一種n-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶在催化合成n-乙酰神經(jīng)氨酸中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶 (N-acetylneuraminic acid lyase, Nal)的應(yīng)用，尤其涉及一種來自谷氨酸棒 桿菌 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 中的 Nal 在以 N-乙醜甘露糖 胺（N-acetyl-D-mannosamine，ManNAc)以及丙酮酸為底物生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸 (N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] N-乙醜神經(jīng)氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid, Neu5Ac)是一種重要的奶粉添加 齊U，可以提高嬰幼兒的免疫力[1]，同時又可以作為抗A、B型流感病毒藥物合成前體[2]。 以ManNAc和丙酮酸為底物經(jīng)Nal催化合成Neu5Ac是目前最主要的合成Neu5Ac的途徑。 Nal已經(jīng)被運(yùn)用到Neu5Ac的工業(yè)合成中[3_5]，Nal催化ManNAc和丙酮酸合成Neu5Ac是 一個可逆的反應(yīng)。Nal在自然界的分布非常廣泛，在細(xì)菌和哺乳動物中都有發(fā)現(xiàn)[6]。許 多病原菌入侵人體后利用Nal來分解人體的Neu5Ac作為自身的碳源和氮源[6]，因此目 前從病原菌中報道了大量的Nal。除了病原菌來源的Nal外，也有從食品安全（generally regarded as safe，GRAS)的菌株中發(fā)現(xiàn)的 Nal。比如 Lactobacillus plantarum WCFSl [7] 和Taphylococcus carnosus TM300 [8]。由于底物丙酮酸價格低廉[9]、溫度穩(wěn)定性高[10], Nal已經(jīng)被廣泛運(yùn)用在了 Neu5Ac的合成中。但是目前所有的Nal都有一個共同的缺陷：在 催化合成Neu5Ac的可逆反應(yīng)中，Nal更傾向于分解Neu5Ac[7, 8, 11-14]。
[0003] 為獲得高活性的Nal并解決Nal的化學(xué)平衡偏向于分解Neu5Ac的問題，本專利從 食品安全的菌株Corynebacterium glutamicum ATCC13032[15]克隆并表達(dá)了 N-乙酰神 經(jīng)氨酸醛縮酶（CgNal)。其是Nal的一種，包含312個氨基酸，其在Genbank中的收錄號為 NP_601846,其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。編碼該蛋白的基因含有939bp堿基，其在 Genbank中的收錄號為NC_003450. 3,其基因序列如SEQ ID NO :1所示。至今未發(fā)現(xiàn)CgNal 用于Neu5Ac合成的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（Nal)在催化 N-乙酰甘露糖胺（ManNAc)和丙酮酸合成N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac)中的應(yīng)用。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（Nal)在催化 N-乙酰甘露糖胺（ManNAc)與丙酮酸合成N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac)反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0007] 具體的方法是，以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶為催 化劑，以N-乙酰甘露糖胺與丙酮酸為底物，合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。
[0008] 更具體的方法是，表達(dá)含有如SEQ ID NO :1所示的基因序列的重組菌，破碎后的粗 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶或進(jìn)一步經(jīng)鎳柱純化后得到的純N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與N-乙酰 甘露糖胺和丙酮酸在緩沖液中反應(yīng)得到N-乙酰神經(jīng)氨酸。
[0009] 其中，所述的含有如SEQ ID NO :1所示的基因序列的重組菌按如下方法構(gòu)建得到： 以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因組為模板擴(kuò)增出N-乙酰神經(jīng)氨酸醒縮酶 Nal的基因并連接到pET-28a載體上，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E. coli Rosetta(DE3)中。
[0010] 其中，表達(dá)含有如SEQ ID NO :1所示的基因序列的重組菌的方法是：培養(yǎng)重組菌 至 0D6QQ=04-0· 8 時添加終濃度 0· 2-1. Ommol · T1IPTG,在 15-37°C、150-220rpm 條件下誘導(dǎo) 4-12h。優(yōu)選的方法是：培養(yǎng)重組菌至OD6c?為0. 6時添加終濃度0. 2mmol ^r1IPTG,在30°C、 220rpm條件下誘導(dǎo)10h。
[0011] 其中，鎳柱純化條件為：20mmol · Γ1咪唑溶液洗脫雜蛋白，500mmol · Γ1咪唑溶液 洗脫純酶。
