本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化的培養(yǎng)基及其應(yīng)用和成脂分化方法。

背景技術(shù)：

骨骼肌肌源性干細(xì)胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)是成年動(dòng)物或人肌肉組織中特有的間充質(zhì)干細(xì)胞。作為中胚層起源的一種成體間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新能力和多項(xiàng)分化的潛能，可在體外分化為血細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等系的細(xì)胞。骨骼肌干細(xì)胞這種功能特性極大地吸引了來(lái)自基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究者，給基礎(chǔ)科學(xué)的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學(xué)的模式，骨骼肌干細(xì)胞所具有的修復(fù)、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)發(fā)展新療法的機(jī)會(huì)。

MDSCs具有潛在多向分化的干細(xì)胞特性，它不僅可以分化為肌肉組織細(xì)胞，還可以橫向分化為其他譜系的細(xì)胞。在地塞米松和胰島素、異丁基甲基黃嘌呤等誘導(dǎo)下分化為脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞作為美容修復(fù)軟組織缺損具有可塑性強(qiáng)、可適應(yīng)不同缺損形狀的優(yōu)勢(shì)。MDSCs的成脂誘導(dǎo)潛能，可使其成為美容修復(fù)軟組織缺損的干細(xì)胞來(lái)源。

目前尚未有專門針對(duì)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化的相關(guān)內(nèi)容，中國(guó)專利CN104830757A公開了一種間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，其以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中包含F(xiàn)BS、谷氨酰胺、抗生素、吲哚美辛、胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和鹽酸法舒地爾；中國(guó)專利CN105462917A公開了一種牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液，其同樣以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中包含F(xiàn)BS、PRP、吲哚美辛、胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)；雖然上述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基都是可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化，但是不同來(lái)源的干細(xì)胞之間由于微環(huán)境的差異，需要自己適宜的誘導(dǎo)分化環(huán)境，而現(xiàn)有的這些培養(yǎng)基在成脂分化率方面較低，并不是適合骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化的培養(yǎng)基及其應(yīng)用和成脂分化方法，使得所述培養(yǎng)基能夠顯著提升骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化的培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛、地塞米松、吡格列酮和FBS。

針對(duì)現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化培養(yǎng)基在誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化時(shí)分化率較低的問(wèn)題，本發(fā)明調(diào)整培養(yǎng)基組分，加入了吡格列酮替換現(xiàn)有培養(yǎng)基中的鹽酸法舒地爾、谷氨酰胺以及PRP等組分，達(dá)到了較高成脂分化率。

其中，作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5-15μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％的FBS。

同時(shí)，在本發(fā)明具體實(shí)施方式中培養(yǎng)基可選擇如下任意一項(xiàng)：

(1)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％的FBS；

(2)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％的FBS；

(3)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％的FBS；

作為優(yōu)選，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基。

由于本發(fā)明培養(yǎng)基能夠顯著提高骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化率，故本發(fā)明提出了所述培養(yǎng)基在誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化和/或制備誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化培養(yǎng)基中的應(yīng)用。

此外，本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化的方法，將骨骼肌肌源性干細(xì)胞接種至本發(fā)明所述培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化。

其中，所述誘導(dǎo)分化為在5％二氧化碳、37℃下誘導(dǎo)分化21天；所述骨骼肌肌源性干細(xì)胞的接種密度優(yōu)選為2×10⁴cells/mL；

所述骨骼肌肌源性干細(xì)胞可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法提取獲得，在本發(fā)明中是按照如下方法制備：

將肌肉組織剪成碎塊并清洗，然后加入2倍的體積的混合酶，包括2.4u/mL Dispase II、1％I型膠原酶，2.5mmol/L CaCl₂，混勻后置37℃恒溫?fù)u床中消化60min左右，直到試管中的肌肉碎塊消化為肌糜，肉眼看不到肌塊；消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清；加入2～3倍體積的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混勻后置37℃恒溫?fù)u床中消化15min，消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清；加入PBS重懸，1000r/min離心5min，棄上清；加入3倍肌糜體積的PBS反復(fù)吹打后經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集的濾液1000r/min離心5min，棄上清；含20％FBS的DMEM/F12重懸細(xì)胞，采用差速貼壁分離技術(shù)對(duì)MDSCs進(jìn)行分離，然后進(jìn)行正常培養(yǎng)、傳代。

