本發(fā)明涉及一種提高n-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
n-乙酰神經(jīng)氨酸是生物體內(nèi)的一種糖類物質(zhì)，廣泛存在于微生物以及哺乳動物體內(nèi)。在人體中，n-乙酰神經(jīng)氨酸是細(xì)胞信息傳遞關(guān)鍵物質(zhì)，參與細(xì)胞識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受精等多個生理過程。因此，n-乙酰神經(jīng)氨酸被廣泛應(yīng)用于抗炎，增強(qiáng)嬰兒免疫力，促進(jìn)嬰兒大腦發(fā)育，維持老年人大腦健康。目前，n-乙酰神經(jīng)氨酸主要采用從酪蛋白、燕窩等含量相對豐富的天然材料中提取，得到的產(chǎn)品容易引起過敏反應(yīng)，或是通過嚴(yán)苛條件的化學(xué)法合成，高溫、高壓工藝復(fù)雜，中間產(chǎn)物等難以分離，而且對環(huán)境污染嚴(yán)重。
枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被fda認(rèn)證為“generallyregardedassafe”(gras)安全級別。因此，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌是生產(chǎn)食品安全級n-乙酰神經(jīng)氨酸的有效途徑。然而，枯草芽孢桿菌合成代謝流通量不足，影響n-乙酰神經(jīng)氨酸代謝合成。如何調(diào)整枯草芽孢桿菌代謝流供給，增加前體供給以提高n-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量，是一個值得深入探討的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明構(gòu)建了一種提高n-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明的高產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌，通過敲除磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)葡萄糖特異性酶eiicba組件編碼基因ptsg得到。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)葡萄糖特異性酶eiicba組件編碼基因ptsg，表達(dá)的氨基酸序列如seqidno.1所示。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌，是以枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168δnagpδnagpδgampδgamaδnagaδnagbδ1dhδpta::lox72；δctc::p43-gna1，pp43nmk-age-neub為宿主構(gòu)建得到的。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168δnagpδnagpδgampδgamaδnagaδnagbδ1dhδpta::lox72；δctc::p43-gna1，pp43nmk-age-neub宿主是通過氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因重組于bacillussubtilis168δnagpδnagpδgampδgamaδnagaδnagbδ1dhδpta::lox72(liuy,zhuy,lij,shinh-d,chenrr,dug,liul,chenj.modularpathwayengineeringofbacillussubtilisforimprovedn-acetylglucosamineproduction.metabolicengineering,2014.23:42-52)基因組上整合表達(dá)，n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因、n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶編碼基因重組于質(zhì)粒pp43nmk(zhangxz,cuizl,hongq,lisp.high-levelexpressionandsecretionofmethylparathionhydrolaseinbacillussubtiliswb800.appliedandenvironmentalmicrobiology.2005；71(7):4101-3.)上游離表達(dá)得到。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述氨基葡萄糖乙?；傅陌被嵝蛄袨閟eqidno.2，所述n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶的氨基酸序列為seqidno.3，所述n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶的氨基酸序列為seqidno.4。
本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種上述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟：
1)構(gòu)建重組敲除片段
克隆磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)葡萄糖特異性酶eiicba組件編碼基因ptsg兩側(cè)同源臂基因，克隆spectinomycin抗性基因，3段基因通過融合pcr組裝。
2)構(gòu)建高產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌
將上述重組敲除片段轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，得到高產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明還提供了一種上述重組枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)保健品方面的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸是將35-38℃、180-220rpm下培養(yǎng)10-20h的重組枯草芽孢桿菌以10％-20％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于35-38℃、180-220rpm條件下發(fā)酵30-50h。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的宿主細(xì)胞中構(gòu)建了利用n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因age以及n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶編碼基因neub合成n-乙酰神經(jīng)氨酸的新途徑，利用枯草芽孢桿菌自有的代謝途徑，從底物葡萄糖到n-乙酰神經(jīng)氨酸的前體物質(zhì)n-乙酰氨基葡萄糖僅需要強(qiáng)化氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(glms)和氨基葡萄糖乙?；?gna1)兩個酶的作用即可，有助于強(qiáng)化合成代謝流。
本發(fā)明進(jìn)一步通過改造pts系統(tǒng)不僅可以提高葡萄糖利用率，并且可以調(diào)整枯草芽孢桿菌合成代謝途徑中的底物濃度，使n-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量提高。
本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌可實(shí)現(xiàn)n-乙酰神經(jīng)氨酸在胞外積累，其含量可達(dá)到660mg/l，為進(jìn)一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
重組枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵：
種子培養(yǎng)基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖60，胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。
