本發(fā)明涉及了一種微納米生物材料及其應(yīng)用，具體是涉及了一種促進間充質(zhì)干細胞分化的微納米拓撲結(jié)構(gòu)制備及分化方法，獲得的材料應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)和替代。

技術(shù)背景

模擬天然骨骼主要成分，利用仿生方法制備生物支架材料來進行骨缺損的修復(fù)和替代是治療骨缺損的重要方法。骨修復(fù)和骨替代材料表面性質(zhì)對細胞在材料上的整合具有重要的意義，可以直接影響細胞在材料上的細胞行為。許多研究表明，與光滑或非周期性表面相比，材料(一般為金屬和合成高分子)表面的納米拓撲結(jié)構(gòu)，如納米溝壑、納米管、粗糙結(jié)構(gòu)能夠影響細胞在材料表面的粘附、鋪展及增殖，并促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。近來，間充質(zhì)干細胞以其獨有的多向分化潛能，低免疫源性和快速的增殖能力等特性，成為組織工程學(xué)種子細胞的的新手段。

在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞定向分化的研究中，常用的分化細胞的方法是直接將間充質(zhì)干細胞種植在材料表面進行長時間培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中添加細胞誘導(dǎo)分化因子并不斷進行換代操作。然而此操作過程繁瑣，誘導(dǎo)分化效果不佳。尤其當(dāng)細胞和骨修復(fù)支架材料相結(jié)合植入體內(nèi)時，前期須將間充質(zhì)干細胞完全誘導(dǎo)成成骨細胞后才能植入到體內(nèi)，此過程中將消耗大量時間和工作量。因此，如何將間充質(zhì)干細胞在不添加骨誘導(dǎo)液的情況下，通過體外微環(huán)境使得干細胞分化成成骨細胞，是現(xiàn)有技術(shù)的一個難題。

絲蛋白是一種天然高分子聚合物，由于絲蛋白具有可生物降解性、獲取方法簡便，而且能促進細胞在材料表面的粘附、支持細胞的擴展和生長，維持細胞的正常形態(tài)和功能，可塑性強等優(yōu)點，在藥物緩釋材料、生物傳感器、生物醫(yī)學(xué)材料、組織工程等領(lǐng)域的應(yīng)用得到廣泛的關(guān)注。絲蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種人體所需的氨基酸組成。這些酸性氨基酸富含羧基官能團，對調(diào)節(jié)磷灰石的吸附和排列起著主要作用，改變晶體生長的過程及其最終形貌，是礦化成核過程中關(guān)鍵的調(diào)控因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決

背景技術(shù)：
中存在問題，本發(fā)明公開了一種促進間充質(zhì)干細胞分化的微納米拓撲結(jié)構(gòu)制備及分化方法，在絲蛋白表面原位調(diào)控磷灰石晶體的生成，從而形成具有特定拓撲結(jié)構(gòu)的生物材料并誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞的成骨分化。

本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是包括如下步驟：

一、一種促進間充質(zhì)干細胞分化的微納米拓撲結(jié)構(gòu)制備方法，包括如下步驟：

(1)制備水溶性絲蛋白溶液作為模板，再超聲處理10min。

(2)將CaCl₂加入到100mL的水溶性絲蛋白溶液中進行預(yù)礦化，CaCl₂的加入濃度為20mM，持續(xù)攪拌使CaCl₂完全溶解；

(3)將100mL的濃度為12mM的Na₂HPO₄溶液通過恒流泵裝置緩慢滴入到步驟(2)獲得的溶液中進行礦化；

(4)礦化后繼續(xù)使用磁力攪拌器攪拌，使得磷灰石晶體在水溶性絲蛋白溶液上層積一段時間，獲得層積后的溶液，層積的時間決定了微納米拓撲結(jié)構(gòu)的形貌及其作用；

(5)將獲得的溶液在6000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，傾去上清液，收集沉淀的礦化物，加入去離子水混合均勻；

(6)重復(fù)上述步驟(5)至少一次，將獲得的溶液滴加到塑料板或者具有微納米結(jié)構(gòu)特征的模具中，固化成型使得絲蛋白和磷灰石復(fù)合成膜，膜表面具有不同形貌的微納米結(jié)構(gòu)，作為微納米拓撲結(jié)構(gòu)。

所述步驟3)礦化過程中，礦化反應(yīng)溫度控制在4℃-80℃之間，滴加速率控制為0.2-20mL/min，滴加時通過滴入0.1M的NaOH溶液使得反應(yīng)體系的pH恒定為9.5并使用磁力攪拌器攪拌。