[0012] 其中，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸的反應(yīng)用量為：0. 36? 300U · mL-1粗酶或純酶與100?IOOOmmol · T1N-乙酰甘露糖胺及100?2000mmol · L-1丙 酮酸進(jìn)行反應(yīng)。
[0013] 其中，所述的緩沖液為20-200mmol · ΙΛΗ7?8. 8的Tris-HCl緩沖液或 20-200mmol · Ι^ρΗ9. 0?9. 5的甘氨酸-NaOH緩沖液，優(yōu)選pH7?8. 5Tris-HCl緩沖液，最 優(yōu)選pH7. 5Tris-HCl緩沖液或ρΗ8· 5的Tris-HCl緩沖液。
[0014] 其中，在緩沖液中的反應(yīng)條件為：溫度25?60°C，反應(yīng)時間0. 1?12h ;優(yōu)選溫度 35?45°C，反應(yīng)時間0. 15?0. 5h ;最優(yōu)選：溫度40°C，反應(yīng)時間0. 15?0. 5h。
[0015] 發(fā)明人基于現(xiàn)代生物信息學(xué)思想，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，采用基因工程的手段從 谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032克隆N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的基因，在大腸桿菌中表達(dá)后發(fā)現(xiàn) 其能催化ManNAc和pyruvate生產(chǎn)Neu5Ac。
[0016] 有益效果：本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮 酶應(yīng)用于催化ManNAc和pyruvate合成Neu5Ac中，取得很好的效果，其酶活高達(dá)12U/mg， 由于這個反應(yīng)是個可逆反應(yīng)，相對于其它來源的醛縮酶而言，該醛縮酶的化學(xué)平衡更偏向 于N-乙酰神經(jīng)氨酸即唾液酸合成方向，同時酶的表達(dá)效果很好，沒有形成包涵體，可溶性 酶表達(dá)量很大，是來源于大腸桿菌的醛縮酶基因的表達(dá)量的5倍，同時谷氨酸棒桿菌是一 個食品級安全的菌。
【附圖說明】
[0017] 圖1為N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因的構(gòu)建圖。
[0018] 圖2為CgNal (來自于谷棒ATCC13032)和EcNal (來自于大腸桿菌）表達(dá)后蛋 白電泳圖。其中，1為CgNal粗酶，2為CgNal純酶，3為EcNal粗酶，4為EcNal純酶，5為 Marker。
[0019] 圖3為pH對CgNal酶活的影響。
[0020] 圖4為溫度對CgNal酶活的影響。
[0021] 圖5為CgNal在溫浴過程中酶活的變化。
[0022] 圖6為pH7. 5下金屬離子及表面活性劑對CgNal酶活的影響。
[0023] 圖7為pH8. 5下金屬離子及表面活性劑對CgNal酶活的影響。
[0024] 圖8為以CgNal為催化劑合成Neu5Ac過程中產(chǎn)物的濃度變化。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0026] 實(shí)施例1 :重組大腸桿菌E. coli Rosseta (pET28a_CgNal)的構(gòu)建。
[0027] 1、N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因的獲?。?br>[0028] 谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032進(jìn)行基因組的提取，然后 以提取的基因組為模板，進(jìn)行PCR。
[0029] 構(gòu)建表達(dá)載體所用的引物加設(shè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下：
[0030] 上游引物（CgNal-sense 含 BamH I)為：
[0031] 5' -GACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCTTCCGCAACTTTCACCG-3'
[0032] 下游引物（CgNal-anti 含 Hind IID 為：
[0033] 5' -TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAAGCGGTGTACAGGAATTCATC-3'
[0034] 所有引物均由蘇州金唯智公司合成。
[0035] 基因的PCR條件：
[0036] 按如下參數(shù)循環(huán)30次：98°C變性10s，68°C退火延伸lmin，最后72°C延伸lOmin。 2、重組大腸桿菌Ε· coli Rosseta (DE3)轉(zhuǎn)化：
[0037] 用 BamH I 及 Hind III分別酶切 pET_28a 載體（pET_28a 購于 Novagen (默克中國））， 確認(rèn)載體完全線性化之后分別膠回收PCR的目的片段和線性化的表達(dá)載體，然后通過一 步法定向克隆無縫克隆試劑盒（ClonExpress)，將IOuL的連接產(chǎn)物pET-28a-CgNal加入 IOOuL的Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min，42°C熱激90sec。冰上放置5min。 加入預(yù)熱的〇. 9mL LB培養(yǎng)基。200rpm37°C lh。將200uL菌液加入分別含有100 μ g/mL的 卡那霉素和氯霉素的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)