本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于pd-1表達(dá)水平檢測(cè)的試劑盒。
背景技術(shù)：
pd-1(programmeddeath1)程序性死亡受體1，最初在凋亡的小鼠t細(xì)胞雜交瘤中發(fā)現(xiàn)，屬于cd28超家族成員，是一種由定位于染色體2q37.3的pd-1基因編碼的ⅰ型跨膜糖蛋白。pd-1主要表達(dá)于活化的t細(xì)胞、b細(xì)胞及活化抗原提呈細(xì)胞（包括單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞）。pd-1配體主要有pd-l1和pd-l2，兩者在相關(guān)研究中都可以發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤細(xì)胞中有高表達(dá)。
研究表明，pd-1的表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。腫瘤細(xì)胞可通過pd-1/pd-l1信號(hào)途徑逃過免疫系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)和殺傷，參與腫瘤的免疫逃逸機(jī)制。當(dāng)t細(xì)胞表面的受體pd-1與其配體pd-l1相互作用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的itsm發(fā)生磷酸化，招募shp2磷酸酶類分子，從而激活ras和pi3k/akt信號(hào)通路，使下游的t細(xì)胞的活化被抑制，包括抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和t細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)t細(xì)胞凋亡等，轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)性信號(hào)，從而發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
pd-1在許多腫瘤組織中的表達(dá)發(fā)生明顯上調(diào)。zhang等研究證實(shí)，pd-1過表達(dá)與nsclc密切相關(guān)。從21nsclc患者中證實(shí)在腫瘤組織中cd8+t細(xì)胞pd-1的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外周血單核淋巴細(xì)胞（pbmc）中cd8+t細(xì)胞pd-1的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)于同一個(gè)患者，在其腫瘤組織中cd8+t細(xì)胞pd-1的表達(dá)也要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pbmc中cd8+t細(xì)胞的表達(dá)。
腫瘤免疫治療是通過調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫力，從而抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤免疫治療是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域中最具前景的研究方向之一。以pd-1及pd-l1為靶點(diǎn)的免疫抑制劑，可以阻斷pd-1與pd-l1的結(jié)合，阻斷負(fù)向調(diào)控信號(hào)，使t細(xì)胞恢復(fù)活性，增強(qiáng)t細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)抗腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有重要的臨床意義。目前已上市的pd-1拮抗劑包括opdivo，keytruda和tecentriq。fda已批準(zhǔn)上述三個(gè)pd-1抑制劑用于多種癌癥的治療，包括轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、頭頸鱗癌、尿路上皮癌等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的：提供一種用于pd-1表達(dá)檢測(cè)的試劑盒，能檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)pd-1表達(dá)水平的高低，此方法相對(duì)ihc，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高、特異性好,只需2個(gè)小時(shí)就能完成檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可滿足臨床快速檢測(cè)、指導(dǎo)用藥的需求。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種用于pd-1表達(dá)檢測(cè)的試劑盒，包括特異性反轉(zhuǎn)錄引物、q-pcr特異性引物和探針；
所述特異性反轉(zhuǎn)錄引物包括如下核苷酸序列：
pd-1反轉(zhuǎn)錄1：5’agactagcagcaccaggctg3’
gapdh反轉(zhuǎn)錄2：5’atacgaccaaatccgttgact3’
所述q-pcr特異性引物包括如下核苷酸序列：
pd-1f：gagctcagggtgacagagagaag3’
pd-1r：5’caaccaccagggtttggaac3’