所述步驟(1)中絲蛋白采用但不限于家蠶絲素、絲膠蛋白、絲腺蛋白、野蠶絲素、絲膠蛋白、蜘蛛絲蛋白或者重組絲蛋白。

所述步驟(3)加入的Na₂HPO₄溶液與所述步驟(2)加入的CaCl₂溶液的量使Ca和P元素的摩爾質(zhì)量比為1.67。

所述步驟(4)中，通過改變層積時間的礦化條件改變微納米拓撲結(jié)構(gòu)表面的形貌。

為更好地促進細胞在復(fù)合膜表面的粘附，在制備獲得的所述微納米拓撲結(jié)構(gòu)表面繼續(xù)覆蓋一層膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、整合素和多聚賴氨酸中的一種或者進行親水性處理。

本發(fā)明所述的微納米拓撲結(jié)構(gòu)的形貌包括表面粗糙度和特定幾何形狀等。

本發(fā)明首次將生物礦化方法用于材料不同微納米拓撲結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。通過調(diào)控礦化的條件(如絲蛋白濃度、礦化時間、pH、礦化溫度等)，使得磷灰石在絲蛋白表面形成不同微納米級別的粗糙度，從而形成固定的拓撲結(jié)構(gòu)。

所述的表面磷灰石與絲蛋白基材之間無明顯分層，在分子水平上的緊密鍵合，界面粘結(jié)性好，力學(xué)強度高。在不加入任何細胞分化誘導(dǎo)因子的條件下，該拓撲納米結(jié)構(gòu)能夠顯著促進間充質(zhì)干細胞在基材表面的堿性磷酸酶活性和成骨相關(guān)基因的表達，表現(xiàn)出優(yōu)良的向骨細胞分化誘導(dǎo)能力。

通過絲蛋白中含量較高的酸性氨基酸(包括天門冬氨酸和谷氨酸)能夠誘導(dǎo)Ca²⁺在絲蛋白肽鏈上的結(jié)合，進而調(diào)控磷灰石晶體的成核及生長。改變礦化的條件(如絲蛋白濃度、礦化時間、pH、礦化溫度等)，生成的磷灰石晶體在絲蛋白表面層積使得材料表面的幾何拓撲結(jié)構(gòu)不同，從而達到調(diào)控絲蛋白表面納米拓撲結(jié)構(gòu)的目的。

二、本發(fā)明中制備獲得的能夠誘導(dǎo)分化的微納米拓撲結(jié)構(gòu)能夠應(yīng)用于促進間充質(zhì)干細胞分化中，應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)和替代，所使用的方法是一種具有廣闊應(yīng)用前景的生物材料表面改性、修飾的方法。

所制備的微納米拓撲結(jié)構(gòu)生物材料在結(jié)構(gòu)和功能上與天然骨組織相似，用于骨損傷的治療和修復(fù)方向。

三、一種微納米拓撲結(jié)構(gòu)促進間充質(zhì)干細胞分化方法：通過間充質(zhì)干細胞粘附到權(quán)利要求1-6任一所述的微納米拓撲結(jié)構(gòu)上，對磷灰石和絲蛋白復(fù)合的所述微納米拓撲結(jié)構(gòu)進行篩選，得到具有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨分化的微納米拓撲結(jié)構(gòu)。

由于上述技術(shù)方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出的優(yōu)勢和特點：

(1)磷灰石生長取向為蠶絲蛋白膜的Z-軸方向，與絲蛋白之間的粘結(jié)性好、結(jié)合牢固，絲蛋白和磷灰石形成的復(fù)合物顆粒在材料表面分散均勻。

(2)良好的生物相容性：絲蛋白膜或者降解物對細胞或組織無毒性反應(yīng)，并表現(xiàn)出較高的增殖率，能夠在基底膜上牢固粘附，具有良好的生物相容性，生物安全性高，能滿足生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

(3)可塑性強，通過調(diào)控礦化實驗條件或者使用不同的模具形貌可制備出基質(zhì)材料不同微納米納米級別的拓撲結(jié)構(gòu)。

(4)與現(xiàn)有的細胞分化方法相比，更加廉價、高效、方便。細胞無需前期添加骨誘導(dǎo)液，能大規(guī)模將間充質(zhì)干細胞分化成成骨細胞。與一般基質(zhì)表面相比，能夠極顯著促進堿性磷酸酶活性和成骨相關(guān)基因的表達，增強骨向分化誘導(dǎo)能力。

附圖說明

圖1為實施例1中種礦化2小時后得到的絲蛋白/磷灰石膜。

圖2為實施例2中種礦化24小時后得到的絲蛋白/磷灰石膜。

圖3為實施例3中種礦化48小時后得到的絲蛋白/磷灰石膜。

圖4為實施例1中間充質(zhì)干細胞接種在復(fù)合膜材料上第5天的細胞形貌圖。

圖5為實施例4中間充質(zhì)干細胞接種在復(fù)合膜材料上第24小時的細胞形貌圖。

圖6為實施例1，2，3，4中間充質(zhì)干細胞接種在復(fù)合膜材料上培養(yǎng)14天的堿性磷酸酶染色結(jié)果圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。

