本發(fā)明涉及體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為leydig細(xì)胞的領(lǐng)域。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為leydig細(xì)胞的組合物。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是組織再生的源泉，根據(jù)個(gè)體發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的先后次序，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，escs)和成體干細(xì)胞(adultstemcells，ascs)；根據(jù)分化潛能的不同，又可將其分為全能干細(xì)胞(totipotentstemcel1)、多潛能干細(xì)胞(pluripotentstemcel1)、多能干細(xì)胞(multipotentstemcel1)和單能干細(xì)胞(unipotentstemcel1)。成體干細(xì)胞還可根據(jù)組織來(lái)源分為造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞等。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞，使體細(xì)胞被誘導(dǎo)重構(gòu)成為es細(xì)胞樣的多潛能干細(xì)胞，這種多潛能干細(xì)胞被稱(chēng)為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)，參見(jiàn)takahashik.yamanakas.inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.cell,2006,126(4):663-676；takahashik,tanabek,ohnukim,eta1.inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefnedfactors.cell,2007,131(5):861-872。因發(fā)育階段、取材及獲得方式等不同，胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞及ips細(xì)胞在臨床應(yīng)用上顯示出不同的優(yōu)勢(shì)和局限性。胚胎干細(xì)胞具有分化的全能性，但倫理問(wèn)題、免疫排異與成瘤性特點(diǎn)嚴(yán)重阻礙了其在臨床上的研究與應(yīng)用。ips具有與胚胎干細(xì)胞類(lèi)似的分化能力，但其仍具有成瘤性，而且從成體細(xì)胞誘導(dǎo)生成ips的效率極低，誘導(dǎo)生成的ips癌變率較高，這些因素大大增加了臨床應(yīng)用的不安全性。成體干細(xì)胞來(lái)源非常廣泛，無(wú)成瘤性，亦不存在倫理問(wèn)題。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為成體干細(xì)胞屬多能或 單能干細(xì)胞。近年來(lái)的一些實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，成體干細(xì)胞具有“可塑性”，不僅能分化為特定譜系中的細(xì)胞類(lèi)型，還具有分化為在發(fā)育上無(wú)關(guān)的其他譜系的能力，提示成體干細(xì)胞具有比人們以前想象的更大的分化潛能，參見(jiàn)brazeltontr,rossifm,keshetgi,blauhm.frommarrowtobrain:expressionofneuronalphenotypesinadultmice.science,2000,290(5497):1775-1779；jiangy,jahagirdarbn,reinardtrl,等人pluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrow.nature,200,418(6893):41-49；jiangy.hendersond.blackstadm.等人neuroectodermaldifferentiationfrommosusemultipotentadultprogenitorcells.procnatlacadsciusa,2003,100(supp1):11854-11860。

由于來(lái)源較多，目前成體干細(xì)胞沒(méi)有統(tǒng)一的表型、培養(yǎng)條件及鑒定方法。各種組織來(lái)源的成體干細(xì)胞顯示出不同的分化能力。這些因素使得成體干細(xì)胞的研究變得復(fù)雜混亂，很難建立比較均一的細(xì)胞系，因此為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用帶來(lái)了困難。

間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞。其一類(lèi)存在于多種組織(如骨髓、臍帶血和臍帶組織、胎盤(pán)組織、脂肪組織等)、具有多向分化潛力、非造血干細(xì)胞的成體干細(xì)胞。這類(lèi)干細(xì)胞具有向多種間充質(zhì)系列細(xì)胞(如成骨、成軟骨及成脂肪細(xì)胞等)或非間充質(zhì)系列細(xì)胞分化的潛能，并具有獨(dú)特的細(xì)胞因子分泌功能。