培養(yǎng)條件：將37℃、200rpm下培養(yǎng)16h的種子以15％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)45h。
乙酰氨基葡萄糖的測定方法：
高效液相色譜(hplc)檢測法：agilent1200，uv檢測器，hpx-87h柱(300×7.8mm，5μm)，流動相：5mm稀硫酸，流速0.50ml/min，柱溫60℃，進(jìn)樣體積為10μl。
實(shí)施例1宿主細(xì)胞構(gòu)建
1)構(gòu)建重組片段
通過融合pcr，將氨基酸序列為seqidno.2的氨基葡萄糖乙酰化酶的編碼基因gna1克隆片段，與重組同源臂以及zeocin抗性基因融合；
2)構(gòu)建重組質(zhì)粒
克隆氨基酸序列為seqidno.3的n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶的編碼基因age，以及氨基酸序列為seqidno.4的n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶的編碼基因neub，連接到重組表達(dá)質(zhì)粒pp43nmk上；
3)構(gòu)建產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌
將上述步驟1)中重組片段轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168δnagpδnagpδgampδgamaδnagaδnagbδ1dhδpta::lox72)，重組到基因組上，獲得重組枯草芽孢桿菌工程菌，命名為b6c；而后將上述步驟2)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到b6c菌株中，得到產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168δnagpδnagpδgampδgamaδnagaδnagbδ1dhδpta::lox72；δctc::p43-gna1，pp43nmk-age-neub。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)ncbi上公布的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)葡萄糖特異性酶eiicba組件編碼基因ptsg，設(shè)計其上游914bp同源臂序列，設(shè)計序列分別為seqidno.5和seqidno.6的引物：ptsg-1f:5’-taaaagacgagaaggaacaaaagcag-3’，ptsg-1r:5’-tcctgtgtgaaattgttatccgctcaagaattgacctcctctttttactagtctg-3’；設(shè)計其下游927bp同源臂序列，設(shè)計序列分別為seqidno.7和seqidno.8的引物：ptsg-2f:5’-cgtcgtgactgggaaaaccctggcggggtgttagtacgccgtgcttgt-3’，ptsg-2r:5’-agatgtgcgtccgccgatat-3’；根據(jù)p7s6質(zhì)粒(yan,x.,yu,h.j.,hong,q.&li,s.p.cre/loxsystemandpcr-basedgenomeengineeringinbacillussubtilis.appliedandenvironmentalmicrobiology74,5556-5562,doi:10.1128/aem.01156-08(2008))序列信息擴(kuò)增spectinomycin抗性基因，設(shè)計序列分別為seqidno.9和seqidno.10的引物：spc-f:5’-tagtaaaaagaggaggtcaattcttgagcggataacaatttcacacagg-3’，spc-r:5’-tgacaagcacggcgtactaacaccccgccagggttttcccagtcacgac-3’。通過融合pcr，將以上3段基因融合成重組敲除片段。
實(shí)施例3重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建
將構(gòu)建好的重組敲除片段轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168δnagpδnagpδgampδgamaδnagaδnagbδ1dhδpta::lox72；δctc::p43-gna1，pp43nmk-age-neub)。采用spc-f及spc-r引物挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落pcr，出現(xiàn)1264bp條帶，驗(yàn)證重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建成功。
實(shí)施例4宿主菌株發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸
將37℃、200rpm下培養(yǎng)10h的種子以15％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)35h。最終發(fā)酵上清液中n-乙酰神經(jīng)氨酸含量達(dá)到190mg/l。過量表達(dá)氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因gna1，n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶基因age，n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶基因neub，實(shí)現(xiàn)了n-乙酰神經(jīng)氨酸在重組枯草芽孢桿菌胞外的積累。
實(shí)施例5重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸
將37℃、200rpm下培養(yǎng)10h的種子以15％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)35h，最終發(fā)酵上清液中n-乙酰神經(jīng)氨酸含量達(dá)到660mg/l。敲除磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)葡萄糖特異性酶eiicba組件編碼基因ptsg，實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建高產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸重組工程菌，較出發(fā)菌株產(chǎn)量190mg/l，有了較大提高。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)力要求書所界定的為準(zhǔn)。
序列表
<110>江南大學(xué)
<120>一種提高n-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌
<160>10
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>699
<212>prt
<213>磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)葡萄糖特異性酶eiicba組件編碼基因ptsg氨基酸序列
<400>1
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<213>釀酒酵母（saccharomycescerevisiaes288c）
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<213>念珠藻（anabaenasp.ch1）
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<210>4
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<212>prt
<213>大腸桿菌（escherichiacolik1）
<400>4
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<213>人工合成
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