本發(fā)明的實施例如下：

實施例1

(1)制備水溶性蠶絲蛋白溶液，將絲蛋白溶液濃度調(diào)整為1mg/mL，并進行超聲處理10min。

(2)將CaCl₂顆粒加入到100mL步驟(1)中的絲蛋白溶液中進行預(yù)礦化1h，持續(xù)攪拌使CaCl₂完全溶解，使得CaCl₂的最終濃度為20mM。

(3)將100mL摩爾濃度為12mM的Na₂HPO₄溶液通過恒流泵裝置緩慢滴入到將步驟(2)中的溶液中進行礦化，滴加速率控制為10mL/min，期間使用磁力攪拌器攪拌。礦化溫度控制在4℃之間，通過滴入0.1M的NaOH該溶液使得該體系的pH恒定為9.5。

滴加完后繼續(xù)以較快的轉(zhuǎn)速攪拌2h，使得磷灰石晶體在蠶絲蛋白溶液模板上層積。

(4)48小時后取出步驟(3)中的溶液，在6000rpm下離心10min，傾去上清液，收集礦化物沉淀，加入足量去離子水吹打均勻，此步驟重復(fù)兩次。

然后滴加10mL到聚乙烯板中，固化成型，得到絲蛋白和磷灰石復(fù)合膜，粗糙度為0.05微米，其微觀形貌如圖1所示。

(5)將步驟(4)中的復(fù)合膜用于細胞培養(yǎng)，過程如下：

復(fù)合膜UV照射滅菌，之后浸泡在含有10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中24h進行平衡。接著使用體外培養(yǎng)第3代的人BMSCs作為檢測細胞，空白孔作為對照，把BMSCs(2×10⁴細胞/mL)接種到24孔板中，在37℃，5％CO₂的濕潤環(huán)境條件培養(yǎng)14天。實施中將中間充質(zhì)干細胞接種在復(fù)合膜材料上第五天的細胞形貌如圖4所示，細胞立體感較差，細胞粘附效果不佳。

ALP分析表明，該復(fù)合膜的OD值與空白對照組(未進行拓撲改性組)的OD值相差不大，無顯著性差異。堿性磷酸酶結(jié)果如圖6所示(左側(cè)第2幅圖)與對照組(左側(cè)第1幅圖)相比，差別不大。熒光定量分析表明，相成骨分化的mRNA表達量與對照組相差不大，因此短時間內(nèi)(2h)礦化得到的微納米拓撲結(jié)構(gòu)不具有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨分化的能力。

實施例2

(1)制備水溶性絲蛋白溶液，將絲蛋白溶液調(diào)整為1mg/mL，并進行超聲處理10min。

(2)將CaCl₂顆粒加入到100mL步驟(1)中的絲蛋白溶液中進行預(yù)礦化1h，持續(xù)攪拌使CaCl₂完全溶解，使得CaCl₂的最終濃度為20mM。

(3)將100mL摩爾濃度為12mM的Na₂HPO₄溶液通過恒流泵裝置緩慢滴入到將步驟(2)中的溶液中進行礦化，滴加速率控制為10mL/min，期間使用磁力攪拌器攪拌。礦化溫度控制在40℃之間，通過滴入0.1M的NaOH該溶液使得該體系的pH恒定為9.5。滴加完后繼續(xù)以較快的轉(zhuǎn)速攪拌24h，使得磷灰石晶體在AS模板上層積。

(4)24小時時間后取出步驟(3)中的溶液，在6000rpm下離心10min，傾去上清液，收集礦化物沉淀，加入足量去離子水吹打均勻，此步驟重復(fù)兩次。

然后滴加10mL到聚乙烯板中，固化成型，得到絲蛋白和磷灰石復(fù)合膜，粗糙度為0.38微米，其微觀形貌如圖2所示。

(5)將步驟(4)中的復(fù)合膜浸泡在0.1mg/mL的膠原Ⅰ型蛋白水溶液中，自然干燥。

(6)將步驟(5)中的復(fù)合膜用于細胞培養(yǎng)，過程如下：復(fù)合膜UV照射滅菌，之后浸泡在含有10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中24h進行平衡。使用體外培養(yǎng)第3代的人BMSCs作為檢測細胞，空白孔作為對照。把BMSCs(2×10⁴細胞/mL)接種到24孔板中，在37℃，5％CO₂的濕潤環(huán)境條件培養(yǎng)14天。