胎盤(pán)主要起源于細(xì)胞滋養(yǎng)層和胚外中胚層的胎兒叢密絨毛膜和母體子宮蛻膜共同組成。胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)表達(dá)類(lèi)似于骨髓msc的表面標(biāo)志，如間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志sh2/cd105、sh3,4/cd73、cd90/thy-1、cd166；主要組織相容性復(fù)合物ma—abc；整合蛋白家族cd49e、cd29；透明質(zhì)酸鹽受體cd44等，不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志cd34、cd45、cd14，hla-dr和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志vwf、flk-1、cd31、kdr等，同時(shí)也不表達(dá)共刺激分子cd80、cd86、cd40l等。胎盤(pán)來(lái)源的多能細(xì)胞(pd-mc)還可表達(dá)某些胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記ssea4、tra-1-60，tra-1-80，提示pdmc可能是非常原始的細(xì)胞群，介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間，比成體干細(xì)胞(asc)具有更廣泛的自我更新和多系分化能力。胎盤(pán)分泌大量孕酮，用于維持人正常孕期，參 見(jiàn)parolini,o.等人,concisereview:isolationandcharacterizationofcellsfromhumantermplacenta:outcomeofthefirstinternationalworkshoponplacentaderivedstemcells.stemcells,2008.26(2):p.300-11；sousa,b.r.,等人,humanadultstemcellsfromdiverseorigins:anoverviewfrommultiparametricimmunophenotypingtoclinicalapplications.cytometrya,2014.85(1):p.43-77；maliqueo,m.,等人,placentalsteroidogenesisinpregnantwomenwithpolycysticovarysyndrome.eurjobstetgynecolreprodbiol,2013.166(2):p.151-5；wu,l.,等人,abnormalregulationforprogesteroneproductioninplacentawithprenatalcocaineexposureinrats.placenta,2012.33(12):p.977-81；thibeault,a.a.,等人,auniqueco-culturemodelforfundamentalandappliedstudiesofhumanfetoplacentalsteroidogenesisandinterferencebyenvironmentalchemicals.environhealthperspect,2014.122(4):p.371-7。

在哺乳動(dòng)物中，性腺和腎上腺是主要固醇生成器官。男性睪丸中l(wèi)eydig細(xì)胞和女性卵巢中粒殼細(xì)胞分別負(fù)責(zé)產(chǎn)生雄激素和雌激素，而腎上腺皮質(zhì)負(fù)責(zé)產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，在除大鼠外其他物種中，腎上腺同樣分泌少量雄激素，參見(jiàn)andric,s.a.,等人,testosterone-inducedmodulationofnitricoxide-cgmpsignalingpathwayandandrogenesisintheratleydigcells.biolreprod,2010.83(3):p.434-42。雄激素缺乏是臨床常見(jiàn)的難治性疾病，目前的主要治療方法是雄激素補(bǔ)充或替代療法，外源性雄激素?zé)o法接受下丘腦-垂體-性腺軸的生理調(diào)節(jié)，易造成體內(nèi)激素失調(diào)，而且反復(fù)注射會(huì)誘發(fā)前列腺癌等，產(chǎn)生多種副作用，所以急需尋找更好的治療方法。與之相比，leydig細(xì)胞移植法具有明顯優(yōu)勢(shì)，是雄激素缺乏性疾病可靠、理想治療途徑，但是種子細(xì)胞來(lái)源不足和免疫排斥是制約該技術(shù)的主要瓶頸。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞移植療法應(yīng)運(yùn)而生，受到人們的廣泛關(guān)注。如果能將干細(xì)胞體外高效誘導(dǎo)成有功能的leydig細(xì)胞，移植到患者體內(nèi)，將為雄激素缺乏性疾病治療帶來(lái)希望，參見(jiàn)basaria,s.,malehypogonadism.lancet,2013。