gapdhf:5’ctctgctcctcctgttcgac3’
gapdhr:5’atggtgtctgagcgatgtgg3’
所述探針包括如下核苷酸序列：
pd-1taqman:5’-fam-cagaagtgcccacagc-mgb-3’
gapdhtaqman:5’cgtcgccagccga3’
一種用于pd-1表達(dá)檢測(cè)的試劑盒，通過所述試劑盒提取rna樣本，逆轉(zhuǎn)錄體系中將rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，并在pcr擴(kuò)增體系中進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。
所述逆轉(zhuǎn)錄體系包括如下組份：
5×rtbuffer4μl
引物終濃度200nm
dntp1mm
superrt200u
rna6μl
補(bǔ)depc水至20μl。
所述pcr擴(kuò)增體系包括如下組份：
10xpcrbuffer稀釋為1x
dntp0.2mm
模板2ul
各引物200-400nm
各探針100-400nm
熱啟動(dòng)taq酶1u
mgcl22-5mm
總體積20ul。
所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)的條件如下：
一種用于pd-1表達(dá)檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法至少包括如下步驟：
步驟1：針對(duì)pd-1表達(dá)設(shè)計(jì)合成引物和檢測(cè)探針。
步驟2：樣本處理與rna的提取。
步驟3：rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna
步驟4：建立pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系。
步驟5：分析圖像后調(diào)節(jié)baseline的start值、end值和閾值線，判定結(jié)果。
上述的用于pd-1表達(dá)檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其中，所述的rna樣本包括新鮮腫瘤組織或新鮮病理組織或石蠟包埋組織或新鮮血液。
上述的用于pd-1表達(dá)檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其中，取樣的所述的rna樣本為1克。
本發(fā)明采用了pd-1特異探針和引物，可以檢測(cè)腫瘤組織中rna中pd-1的表達(dá)；創(chuàng)新性的利用rt-pcr的方法，提高了其靈敏度，大于傳統(tǒng)的ihc方法；可以在外泌體和血小板rna中檢測(cè)pd-l1的表達(dá)；操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)廉價(jià)，可以大規(guī)模推廣；檢測(cè)速度快，檢測(cè)過程大約需要2小時(shí)就可完成。
具體實(shí)施方式
以下進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施例。
一種用于pd-1表達(dá)檢測(cè)的引物、探針，包括pd-1和gapdh反轉(zhuǎn)錄引物，pd-1檢測(cè)引物與探針，所述的pd-1和gapdh引物與探針具體為：
所述反轉(zhuǎn)錄引物包括如下核苷酸序列：
pd-1反轉(zhuǎn)錄引物（pd-1）：5’agactagcagcaccaggctg3’
gapdh反轉(zhuǎn)錄引物（gapdh-2）：5’atacgaccaaatccgttgact3’
所述q-pcr特異性引物包括如下核苷酸序列：
pd-1反轉(zhuǎn)錄引物（pd-1f）：gagctcagggtgacagagagaag3’
pd-1反轉(zhuǎn)錄引物（pd-1r）：5’caaccaccagggtttggaac3’
gapdh檢測(cè)引物（gapdhf）:5’ctctgctcctcctgttcgac3’
gapdh檢測(cè)引物（gapdhr）:5’atggtgtctgagcgatgtgg3’
所述探針包括如下核苷酸序列：
pd-1taqman:5’-fam-cagaagtgcccacagc-mgb-3’
gapdhtaqman:5’cgtcgccagccga3’
一種用于pd-1表達(dá)檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，該方法至少包括如下步驟：
步驟1：根據(jù)cosmic數(shù)據(jù)公布的人類pd-1和gapdh基因的基因序列，針對(duì)pd-1和gapdh基因來設(shè)計(jì)引物和探針。通過pd-1和gapdh特異性引物和探針體系優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)高靈敏和特異檢測(cè)。
針對(duì)選定的pd-1和gapdh序列，應(yīng)用premier6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)多對(duì)特異引物和探針。
步驟2：提取檢測(cè)樣本的rna，所述的檢測(cè)樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織和胸腔液。
步驟3：配制實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系。
步驟4：根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷檢測(cè)結(jié)果：熒光信號(hào)的收集定為fam，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