ALP分析表明，復(fù)合膜的OD值顯著高于空白對照組(未進行拓撲改性組)，其堿性磷酸酶結(jié)果如圖6所示(左側(cè)第3幅圖)，染色很強烈。熒光定量分析表明，相成骨分化的mRNA表達量高于對照組，因此得到具有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨分化的納米拓撲結(jié)構(gòu)。

實施例3

(1)制備水溶性絲蛋白溶液，將絲蛋白溶液調(diào)整為1mg/mL，并進行超聲處理10min。

(2)將CaCl₂顆粒加入到100mL步驟(1)中的絲蛋白溶液中進行預(yù)礦化1h，持續(xù)攪拌使CaCl₂完全溶解，使得CaCl₂的最終濃度為20mM。

(3)將100mL摩爾濃度為12mM的Na₂HPO₄溶液通過恒流泵裝置緩慢滴入到將步驟(2)中的溶液中進行礦化，滴加速率控制為10mL/min，期間使用磁力攪拌器攪拌。礦化溫度控制在40℃之間，通過滴入0.1M的NaOH該溶液使得該體系的pH恒定為9.5。滴加完后繼續(xù)以較快的轉(zhuǎn)速攪拌24h，使得磷灰石晶體在蠶絲蛋白模板上層積。

(4)48小時時間后取出步驟(3)中的溶液，在6000rpm下離心10min，傾去上清液，收集礦化物沉淀，加入足量去離子水吹打均勻，此步驟進行一次。

然后滴加10mL到聚乙烯板中，固化成型，得到絲蛋白和磷灰石復(fù)合膜，粗糙度為0.58微米，其微觀形貌如圖3所示。

(5)將步驟(4)中的復(fù)合膜等離子處理5min，增加膜表面的親水性。

(6)將步驟(5)中的復(fù)合膜用于細胞培養(yǎng)，過程如下：

復(fù)合膜UV照射滅菌，之后浸泡在含有10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中24h進行平衡。使用體外培養(yǎng)第3代的人BMSCs作為檢測細胞，空白孔作為對照。把BMSCs(2×10⁴細胞/mL)接種到24孔板中，在37℃，5％CO₂的濕潤環(huán)境條件培養(yǎng)14天。

ALP分析表明，復(fù)合膜的OD值顯著高于空白對照組(未進行拓撲改性組)，其堿性磷酸酶結(jié)果如圖6所示(左側(cè)第4幅圖)，染色很強烈。熒光定量分析表明，相成骨分化的mRNA表達量高于對照組，因此得到具有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨分化的納米拓撲結(jié)構(gòu)。

實施例4

(1)制備水溶性絲蛋白溶液，將絲蛋白溶液調(diào)整為1mg/mL，并進行超聲處理10min。

(2)將CaCl₂顆粒加入到100mL步驟(1)中的絲蛋白溶液中進行預(yù)礦化1h，持續(xù)攪拌使CaCl₂完全溶解，使得CaCl₂的最終濃度為20mM。

(3)將100mL摩爾濃度為12mM的Na₂HPO₄溶液通過恒流泵裝置緩慢滴入到將步驟(2)中的溶液中進行礦化，滴加速率控制為10mL/min，期間使用磁力攪拌器攪拌。礦化溫度控制在40℃之間，通過滴入0.1M的NaOH該溶液使得該體系的pH恒定為9.5。滴加完后繼續(xù)以較快的轉(zhuǎn)速攪拌24h，使得磷灰石晶體在蠶絲蛋白模板上層積。

(4)48小時時間后取出步驟(3)中的溶液，在6000rpm下離心10min，傾去上清液，收集礦化物沉淀，加入足量去離子水吹打均勻，此步驟重復(fù)一次。

然后滴加10mL到聚乙烯板中，固化成型，得到絲蛋白和磷灰石復(fù)合膜，粗糙度為0.38微米。

(5)將步驟(4)中的復(fù)合膜浸泡在0.1mg/mL的膠原Ⅰ型蛋白水溶液中，自然干燥。

(6)將步驟(5)中的復(fù)合膜用于細胞培養(yǎng)，過程如下：復(fù)合膜UV照射滅菌，之后浸泡在含有10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中24h進行平衡。使用體外培養(yǎng)第3代的人BMSCs作為檢測細胞，空白孔作為對照。把BMSCs(2×10⁴細胞/mL)接種到24孔板中，在37℃，5％CO₂的濕潤環(huán)境條件培養(yǎng)24h。

掃描電鏡觀察表明，細胞在復(fù)合膜上呈紡錘形分布，立體感較強，細胞形貌如圖5所示，說明短期內(nèi)細胞能夠在復(fù)合膜很好的黏附。因此得到復(fù)合膜能夠促進細胞的粘附。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。