難，手術(shù)切除率低，術(shù)后五年生存率也低。因此，針對胰腺癌的治療，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期生物標(biāo)記對治愈肺腺癌和提高治療效果具有非常重要的意義。
gpc是一類由蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)組成的復(fù)雜的復(fù)合物，屬硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，在細(xì)胞的識別、黏附和生長中發(fā)揮重要的作用。其家族有g(shù)pc1～gpc6六個(gè)成員，都是通過糖基-磷脂酞基肌醇(gp1)錨定在細(xì)胞膜上。家族中的gpc-1與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。kleef等研究顯示，gpc-1在正常胰腺組織和慢性胰腺炎組織中不表達(dá)或呈低表達(dá)，而在胰腺癌細(xì)胞以及鄰近的成纖維細(xì)胞中呈高表達(dá)。duan等通過免疫組化方法對62例胰腺癌組織研究發(fā)現(xiàn)gpc-1能促進(jìn)胰腺癌神經(jīng)導(dǎo)管浸潤。
2015年，根據(jù)德克薩斯大學(xué)md安德森癌癥中心的一項(xiàng)研究表明，存在于癌癥外泌體（exosomes）上的gpc1基因編碼蛋白，或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來檢測有可能尚處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌。這項(xiàng)研究工作發(fā)布在6月24日的《自然》（nature）雜志上。
外泌體（exosomes）是一種直徑在40-100nm的圓形單層膜性小囊泡，可由機(jī)體多種類型細(xì)胞釋放，并廣泛分布于唾液、血漿、乳汁、尿液等體液當(dāng)中。外泌體含有多種蛋白、mrnas、micrornas、信號分子等，能夠反映來源細(xì)胞的許多生物學(xué)性狀。目前，關(guān)于外泌體的研究主要集中在免疫學(xué)和腫瘤學(xué)方面。md安德森癌癥中心從胰腺癌患者血液中分離出富含gpc1的循環(huán)外泌體—gpc1+crexos，并對其進(jìn)行了監(jiān)測。可以從腺癌患者的少量血清中檢測到了gpc1+crexos，這一檢測絕對的特異和敏感，而且能區(qū)分慢性胰腺炎患者與早期和晚期胰腺癌患者。研究還表明，在手術(shù)切除腫瘤后患者體內(nèi)的gpc1+crexos水平顯著下降。
相比常用的ca19-9生物標(biāo)志物，gpc1+crexos可能是一種更可靠的篩查工具。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌小鼠模型還未顯示出mri可以檢測到的胰腺疾病跡象之時(shí)，gpc1+crexos就檢測到了胰腺癌的可能性。
雖然gpc1表達(dá)的臨床意義越來越顯現(xiàn)，gpc1基因表達(dá)水平的檢測適應(yīng)了胰腺癌早期診斷和篩查的需求，對胰腺癌的早發(fā)現(xiàn)早治療具有重要指導(dǎo)意義。但是，目前還沒有可以快速便捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)效的檢測gpc1表達(dá)的試劑盒?；谏鲜鲅芯?，本發(fā)明利用gpc1mrna表達(dá)水平診斷胰腺癌的早期篩查。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的：提供一種能快速、簡便、敏感、特異的檢測gpc1mrna表達(dá)量的試劑盒，采用了特異的gpc1基因特異探針和引物，以及內(nèi)參基因gadph特異探針和引物，結(jié)合熒光pcr檢測技術(shù)可以高靈敏的檢測血液外泌體或腫瘤組織中g(shù)pc1mrna的表達(dá)；使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，具有高準(zhǔn)確性，特異性好，假陽性低；操作簡單安全，檢測廉價(jià)，可以大規(guī)模推廣；檢測速度快，檢測過程大約需要2小時(shí)就可完成。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種用于gpc1mrna表達(dá)檢測的引物包括特異性反轉(zhuǎn)錄引物、q-pcr特異性引物和探針。
所述特異性反轉(zhuǎn)錄引物包括如下序列：
gpc1rt:5’gagcacatttcggcaatagtcag3’
gadph反轉(zhuǎn)錄：5’atacgaccaaatccgttgact3’
所述q-pcr特異性引物如下序列：
gpc1f:5’gtccggaaagtggctcaggt33’
gpc1r:5’ctcccaggcagtgagcacag33’
gapdhf:5’ctctgctcctcctgttcgac3’
gapdhr:5’atggtgtctgagcgatgtgg3’
所述探針包括如下序列：
gpc1taqman:5’-fam-ctcgagagctgtcatgaag-mgb-3’
gapdhtaqman:5’cgtcgccagccga3’
一種用于gpc1mrna表達(dá)檢測的試劑盒，通過所述的檢測試劑盒提取rna樣本，并在rt-pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行rt-pcr反應(yīng)，所述的rt-pcr反應(yīng)體系如下：
10xpcrbuffer稀釋為1x
模板2ul
各引物200-400nm
各探針100-400nm
熱啟動taq酶1u
dntp0.5mm
mgcl22-5mm
總體積20ul。
一種用于gpc1mrna表達(dá)檢測的試劑盒，其中，所述的pcr反應(yīng)的條件如下。
一種用于gpc1mrna表達(dá)檢測的試劑盒，其中，所述的dna樣本來自于新鮮血液樣本。
一種用于gpc1mrna表達(dá)檢測的試劑盒，其中，所述的血漿樣本的重量為10ml。
本發(fā)明檢測gpc1mrna表達(dá)檢測，由于以血漿作為檢測樣本，解決了臨床的腫瘤患者難于獲取組織樣本的現(xiàn)狀；通過檢測gpcmrna的表達(dá)情況，比檢測cpc1蛋白檢測更為靈敏，提高了檢測的靈敏度，降低了非專一性結(jié)合，使得臨床檢測結(jié)果更好判讀。