leydig細(xì)胞是睪丸內(nèi)的支持細(xì)胞，睪丸分成兩個(gè)部分：小管區(qū)隔和間質(zhì)。生精小管由sertoli細(xì)胞構(gòu)成支架，環(huán)繞生殖細(xì)胞，外周有管周肌樣細(xì)胞(pmcs)包圍小管結(jié)構(gòu)，間質(zhì)由leydig細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞和血管構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)植入sertoli細(xì)胞基底膜和pmss細(xì)胞之間的細(xì)胞外基質(zhì)中。睪丸內(nèi)存在一種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在男性性腺發(fā)育一開(kāi)始就進(jìn)行了精確的時(shí)間上和空間上調(diào)控，啟動(dòng)和維持睪丸功能。內(nèi)爾泌和旁分泌通路，包括激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及直接的細(xì)胞接觸綜合起來(lái)，在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間、細(xì)胞和環(huán)境三方面起作用。

leydig細(xì)胞分化在小鼠中分四個(gè)階段：從干性leydig細(xì)胞發(fā)育成前體leydig細(xì)胞、未成熟leydig細(xì)胞和成熟leydig細(xì)胞，在人體中階段性并不顯著，三個(gè)階段是可以確定的：新生兒leydig細(xì)胞、幼兒期(出生后一年到青春期前)leydig細(xì)胞、青春期后的leydig細(xì)胞。細(xì)胞分化時(shí)伴隨著胞漿體積增大、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)育、線粒體大小和數(shù)量增加、核增大和胞漿脂滴增加。形態(tài)改變同時(shí)，固醇生成酶和黃體生成素/人絨毛膜促性腺激素受體lhr增加，睪酮產(chǎn)生能力增加。

leydig細(xì)胞分泌機(jī)體95％的睪酮，剩下5％是腎上腺細(xì)胞分泌的。leydig細(xì)胞分成兩類(lèi)：胎兒型leydig細(xì)胞(flc)和成體型leydig細(xì)胞(alc)。flc同腎上腺細(xì)胞一樣起源于體腔上皮和中腎間質(zhì)，屬于中胚層來(lái)源，分泌睪酮和其他雄激素，負(fù)責(zé)胎兒雄性化，出生后退化消失，由sertoli細(xì)胞分泌的dhh和fgf9啟動(dòng)調(diào)控其增殖分化。alc出現(xiàn)于青春期以后，新生兒第一年到青春期前已經(jīng)產(chǎn)生，處于未成熟階段，青春期時(shí)成熟的alc數(shù)量增加，可能是因?yàn)榇罅磕技绑w細(xì)胞(如間質(zhì)原始成纖維細(xì)胞和管周成纖維細(xì)胞)，并且受內(nèi)分泌的促性腺激素和旁分泌的生長(zhǎng)因子刺激，參見(jiàn)yazawa,t.,etal.,differentiationofadultstemcellsderivedfrombonemarrowstromaintoleydigoradrenocorticalcells.endocrinology,2006.147(9):p.4104-11。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)育過(guò)程中存在四種leydig細(xì)胞，leydig干細(xì)胞(leydigstemcells/slc),leydig前體細(xì)胞(leydigprogenitorcells/plc),未成熟leydig細(xì)胞(immatureleydigcells/ilc)和成體leydig細(xì)胞(adultleydigcells/alc)。slc不表達(dá)leydig譜系特異性基因，不分泌睪酮。但是plc、ilc、alc都表達(dá)leydig特異性標(biāo)記基因p450側(cè)鏈裂解酶cyp11a1(p450scc),3β-羥固醇脫氫酶(3β-hsd),細(xì)胞色素p45017α羥化酶(p450c17)、黃體生成素受體lhr，參見(jiàn)wei,x.,etal.,differentiationofumbilicalcordmesenchymalstemcellsintosteroidogeniccellsincomparisontobone marrowmesenchymalstemcells.cellprolif,2012.45(2):p.101-10。

在每種固醇生成組織中(如卵巢、睪丸、腎上腺、胎盤(pán)等)，細(xì)胞色素p450家族(p450scc,p450c21,p450c17,p450c11,etc.)和羥固醇脫氫酶家族(3βhsdand17βhsd)都作為固醇類(lèi)激素生物合成的催化劑，催化一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終把膽固醇變成固醇類(lèi)產(chǎn)物。在不同細(xì)胞類(lèi)型中，這些酶表達(dá)水平不同，合成的激素也就不同，參見(jiàn)tsai,l.c.andj.a.beavo,therolesofcyclicnucleotidephosphodiesterases(pdes)insteroidogenesis.curropinpharmacol,2011.11(6):p.670-5。