步驟5：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行分析和判定。
在所述的步驟2中，還包括如下分步驟：
步驟2.1：取約1×1cm2的各肺癌樣本切片（共約4-5片切片）置于離心管（自備）中，加入1ml二甲苯，蓋緊管蓋，渦旋震蕩10秒。
步驟2.2：12，000rpm（～13，400×g）離心2分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄沉。
步驟2.3：加入1ml無水乙醇，渦旋震蕩混勻；12，000rpm離心2分鐘，棄上清，注意不要吸棄沉淀。
步驟2.4：打開管蓋，室溫或最高至37°c孵育10分鐘，直至無乙醇?xì)埩簟?/p>
步驟2.5：加入150μlbufferpkd，重懸沉淀；加入10μlproteinasek，渦旋震蕩混勻。
步驟2.6：56℃孵育15分鐘，直至樣品完全溶解；80℃孵育15分鐘；短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
步驟2.7：加入320μlbufferrbc，渦旋震蕩徹底混勻。
步驟2.8：將步驟2.7中所得到的溶液全部加入到已裝入收集管（collectiontube2ml）的過濾柱（dnaremovercolumn）中；10，000rpm離心1分鐘，收集濾液。
步驟2.9：在步驟2.8得到的濾液中，加入720μl無水乙醇，渦旋震蕩徹底混勻。
步驟2.10：將步驟2.9中所得的溶液全部加入到已裝入收集管（collectiontube2ml）的吸附柱（spincolumnrs）中；10，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
步驟2.11：向吸附柱中加入500μlbufferrw2，10，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
步驟2.12：12，000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液；將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘以徹底晾干。
步驟2.13：將吸附柱置于一個(gè)新的無rnase離心管（collectiontube1.5ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-50μlrnase-freewater，室溫放置2-5分鐘，10，000rpm離心1分鐘，收集rna溶液，準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
在所述的步驟2.13中，所述的逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系如下：
5×transcriptionbuffer5ul
dntp(10mm)1.25ul
引物終濃度200nm
ribonucleaseinhibitor(40u/μl)0.7ul
mlv-transcriptase1ul
rna15ul
depch2o補(bǔ)足至25ul
在所述的步驟3中，所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：
pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：
10xpcrbuffer稀釋為1x
dntp0.2mm
模板2ul
各引物200-400nm
熱啟動(dòng)taq酶1u
mgcl22-5mm
總體積20ul。
所述的pcr反應(yīng)的條件如下：
熒光信號(hào)的收集定為fam，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
步驟4：分析圖像后調(diào)節(jié)baseline的start值、end值和閾值線，判定結(jié)果。
反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)保存結(jié)果，分析圖像后調(diào)節(jié)baseline的start值、end值（可自行調(diào)節(jié)，start值可以在3-10之間，end值位于15-20之間，調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線使其平直或低于閾值線）和閾值線（threshold值，可手動(dòng)調(diào)整至baseline之上）。
ct值及△ct值的確定：用戶根據(jù)實(shí)際情況確定各反應(yīng)管擴(kuò)展曲線升起的拐點(diǎn)處，得到其ct值?！鱟t=pd-1孔fam熒光ct值與參照孔ct值的差值。檢測(cè)孔ct值是指樣本檢測(cè)孔對(duì)應(yīng)的ct值；參照孔ct值是指樣本gapdh對(duì)應(yīng)的ct值。
結(jié)果判讀如下：樣本pd-1有s型曲線且△ct值>15時(shí)，pd-1弱表達(dá)；10≤△ct≤15時(shí)，pd-1中表達(dá)；△ct值≤10時(shí)，pd-1強(qiáng)表達(dá)。
所述的rna樣本包括新鮮腫瘤組織或新鮮病理組織或石蠟包埋組織或新鮮血漿。
取樣的所述的pd-1樣本為1克左右。
在所述的步驟5中，還包括如下分步驟：
步驟5.1：運(yùn)行無模板對(duì)照（ntc）時(shí)，fam信號(hào)無曲線升起，說明實(shí)驗(yàn)無污染存在，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)情況。