具體實(shí)施方式
以下進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施例。
一種用于gpcmrna表達(dá)檢測的引物、探針，包括gpc1和gapdh反轉(zhuǎn)錄引物，gpc1檢測引物與探針，所述的gpc1和gapdh引物與探針具體為：
所述特異性反轉(zhuǎn)錄引物包括如下序列：
gpc1rt:5’gagcacatttcggcaatagtcag3’
gadph反轉(zhuǎn)錄：5’atacgaccaaatccgttgact3’
所述q-pcr特異性引物如下序列：
gpc1f:5’gtccggaaagtggctcaggt3’
gpc1r:5’ctcccaggcagtgagcacag3’
gapdhf:5’ctctgctcctcctgttcgac3’
gapdhr:5’atggtgtctgagcgatgtgg3’
所述探針包括如下序列：
gpc1taqman:5’-fam-ctcgagagctgtcatgaag-mgb-3’
gapdhtaqman:5’cgtcgccagccga3’
一種用于gpc1mrna表達(dá)檢測的檢測試劑盒的檢測方法，該方法至少包括如下步驟：
步驟1：根據(jù)cosmic數(shù)據(jù)公布的人類gpc1和gapdh基因的基因序列，針對gpc1和gapdh基因來設(shè)計(jì)引物和探針。通過gpc1和gapdh特異性引物和探針體系優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)高靈敏和特異檢測。
針對選定的gpc1和gapdh序列，應(yīng)用premier6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)多對特異引物和探針。
步驟2：提取檢測樣本的rna，所述的檢測樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織和胸腔液。
步驟3：配制實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系。
步驟4：根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷檢測結(jié)果：熒光信號的收集定為fam，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
步驟5：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行分析和判定。
在所述的步驟2中，還包括如下分步驟：
步驟2.1：取約1×1cm2的各肺癌樣本切片（共約4-5片切片）置于離心管（自備）中，加入1ml二甲苯，蓋緊管蓋，渦旋震蕩10秒。
步驟2.2：12，000rpm（～13，400×g）離心2分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄沉。
步驟2.3：加入1ml無水乙醇，渦旋震蕩混勻；12，000rpm離心2分鐘，棄上清，注意不要吸棄沉淀。
步驟2.4：打開管蓋，室溫或最高至37°c孵育10分鐘，直至無乙醇?xì)埩簟?/p>
步驟2.5：加入150μlbufferpkd，重懸沉淀；加入10μlproteinasek，渦旋震蕩混勻。
步驟2.6：56℃孵育15分鐘，直至樣品完全溶解；80℃孵育15分鐘；短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
步驟2.7：加入320μlbufferrbc，渦旋震蕩徹底混勻。
步驟2.8：將步驟2.7中所得到的溶液全部加入到已裝入收集管（collectiontube2ml）的過濾柱（dnaremovercolumn）中；10，000rpm離心1分鐘，收集濾液。
步驟2.9：在步驟2.8得到的濾液中，加入720μl無水乙醇，渦旋震蕩徹底混勻。
步驟2.10：將步驟2.9中所得的溶液全部加入到已裝入收集管（collectiontube2ml）的吸附柱（spincolumnrs）中；10，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
步驟2.11：向吸附柱中加入500μlbufferrw2，10，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
步驟2.12：12，000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液；將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘以徹底晾干。
步驟2.13：將吸附柱置于一個(gè)新的無rnase離心管（collectiontube1.5ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-50μlrnase-freewater，室溫放置2-5分鐘，10，000rpm離心1分鐘，收集rna溶液，準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
在所述的步驟2.13中，所述的逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系如下：
10xpcrbuffer稀釋為1x
模板2ul
各引物200-400nm
各探針100-400nm
熱啟動taq酶1u
dntp0.5mm
mgcl22-5mm
總體積20ul。
在所述的步驟3中，所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：
pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：
10xpcrbuffer稀釋為1x
dntp0.2mm
模板2ul
各引物200-400nm
熱啟動taq酶1u
mgcl22-5mm
總體積20ul。
所述的pcr反應(yīng)的條件如下：
熒光信號的收集定為fam，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
步驟4：分析圖像后調(diào)節(jié)baseline的start值、end值和閾值線，判定結(jié)果。