如果能將胎盤(pán)來(lái)源msc轉(zhuǎn)變成生成雄激素睪酮的leydig細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞移植治療，將解決種子細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題，滿(mǎn)足臨床需要。

在本專(zhuān)利申請(qǐng)中，本發(fā)明人公開(kāi)了一種將胎盤(pán)來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)定向誘導(dǎo)為可分泌雄激素睪酮的leydig細(xì)胞，該leydig細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞移植治療，解決種子細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題，滿(mǎn)足臨床需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人使用北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)科來(lái)源的胎盤(pán)組織成功分離msc，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)、表型和分化潛能的鑒定。通過(guò)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)黃體生成素(lh)的高度類(lèi)似物人絨毛膜促性腺激素(hcg)、血小板源性生長(zhǎng)因子(pdgf)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(igf-1)以及巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子如白介素1α(il-1α)從內(nèi)分泌、旁分泌層面上對(duì)leydig細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，可以促進(jìn)固醇生成相關(guān)基因表達(dá)，使這種亞全能干細(xì)胞產(chǎn)品具有激素分泌功能。

一方面，本發(fā)明提供了一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為leygid細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：

a)在適合于細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞；

b)在步驟a)中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞至亞融合狀態(tài)時(shí)，向培養(yǎng)基中添加100iu/ml人絨毛膜促性腺激素、20ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、10ng/ml人血小板源性生長(zhǎng)因子以及0.0005ng/ml白介素1-α；

c)繼續(xù)培養(yǎng)0-14天后，收集并鑒定定向分化的leygid細(xì)胞。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于哺乳動(dòng)物胎盤(pán)，更優(yōu)選地，來(lái)自人胎盤(pán)細(xì)胞。

特別地，根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述胎盤(pán)來(lái)源的哺乳動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)，具有flk1陽(yáng)性的表型，具有三胚層多譜系的分化能力，但不具有成瘤性。更優(yōu)選地，其全能基因包括oct4、nanog、c-myc、sall4、sox2、klf4；外胚層早期分化相關(guān)基因包括hoxa1、gbx2、six1和olig3；中內(nèi)胚層早期分化相關(guān)基因t、pgdfrα、eomes、tbx6和mixl1；中胚層早期分化相關(guān)基因kdr、hand1、gata4和mesp2；限定性?xún)?nèi)胚層早期分化相關(guān)基因onecut1、prox1、foxa1、foxa2、sox7、sox17、pdx1和gsc的甲基化修飾狀態(tài)以活化或h3k4me3和h3k27me3共存的雙價(jià)修飾為主。

進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中在步驟b)中進(jìn)一步加入1xits或1％fbs。

另一方面，本發(fā)明提供了一種體外誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌睪酮的方法，所述方法包括胰腺癌步驟：

a)在適合于細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞；

b)在步驟a)中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞至亞融合狀態(tài)時(shí)，向培養(yǎng)基中添加100iu/ml人絨毛膜促性腺激素、20ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、10ng/ml人血小板源性生長(zhǎng)因子以及0.0005ng/ml白介素1-α；

c)繼續(xù)培養(yǎng)0-14天后，收集上清液并測(cè)定睪酮的含量。

另一方面，本發(fā)明提供了一種用于體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為leygid細(xì)胞的組合物，所述組合物包括100iu/ml人絨毛膜促性腺激素、20ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、10ng/ml人血小板源性生長(zhǎng)因子以及0.0005ng/ml白介素1-α。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物，進(jìn)一步包括1xits或1％fbs。

另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)權(quán)利本發(fā)明的組合物用于體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為leygid細(xì)胞的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的組合物用于體外誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌睪酮的用途。