步驟5.2：運(yùn)行陽性質(zhì)控品分析，所有陽性質(zhì)控的ct值≤30.0，說明實(shí)驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其ct值也可能會(huì)由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動(dòng)。
步驟5.3：運(yùn)行mix5（ref）的ct值計(jì)算，在fam通道，如果ct值≤42.0，可以繼續(xù)分析；如果ct值>42.0，則說明樣本rna降解嚴(yán)重，不適合實(shí)驗(yàn)需要。
步驟5.4：有效擴(kuò)增曲線的定義及要求：典型擴(kuò)增曲線具有三種典型時(shí)期，早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（升高）和晚起的平臺(tái)期，曲線整體形狀呈s型。有效擴(kuò)增曲線至少需要早期背景擴(kuò)增期和中期指數(shù)擴(kuò)增，曲線呈正常s型擴(kuò)增趨勢(shì)，方可計(jì)算曲線ct值；其余曲線視為無效曲線，不予計(jì)算。
步驟5.5：在fam通道中運(yùn)行ct的計(jì)算，根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)的ct值及有無擴(kuò)增曲線，判定對(duì)應(yīng)位點(diǎn)情況，具體結(jié)果判定結(jié)果為：
結(jié)果判讀如下：樣本pd-1有s型曲線且△ct值>15時(shí)，pd-1弱表達(dá)；10≤△ct≤15時(shí)，pd-1中表達(dá)；△ct值≤10時(shí)，pd-1強(qiáng)表達(dá)。
所述的mrna反轉(zhuǎn)錄cdna的操作方法，包括如下步驟：
步驟1：取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液13μl，superrt逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，加入無菌離心管中，混勻。
步驟2：加入待測(cè)樣品rna6μl，rna總量在0.1～5μg范圍內(nèi)至20μl。
步驟3：42°保溫1個(gè)小時(shí)，85°c孵育5分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
步驟4：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于后續(xù)pcr反應(yīng)和熒光定量pcr反應(yīng)。
實(shí)施例1：
利用本發(fā)明體系檢測(cè)質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒模板（含pd-1基因），利用上述熒光pcr檢測(cè)pd-1基因表達(dá)的方法如下：
（1）質(zhì)粒處理與提取
質(zhì)粒的提取采用tiangen（highpureplasmidkid，dp116）的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取，具體提取操作步驟按試劑盒說明操作。所提dna溶于tris-hcl(10mm,ph8.0),經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，確定其濃度，然后用tris-hcl(10mm,ph8.0)溶液調(diào)整dna濃度到20ng/ul作為稀釋母液。
根據(jù)公式c拷貝濃度=（c質(zhì)量濃度x6.02x1023）/mwdna稀釋野生型質(zhì)粒為106個(gè)拷貝數(shù)/微升。
(2)建立pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系：
將上述所得cdna模板，用作實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增的模板，按照如下擴(kuò)增體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增
10xpcrbuffer稀釋為1x
dntp0.2mm
模板2ul
各引物200-400nm
各探針100-400nm
熱啟動(dòng)taq酶1u
mgcl22-5mm
總體積20ul。
實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)條件如下：
熒光信號(hào)的收集定為fam，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，按以下步驟進(jìn)行分析、判定：
1、運(yùn)行無模板對(duì)照（ntc）時(shí)，fam信號(hào)無曲線升起，說明實(shí)驗(yàn)無污染存在，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)情況。
2、運(yùn)行陽性質(zhì)控品分析，所有陽性質(zhì)控的ct值≤30.0，說明實(shí)驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其ct值也可能會(huì)由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動(dòng)。
3、運(yùn)行g(shù)apdh的ct值計(jì)算，在fam通道，如果ct值≤42.0，可以繼續(xù)分析；如果ct值>42.0,則說明樣本rna降解嚴(yán)重，不適合實(shí)驗(yàn)需要。