反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動保存結(jié)果，分析圖像后調(diào)節(jié)baseline的start值、end值（可自行調(diào)節(jié)，start值可以在3-10之間，end值位于15-20之間，調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線使其平直或低于閾值線）和閾值線（threshold值，可手動調(diào)整至baseline之上）。
ct值及△ct值的確定：用戶根據(jù)實(shí)際情況確定各反應(yīng)管擴(kuò)展曲線升起的拐點(diǎn)處，得到其ct值?！鱟t=gpc1孔fam熒光ct值與參照孔ct值的差值。檢測孔ct值是指樣本檢測孔對應(yīng)的ct值；參照孔ct值是指樣本gapdh對應(yīng)的ct值。
結(jié)果判讀如下：樣本gpc1有s型曲線且△ct值>15時(shí)，gpc1弱表達(dá)；10≤△ct≤15時(shí)，gpc1中表達(dá)；△ct值≤10時(shí)，gpc1強(qiáng)表達(dá)。
所述的rna樣本包括新鮮腫瘤組織或新鮮病理組織或石蠟包埋組織或新鮮血漿。
取樣的所述的gpc1樣本為1克左右。
在所述的步驟5中，還包括如下分步驟：
步驟5.1：運(yùn)行無模板對照（ntc）時(shí)，fam信號無曲線升起，說明實(shí)驗(yàn)無污染存在，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)情況。
步驟5.2：運(yùn)行陽性質(zhì)控品分析，所有陽性質(zhì)控的ct值≤30.0，說明實(shí)驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其ct值也可能會由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動。
步驟5.3：運(yùn)行mix5（ref）的ct值計(jì)算，在fam通道，如果ct值≤42.0，可以繼續(xù)分析；如果ct值>42.0，則說明樣本rna降解嚴(yán)重，不適合實(shí)驗(yàn)需要。
步驟5.4：有效擴(kuò)增曲線的定義及要求：典型擴(kuò)增曲線具有三種典型時(shí)期，早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（升高）和晚起的平臺期，曲線整體形狀呈s型。有效擴(kuò)增曲線至少需要早期背景擴(kuò)增期和中期指數(shù)擴(kuò)增，曲線呈正常s型擴(kuò)增趨勢，方可計(jì)算曲線ct值；其余曲線視為無效曲線，不予計(jì)算。
步驟5.5：在fam通道中運(yùn)行ct的計(jì)算，根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)的ct值及有無擴(kuò)增曲線，判定對應(yīng)位點(diǎn)情況，具體結(jié)果判定結(jié)果為：
結(jié)果判讀如下：樣本gpc1有s型曲線且△ct值>15時(shí)，gpc1弱表達(dá)；10≤△ct≤15時(shí)，gpc1中表達(dá)；△ct值≤10時(shí)，gpc1強(qiáng)表達(dá)。
所述的mrna反轉(zhuǎn)錄cdna的操作方法，包括如下步驟：
步驟1：取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液13μl，superrt逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，加入無菌離心管中，混勻。
步驟2：加入待測樣品rna6μl，rna總量在0.1～5μg范圍內(nèi)至20μl。
步驟3：42°保溫1個(gè)小時(shí)，85°c孵育5分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
步驟4：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于后續(xù)pcr反應(yīng)和熒光定量pcr反應(yīng)。
實(shí)施例1：
利用本發(fā)明體系檢測質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒模板（含gpc1基因），利用上述熒光pcr檢測gpc1基因表達(dá)的方法如下：
（1）質(zhì)粒的處理與提?。?/p>
質(zhì)粒的提取采用tiangen（highpureplasmidkid，dp116）的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取，具體提取操作步驟按試劑盒說明操作。所提dna溶于tris-hcl(10mm,ph8.0),經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測提取質(zhì)量，確定其濃度，然后用tris-hcl(10mm,ph8.0)溶液調(diào)整dna濃度到20ng/ul作為稀釋母液。
根據(jù)公式c拷貝濃度=（c質(zhì)量濃度x6.02x1023）/mwdna稀釋野生型質(zhì)粒為106個(gè)拷貝數(shù)/微升。
(2)建立pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系：
將上述所得cdna模板，用作實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增的模板，按照如下擴(kuò)增體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增
10xpcrbuffer稀釋為1x
dntp0.2mm
模板2ul
各引物200-400nm
各探針100-400nm
熱啟動taq酶1u
mgcl22-5mm
總體積20ul。
實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)條件如下：
熒光信號的收集定為fam，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，按以下步驟進(jìn)行分析、判定：
1、運(yùn)行無模板對照（ntc）時(shí)，fam信號無曲線升起，說明實(shí)驗(yàn)無污染存在，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)情況。