附圖說(shuō)明

圖1a表明胎盤(pán)flk1+msc形態(tài)；圖1b表明胎盤(pán)flk1+msc表型鑒定結(jié)果。

圖2a-2c表明胎盤(pán)flk1+msc成脂成骨分化能力鑒定結(jié)果。圖2a表明二代胎盤(pán)msc成骨6天堿磷酶(alp)染色；圖2b表明二代胎盤(pán)msc成骨14天茜素紅染色；圖2c表明二代胎盤(pán)msc成脂油紅o染色。

圖3表明胎盤(pán)flk1+msc向睪丸leydig細(xì)胞誘導(dǎo)后睪酮激素分泌功能鑒定結(jié)果。

圖4a至圖4f表明胎盤(pán)msc成脂成骨誘導(dǎo)基因鑒定結(jié)果：前四個(gè)是成脂相關(guān)基因，后兩個(gè)是成骨相關(guān)基因。

圖5a至圖5f表明胎盤(pán)flk1+msc向睪丸leydig細(xì)胞或固醇生成細(xì)胞誘導(dǎo)后基因鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。

實(shí)施例

實(shí)施例1flk1+間充質(zhì)干細(xì)胞(flk1+msc)的獲得及分化能力的驗(yàn)證

為了評(píng)估flk1+msc的臨床應(yīng)用價(jià)值，我們首先其分化能力進(jìn)行了驗(yàn)證。

胎盤(pán)組織取自北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，剖腹產(chǎn)手術(shù)后獲得無(wú)菌胎盤(pán)組織塊。采集出來(lái)的脂肪組織用d-hanks洗去血細(xì)胞和麻醉藥，反復(fù)數(shù)次，用鑷子剪刀等剪成1-2mm米粒大小，0.2％ii型膠原酶消化1.5-2h小時(shí)，之后用d-hanks洗滌2次以除去膠原酶。離心收集細(xì)胞，細(xì)胞 以2×10⁶/ml的密度接種于含58％dmem/f12+40％mcdb-201、5％胎牛血清(fcs)、10ng/mlegf、10ng/mlpdgf，1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸(insulin-transferrin-selenium，its)、1×亞油酸-牛血清白蛋白(linoleicacid-bovineserumalbumin，la-bsa)，50μmβ巰基乙醇，2mml-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100u/ml硫酸鏈霉素的培養(yǎng)液，37℃、5％co2、95％濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2天后換液，棄去未貼壁的細(xì)胞，以后隔天換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70％～80％匯合時(shí)，0.25％胰酶(gibco公司)常規(guī)消化，細(xì)胞按照1：3進(jìn)行傳代。

將獲得的flk1+msc分成6等份，分別向肝上皮、神經(jīng)、造血、成脂肪及成骨譜系誘導(dǎo)分化，另一份細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增后用于各譜系分化的對(duì)照。誘導(dǎo)14天后，光鏡下可見(jiàn)成脂誘導(dǎo)組細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿(mǎn)了脂肪滴，油紅o染色陽(yáng)性率達(dá)80％，實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)顯示成脂標(biāo)志基因ap2及l(fā)pl高表達(dá)；成骨誘導(dǎo)組alp及茜素紅染色陽(yáng)性率達(dá)65％，實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)顯示，成骨標(biāo)志基因alp和opn表達(dá)較誘導(dǎo)前明顯上調(diào)。flk1+msc向造血方向誘導(dǎo)第3天，造血相關(guān)的標(biāo)志分子osteocalcin(oc)、c-kit和cd34染色陽(yáng)性，誘導(dǎo)14天時(shí)可見(jiàn)bfu-e(紅系爆式集落形成單位)、cfu-g(巨嗜細(xì)胞集落形成單位)、cfu-mk(巨核細(xì)胞集落形成單位)和hpp-cfc(高增殖潛能細(xì)胞集落形成單位)等各系造血集落的形成。誘導(dǎo)第21天，肝上皮誘導(dǎo)組細(xì)胞ck8、ck18和ck19免疫組化檢測(cè)陽(yáng)性。誘導(dǎo)第12天，神經(jīng)誘導(dǎo)組細(xì)胞nestin和musashi免疫組化檢測(cè)陽(yáng)性。