4、有效擴(kuò)增曲線的定義及要求：典型擴(kuò)增曲線具有三種典型時(shí)期，早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（升高）和晚起的平臺(tái)期，曲線整體形狀呈s型。有效擴(kuò)增曲線至少需要早期背景擴(kuò)增期和中期指數(shù)擴(kuò)增，曲線呈正常s型擴(kuò)增趨勢(shì)，方可計(jì)算曲線ct值；其余曲線視為無效曲線，不予計(jì)算。
5、在fam通道中運(yùn)行ct的計(jì)算，根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)的ct值及有無擴(kuò)增曲線，判定對(duì)應(yīng)位點(diǎn)情況，具體結(jié)果判定如下：樣本pd-1有s型曲線且△ct值>15時(shí)，pd-1弱表達(dá)；10≤△ct≤15時(shí)，pd-1中表達(dá)；△ct值≤10時(shí)，pd-1強(qiáng)表達(dá)。
靈敏度分析：取pd-1基因質(zhì)粒經(jīng)定量后濃度為1000個(gè)拷貝的樣品dna，進(jìn)行10倍稀釋，然后分別對(duì)3個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè)，每次反應(yīng)加入5μldna.結(jié)果表明本發(fā)明的熒光pcr方法的靈敏度高，10拷貝dna基因即可檢出。
重復(fù)性試驗(yàn)：每個(gè)反應(yīng)分別加入質(zhì)粒dna1000拷貝、100拷貝，重復(fù)10次進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增，10次ct值相差不到0.5個(gè)循環(huán)。
檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測(cè)體系可以準(zhǔn)確檢測(cè)質(zhì)粒pd-1基因表達(dá)，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到5-10拷貝。
實(shí)施例2：
運(yùn)用本發(fā)明檢測(cè)臨床樣本，取送我公司待檢測(cè)的臨床肺癌石蠟包埋組織樣本120例，男性60例，女性60例，平均年齡為58歲，中位年齡52歲。利用本發(fā)明特異引物和探針熒光pcr體系檢測(cè)120例臨床樣本的pd-1的基因表達(dá)如下：
(1)樣本處理與rna的提取
a．取約1×1cm2的各肺癌樣本切片（共約4-5片切片）置于離心管（自備）中，加入1ml二甲苯，蓋緊管蓋，渦旋震蕩10秒。
b．12，000rpm（～13,400×g）離心2分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄沉。
c．加入1ml無水乙醇，渦旋震蕩混勻。12，000rpm離心2分鐘，棄上清，注意不要吸棄沉淀。
d．打開管蓋，室溫或最高至37°c孵育10分鐘，直至無乙醇?xì)埩簟?/p>
e．加入150μlbufferpkd，重懸沉淀；加入10μlproteinasek，渦旋震蕩混勻。
f．56℃孵育15分鐘，直至樣品完全溶解。80℃孵育15分鐘。短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
g．加入320μlbufferrbc，渦旋震蕩徹底混勻。
h.將步驟g中所得到的溶液全部加入到已裝入收集管（collectiontube2ml）的過濾柱（dnaremovercolumn）中。10，000rpm離心1分鐘，收集濾液。
i.在步驟h得到的濾液中，加入720μl無水乙醇，渦旋震蕩徹底混勻。
j.將步驟i中所得的溶液全部加入到已裝入收集管（collectiontube2ml）的吸附柱（spincolumnrs）中。10，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
k.向吸附柱中加入500μlbufferrw2，10，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
l.12，000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘以徹底晾干。
m.將吸附柱置于一個(gè)新的無rnase離心管（collectiontube1.5ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-50μlrnase-freewater，室溫放置2-5分鐘，10，000rpm離心1分鐘，收集rna溶液，準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
(2)建立pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系
將所提上述rna溶于0.1%depc水中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，確定其濃度od260/od280為1.9-2.1，并讀其含量。取0.1～5μg的rnaa作為其cdna合成的模板，采用康為世紀(jì)的rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cdna，cdna合成體系如下：
5×rtbuffer4μl
引物終濃度200nm
dntp1mm
superrt200u
rna6μl
補(bǔ)depc水至20μl。
應(yīng)用上述反轉(zhuǎn)錄體系按如下步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
(a)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液13μl,superrt逆轉(zhuǎn)錄酶1μl,加入無菌離心管中，混勻。
(b)加入待測(cè)樣品rna6μl,rna總量在0.1～5μg范圍內(nèi)至20μl.