2、運(yùn)行陽性質(zhì)控品分析，所有陽性質(zhì)控的ct值≤30.0，說明實(shí)驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其ct值也可能會由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動。
3、運(yùn)行g(shù)apdh的ct值計(jì)算，在fam通道，如果ct值≤42.0，可以繼續(xù)分析；如果ct值>42.0,則說明樣本rna降解嚴(yán)重，不適合實(shí)驗(yàn)需要。
4、有效擴(kuò)增曲線的定義及要求：典型擴(kuò)增曲線具有三種典型時(shí)期，早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（升高）和晚起的平臺期，曲線整體形狀呈s型。有效擴(kuò)增曲線至少需要早期背景擴(kuò)增期和中期指數(shù)擴(kuò)增，曲線呈正常s型擴(kuò)增趨勢，方可計(jì)算曲線ct值；其余曲線視為無效曲線，不予計(jì)算。
5、在fam通道中運(yùn)行ct的計(jì)算，根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)的ct值及有無擴(kuò)增曲線，判定對應(yīng)位點(diǎn)情況，具體結(jié)果判定如下：樣本gpc1有s型曲線且△ct值>15時(shí)，gpc1弱表達(dá)；10≤△ct≤15時(shí)，gpc1中表達(dá)；△ct值≤10時(shí)，gpc1強(qiáng)表達(dá)。
靈敏度分析：取gpc1基因質(zhì)粒經(jīng)定量后濃度為1000個(gè)拷貝的樣品dna，進(jìn)行10倍稀釋，然后分別對3個(gè)濃度進(jìn)行檢測，每次反應(yīng)加入5μldna.結(jié)果表明本發(fā)明的熒光pcr方法的靈敏度高，10拷貝dna基因即可檢出。
重復(fù)性試驗(yàn)：每個(gè)反應(yīng)分別加入質(zhì)粒dna1000拷貝、100拷貝，重復(fù)10次進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增，10次ct值相差不到0.5個(gè)循環(huán)。
檢測結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測體系可以準(zhǔn)確檢測質(zhì)粒gpc1基因表達(dá)，檢測的靈敏度可達(dá)到5-10拷貝。
實(shí)施例2：
運(yùn)用本發(fā)明檢測臨床樣本，取送我公司待檢測的臨床胰腺癌石蠟包埋組織樣本118例，男性59例，女性59例，平均年齡為55歲，中位年齡47歲。利用本發(fā)明特異引物和探針熒光pcr體系檢測118例臨床樣本的gpc1的基因表達(dá)如下：
(1)樣本處理與rna的提取
a．取約1×1cm2的各胰腺癌樣本切片（共約4-5片切片）置于離心管（自備）中，加入1ml二甲苯，蓋緊管蓋，渦旋震蕩10秒。
b．12，000rpm（～13,400×g）離心2分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄沉。
c．加入1ml無水乙醇，渦旋震蕩混勻。12，000rpm離心2分鐘，棄上清，注意不要吸棄沉淀。
d．打開管蓋，室溫或最高至37°c孵育10分鐘，直至無乙醇?xì)埩簟?/p>
e．加入150μlbufferpkd，重懸沉淀；加入10μlproteinasek，渦旋震蕩混勻。
f．56℃孵育15分鐘，直至樣品完全溶解。80℃孵育15分鐘。短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
g．加入320μlbufferrbc，渦旋震蕩徹底混勻。
h.將步驟g中所得到的溶液全部加入到已裝入收集管（collectiontube2ml）的過濾柱（dnaremovercolumn）中。10，000rpm離心1分鐘，收集濾液。
i.在步驟h得到的濾液中，加入720μl無水乙醇，渦旋震蕩徹底混勻。
j.將步驟i中所得的溶液全部加入到已裝入收集管（collectiontube2ml）的吸附柱（spincolumnrs）中。10，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
k.向吸附柱中加入500μlbufferrw2，10，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
l.12，000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘以徹底晾干。
m.將吸附柱置于一個(gè)新的無rnase離心管（collectiontube1.5ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-50μlrnase-freewater，室溫放置2-5分鐘，10，000rpm離心1分鐘，收集rna溶液，準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
(2)建立pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系
將所提上述rna溶于0.1%depc水中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測提取質(zhì)量，確定其濃度od260/od280為1.9-2.1，并讀其含量。取0.1～5μg的rnaa作為其cdna合成的模板，采用康為世紀(jì)的rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cdna，cdna合成體系如下：
5×rtbuffer4μl
引物終濃度200nm
dntp1mm
superrt200u
rna6μl
補(bǔ)depc水至20μl。
應(yīng)用上述反轉(zhuǎn)錄體系按如下步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
(a)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液13μl,superrt逆轉(zhuǎn)錄酶1μl,加入無菌離心管中，混勻。
(b)加入待測樣品rna6μl,rna總量在0.1～5μg范圍內(nèi)至20μl.