上述結(jié)果表明，flk1+msc在一定的誘導(dǎo)條件下能夠向肝上皮、神經(jīng)、造血及成脂和成骨等不同胚層來(lái)源的多譜系方向分化。

實(shí)施例2：胎盤(pán)來(lái)源flk1+msc免疫表型的鑒定(流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè))

(1)采用間接免疫熒光染色法進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。收集第二代狀態(tài)良好的細(xì)胞，常規(guī)0.125％的edta胰蛋白酶(含0.01％的edta)消化；

(2)細(xì)胞分散均勻后取少量細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，其余細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，1200rpm離心5分鐘；

(3)棄上清，收集細(xì)胞沉淀，輕彈管底使細(xì)胞分散，用含d-hank’s重懸后，分裝到流式管中，每管約5×105個(gè)細(xì)胞；

(4)加入一抗，4℃孵育30分鐘。一抗為cd73、cd90、cd29、cd34、cd31、cd44、cd105、hla-dr和flk1(細(xì)胞在孵育flk1之前，先用用bd的cytofix/cytopermtmfixation/permeabilizationkit固定破膜)，選用同種同型非相關(guān)igg抗體作為陰性對(duì)照；

(5)30分鐘后，用d-hank’s或破膜試劑盒專(zhuān)用洗液洗2遍，去除未結(jié)合的一抗；

(6)加入fitc標(biāo)記的二抗，4℃避光孵育30分鐘；

(7)用0.5％牛血清白蛋白的pbs洗液洗2遍，去除未結(jié)合的二抗；

(8)棄上清，用200μl4％的多聚甲醛重懸細(xì)胞沉淀，避光于冰上放置，待流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

結(jié)果表明：胎盤(pán)來(lái)源msc高表達(dá)msc經(jīng)典的陽(yáng)性標(biāo)記cd73、cd90、cd105、cd29、cd44，不表達(dá)內(nèi)皮和造血譜系標(biāo)記cd31、cd34，并且不表達(dá)mhcii類(lèi)分子hla-dr，證實(shí)了原代分離的細(xì)胞經(jīng)貼壁傳代用msc特異培養(yǎng)基篩選以后，獲得了純度較高的間充質(zhì)干細(xì)胞(參見(jiàn)圖1a-1b)。

實(shí)施例3：胎盤(pán)來(lái)源flk1+msc成脂成骨誘導(dǎo)后染色鑒定

胎盤(pán)來(lái)源msc成脂誘導(dǎo)過(guò)程

(1)取第二代的人胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)消化計(jì)數(shù)，按2×104/cm2的密度接種于六孔板或培養(yǎng)皿中；

(2)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待生長(zhǎng)至80％匯合時(shí)，將培養(yǎng)基換成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

(3)每三天更換培養(yǎng)液一次，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變及細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況。

胎盤(pán)來(lái)源msc成骨誘導(dǎo)過(guò)程

(1)取第二代的人胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)消化計(jì)數(shù)，按2×104/cm2的密度接種于六孔板或培養(yǎng)皿中；

(2)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70％匯合時(shí)，將培養(yǎng)基換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；

(3)每三天更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞外基質(zhì)鈣化情況。

脂肪細(xì)胞油紅o染色

(1)油紅o母液的配制：0.5g油紅o粉末+100ml異丙醇，60℃水浴30分鐘溶解，避光保存；

(2)油紅o工作液的配制(配好后2小時(shí)內(nèi)使用)：油紅o母液：蒸餾水＝3：2混勻，室溫放置30分鐘，過(guò)濾后使用；

(3)棄去培養(yǎng)基，用pbs洗2遍；

(4)10％福爾馬林4℃固定10分鐘，pbs輕輕洗2遍；

(5)60％的異丙醇溶液輕輕涮洗細(xì)胞，置換殘余的水分；

(6)加入油紅o工作液染色20分鐘；

(7)蒸餾水洗3次，顯微鏡下觀察并拍照。

成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(alp)染色

(1)使用中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司生產(chǎn)的堿性磷酸酶(alp)試劑盒對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行染色，操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)；