（c）42°c保溫1個(gè)小時(shí)
(d)85°c保溫5分鐘后冰上冷卻，得到cdna模板
將上述所得cdna模板，用作實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增的模板，按照如下擴(kuò)增體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增：
10xpcrbuffer稀釋為1x
dntp0.2mm
模板2ul
各引物200-400nm
各探針100-400nm
熱啟動(dòng)taq酶1u
mgcl22-5mm
總體積20ul。
實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)條件如下：
熒光信號(hào)的收集定為fam，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，按以下步驟進(jìn)行分析、判定：
1、運(yùn)行無模板對(duì)照（ntc）時(shí)，fam信號(hào)無曲線升起，說明實(shí)驗(yàn)無污染存在，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)情況。
2、運(yùn)行陽性質(zhì)控品分析，所有陽性質(zhì)控的ct值≤30.0，說明實(shí)驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其ct值也可能會(huì)由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動(dòng)。
3、運(yùn)行g(shù)apdh的ct值計(jì)算，在fam通道，如果ct值≤42.0，可以繼續(xù)分析；如果ct值>42.0,則說明樣本rna降解嚴(yán)重，不適合實(shí)驗(yàn)需要。
4、有效擴(kuò)增曲線的定義及要求：典型擴(kuò)增曲線具有三種典型時(shí)期，早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（升高）和晚起的平臺(tái)期，曲線整體形狀呈s型。有效擴(kuò)增曲線至少需要早期背景擴(kuò)增期和中期指數(shù)擴(kuò)增，曲線呈正常s型擴(kuò)增趨勢(shì)，方可計(jì)算曲線ct值；其余曲線視為無效曲線，不予計(jì)算。
5、在fam通道中運(yùn)行ct的計(jì)算，根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)的ct值及有無擴(kuò)增曲線，判定對(duì)應(yīng)位點(diǎn)情況，具體結(jié)果判定結(jié)果為：
結(jié)果判讀如下：樣本pd-l1有s型曲線且△ct值>15時(shí)，pd-1弱表達(dá)；10≤△ct≤15時(shí)，pd-1中表達(dá)；△ct值≤10時(shí)，pd-1強(qiáng)表達(dá)。
檢測(cè)結(jié)果表明所檢測(cè)120例肺癌樣本中有12例pd-1高表達(dá)，高表達(dá)率為10%，同時(shí)對(duì)上述所有樣本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)對(duì)比，免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明>50%癌細(xì)胞表達(dá)的比例為11例患者，表明此方法檢測(cè)與免疫組化有非常的一致性。
附表1：臨床樣本檢測(cè)結(jié)果比較：
綜上所述，本發(fā)明采用了pd-1特異性探針和引物，可以檢測(cè)腫瘤組織中pd-1的mrna表達(dá)水平；創(chuàng)新性的利用rt-pcr的方法，跟管家基因gapdh比較，通過2-△△ct算法，得到pd-l1的相對(duì)表達(dá)水平，提高了其靈敏度，大于傳統(tǒng)的ihc方法；可以在血液中檢測(cè)pd-1的表達(dá)；操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)廉價(jià)，可以大規(guī)模推廣；檢測(cè)速度快，檢測(cè)過程大約需要2小時(shí)就可完成。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，或直接或間接運(yùn)用附屬在其他相關(guān)產(chǎn)品的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。