（c）42°c保溫1個(gè)小時(shí)
(d)85°c保溫5分鐘后冰上冷卻，得到cdna模板
將上述所得cdna模板，用作實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增的模板，按照如下擴(kuò)增體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增：
10xpcrbuffer稀釋為1x
dntp0.2mm
模板2ul
各引物200-400nm
各探針100-400nm
熱啟動taq酶1u
mgcl22-5mm
總體積20ul。
實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)條件如下：
熒光信號的收集定為fam，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，按以下步驟進(jìn)行分析、判定：
1、運(yùn)行無模板對照（ntc）時(shí)，fam信號無曲線升起，說明實(shí)驗(yàn)無污染存在，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)情況。
2、運(yùn)行陽性質(zhì)控品分析，所有陽性質(zhì)控的ct值≤30.0，說明實(shí)驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其ct值也可能會由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動。
3、運(yùn)行g(shù)apdh的ct值計(jì)算，在fam通道，如果ct值≤42.0，可以繼續(xù)分析；如果ct值>42.0,則說明樣本rna降解嚴(yán)重，不適合實(shí)驗(yàn)需要。
4、有效擴(kuò)增曲線的定義及要求：典型擴(kuò)增曲線具有三種典型時(shí)期，早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（升高）和晚起的平臺期，曲線整體形狀呈s型。有效擴(kuò)增曲線至少需要早期背景擴(kuò)增期和中期指數(shù)擴(kuò)增，曲線呈正常s型擴(kuò)增趨勢，方可計(jì)算曲線ct值；其余曲線視為無效曲線，不予計(jì)算。
5、在fam通道中運(yùn)行ct的計(jì)算，根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)的ct值及有無擴(kuò)增曲線，判定對應(yīng)位點(diǎn)情況，具體結(jié)果判定結(jié)果為：
結(jié)果判讀如下：樣本gpc1有s型曲線且△ct值>15時(shí)，gpc1弱表達(dá)；10≤△ct≤15時(shí)，gpc1中表達(dá)；△ct值≤10時(shí)，gpc1強(qiáng)表達(dá)。
檢測結(jié)果表明所檢測118例胰腺癌樣本中有15例gpc1高表達(dá)，高表達(dá)率為12.7%，同時(shí)對上述所有樣本進(jìn)行免疫組化檢測對比，免疫組化檢測結(jié)果表明>50%癌細(xì)胞表達(dá)的比例為14例患者，表明此方法檢測與免疫組化有非常的一致性。
附表：臨床樣本檢測結(jié)果比較：
綜上所述，本發(fā)明采用了gpc1特異性探針和引物，可以檢測腫瘤組織中g(shù)pc1的mrna表達(dá)水平；創(chuàng)新性的利用rt-pcr的方法，跟管家基因gapdh比較，通過2-△△ct算法，得到gpc1的相對表達(dá)水平，提高了其靈敏度，大于傳統(tǒng)的ihc方法；可以在血液中檢測gpc1的表達(dá)；操作簡單，檢測廉價(jià)，可以大規(guī)模推廣；檢測速度快，檢測過程大約需要2小時(shí)就可完成。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，或直接或間接運(yùn)用附屬在其他相關(guān)產(chǎn)品的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。