(2)配制工作液：取2號(hào)液10ml，3號(hào)液200μl，加入4號(hào)粉10mg，震搖速溶，用濾紙過(guò)濾，除去未溶解的粉劑；

(3)取待染色細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，pbs輕輕洗2遍；

(4)加入試劑盒內(nèi)的1號(hào)液數(shù)滴，室溫固定1分鐘，流水漂洗2分鐘，晾干；

(5)將配好的工作液滴加到細(xì)胞上，置濕盒內(nèi)，37℃孵育2小時(shí)；

流水沖洗2分鐘，顯微鏡下觀察并拍照。

成骨細(xì)胞茜素紅染色：

(1)工作液配制：1％茜素紅40ml，加入茜素紅粉劑0.2g，加入10ul氨水調(diào)節(jié)ph到7.3。

(2)棄去培養(yǎng)基，用pbs洗2遍；

(3)加入試劑盒內(nèi)的1號(hào)液數(shù)滴，室溫固定1分鐘，流水漂洗2分鐘，晾干；

(4)將配好的工作液滴加到細(xì)胞上，置濕盒內(nèi)，37℃孵育30分鐘；

(5)蒸餾水洗3次，顯微鏡下觀察并拍照。

該結(jié)果表明：胎盤(pán)來(lái)源msc的確具有成脂成骨分化潛能，是一種 具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，是作為臨床移植的理想種子細(xì)胞來(lái)源(參見(jiàn)圖2a-2c；圖4a-4f)。

實(shí)施例4：誘導(dǎo)胎盤(pán)來(lái)源的flk1+msc定向分化為leydig細(xì)胞

(1)取第二代的人胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)消化計(jì)數(shù)，按2×104/cm2的密度接種于六孔板或培養(yǎng)皿中；

(2)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待生長(zhǎng)至70％～80％匯合時(shí)，將培養(yǎng)基換成leydig細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

(3)每三天更換培養(yǎng)液一次，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變

實(shí)驗(yàn)分為3組：實(shí)驗(yàn)1組誘導(dǎo)液各成分及終濃度分別是人黃體生成素高度類(lèi)似物/人絨毛膜促性腺激素(lh/hcg)100iu/ml、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(igf-1)20ng/ml、人血小板源性生長(zhǎng)因子(pdgf)10ng/ml、白介素1-α(il-1α)0.0005ng/ml、1×its。實(shí)驗(yàn)2組誘導(dǎo)液各成分終濃度分別是人黃體生成素高度類(lèi)似物/人絨毛膜促性腺激素(lh/hcg)100iu/ml、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(igf-1)20ng/ml、人血小板源性生長(zhǎng)因子(pdgf)10ng/ml、白介素1-α(il-1α)0.0005ng/ml、1％fbs。第三組為對(duì)照組，即正常培養(yǎng)條件下胎盤(pán)msc，于細(xì)胞密度達(dá)95％以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。該誘導(dǎo)方法是模擬leydig細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育微環(huán)境，誘導(dǎo)體系一開(kāi)始將所有誘導(dǎo)成分混合以后同時(shí)添加，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)14天，并分別于0天、7天、14天用trizol法和ripa+pmsf法收集rna和蛋白樣品，同時(shí)收集細(xì)胞誘導(dǎo)上清用于檢測(cè)激素分泌水平。

實(shí)施例5：胎盤(pán)來(lái)源的msc向leydig細(xì)胞誘導(dǎo)后q-pcr分析

(1)細(xì)胞總rna的提取(參照invitrogen公司的trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，具體如下：

1)棄培養(yǎng)液，按1-5×10⁶細(xì)胞1ml的量加入trizol，室溫孵育5分鐘，輕輕吹打使細(xì)胞充分裂解，待細(xì)胞裂解完全后，將裂解液移至無(wú)rna酶的1.5mleppendorf(ep)管中；

2)每毫升trizol加0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2-3分鐘； 4℃12000g。

離心15分鐘；

3)離心后，試管中形成兩相，下層酚-氯仿相，中間白色蛋白，上層無(wú)色水相。rna在水相，將上層水相轉(zhuǎn)移到新的ep管，注意勿吸到白膜層；

4)rna的沉淀：每毫升trizol加0.5ml異丙醇，沉淀rna。室溫孵育10分鐘，4℃12000g離心10分鐘；

5)rna的清洗：棄上清，按trizol與乙醇1：1的比例，加75％的乙醇清洗rna沉淀，渦旋震蕩，4℃，7500g離心5分鐘；

6)rna的干燥：自然風(fēng)干或真空干燥5-10分鐘，注意不要過(guò)分干燥，否則會(huì)降低rna的溶解度；

7)rna的溶解：用25-30微升depc水溶解rna，可將樣品于55-60℃水浴中放置10分鐘，以增加溶解度；

8)取2μl溶解后的rna溶液用紫外分光光度儀檢測(cè)rna的純度及含量，余下的rna溶液可置于-80℃保存，避免反復(fù)凍融

(2)cdna的合成:具體操作參照m-mlv產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，大致如下：

1)在0.2ml無(wú)菌無(wú)酶ep管中加入以下試劑：

2)輕輕混勻后，70℃溫浴10分鐘,之后立即冰浴2分鐘,稍加離心；

3)在上述ep管中直接加入下列成分：

4)混勻后42℃反轉(zhuǎn)錄60分鐘，72℃滅活15分鐘，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

(3)realtimepcr反應(yīng)：

1)在0.2mlep管中加入下列成分，配成20ul反應(yīng)體系，

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10分鐘后，之后開(kāi)始40個(gè)循環(huán)：94℃變性15秒，60℃退火40秒，延伸40秒。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)溶解曲線分析證實(shí)產(chǎn)物的特異性，每對(duì)引物的反應(yīng)均包括一個(gè)無(wú)模板(用ddh2o代替模板)對(duì)照。

該結(jié)果表明：胎盤(pán)來(lái)源msc經(jīng)誘導(dǎo)以后，leydig細(xì)胞固醇生成相關(guān)基因在rna水平上和正常對(duì)照組比較明顯上調(diào)，參見(jiàn)圖5a-5f。也就是說(shuō)，我們最終獲得的細(xì)胞確實(shí)是leydig細(xì)胞。

實(shí)施例6胎盤(pán)msc誘導(dǎo)上清激素分泌檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)上清收集以后，凍存于-20℃冰箱，采用了北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀來(lái)檢測(cè)睪酮(testosterone)的分泌水平。電化學(xué)發(fā)光儀是用于檢測(cè)人體內(nèi)分泌激素的醫(yī)學(xué)儀器。該儀器由日本日立公司生產(chǎn)出品，采用瑞士羅氏公司全套進(jìn)口試劑，應(yīng)用國(guó)際領(lǐng)先的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，檢測(cè)多項(xiàng)內(nèi)分泌激素。其特點(diǎn)是快速、微量、準(zhǔn)確。檢測(cè)項(xiàng)目包括生殖內(nèi)分泌激素：雌二醇、睪酮、人絨毛膜促性腺激素等。

該結(jié)果說(shuō)明：胎盤(pán)來(lái)源的msc經(jīng)誘導(dǎo)以后，從初步檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，獲得細(xì)胞具有了分泌雄激素(睪酮)的功能，參見(jiàn)圖3。從功能上進(jìn)一步驗(yàn)證了，我們誘導(dǎo)后的細(xì)胞確實(shí)是睪丸leydig細(xì)胞。