所述差速貼壁分離技術(shù)具體如下：

將細(xì)胞懸液接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細(xì)胞記為PP1，其中未貼壁細(xì)胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，并記為PP2。24h后將PP2中未貼壁的細(xì)胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標(biāo)記為PP3。以后每24h進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6，期間根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行換液。PP6培養(yǎng)3天后換液，以后每2-3天換液，倒置顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞生長(zhǎng)以及形成集落后每日擴(kuò)增情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70-80％后傳代培養(yǎng)。

傳代方法可參照如下：

MDSCs原代培養(yǎng)8-10天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，按8×10⁴cells/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。

按照本發(fā)明所述成脂分化方法對(duì)骨骼肌肌源性干細(xì)胞進(jìn)行分化，最終份成脂分化率在55％以上，最高可達(dá)到84％左右，而作為對(duì)照的現(xiàn)有誘導(dǎo)分化方法的分化率均未超過(guò)40％，兩者相比具有顯著性差異。同時(shí)，檢測(cè)成脂細(xì)胞標(biāo)志性基因PPARγ-2、LPL表達(dá)水平，結(jié)果顯示，本發(fā)明方法分化的成脂細(xì)胞PPARγ-2、LPL表達(dá)水平遠(yuǎn)高于對(duì)照方法分化的成脂細(xì)胞。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明優(yōu)化誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基組分，以吡格列酮替換現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞中的常用組分，實(shí)現(xiàn)了骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化率的顯著提高效果。

附圖說(shuō)明

圖1所示為MDSCs P2代40倍形態(tài)圖；

圖2所示為MDSCs P2代100倍形態(tài)圖；

圖3所示為對(duì)照組1油紅O染色圖；

圖4所示為對(duì)照組2油紅O染色圖；

圖5所示為對(duì)照組3油紅O染色圖；

圖6所示為對(duì)照組4油紅O染色圖；

圖7所示為實(shí)驗(yàn)組1油紅O染色圖；

圖8所示為實(shí)驗(yàn)組2油紅O染色圖；

圖9所示為實(shí)驗(yàn)組3油紅O染色圖；

圖10所示為各組成脂分化率柱形圖；

圖11所示為各組PPARγ-2表達(dá)水平柱形圖；

圖12所示為各組LPL表達(dá)水平柱形圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化的培養(yǎng)基及其應(yīng)用和成脂分化方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和應(yīng)用已通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的培養(yǎng)基和方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

以下就本發(fā)明所提供的一種誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞成脂分化的培養(yǎng)基及其應(yīng)用和成脂分化方法做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：MDSCs原代分離和純化、傳代培養(yǎng)及鑒定

1、取材

取成人正常顳肌標(biāo)本(取自于開顱手術(shù)患者，患者知情并自愿，標(biāo)本采集通過(guò)正規(guī)醫(yī)院進(jìn)行，并且不影響患者身體健康)，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗后轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪成1mm³左右大小的碎塊，然后移入50mL離心管中，PBS緩沖液吹打沖洗3次，靜置1分鐘后棄上層液及漂浮組織。

2、酶解

向上述獲得的肌肉碎塊加入2倍的體積的混合酶，包括2.4u/mL Dispase II、1％I型膠原酶，2.5mmol/L CaCl₂，混勻后置37℃恒溫?fù)u床中消化60min左右，直到試管中的肌肉碎塊消化為肌糜，肉眼看不到肌塊。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入2～3倍體積的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混勻后置37℃恒溫?fù)u床中消化15min，消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，1000r/min離心5min，棄上清。加入約3倍肌糜體積的PBS反復(fù)吹打后經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集的濾液1000r/min離心5min，棄上清。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含20％FBS的DMEM/F12)重懸細(xì)胞。

3、分離與純化

采用差速貼壁分離技術(shù)對(duì)MDSCs進(jìn)行分離。將細(xì)胞懸液接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細(xì)胞記為PP1，其中未貼壁細(xì)胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，并記為PP2。24h后將PP2中未貼壁的細(xì)胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標(biāo)記為PP3。以后每24h進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6，期間根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行換液。PP6培養(yǎng)3天后換液，以后每2-3天換液，倒置顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞生長(zhǎng)以及形成集落后每日擴(kuò)增情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70-80％后傳代培養(yǎng)。

4、MDSCs的傳代培養(yǎng)

MDSCs原代培養(yǎng)8-10天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，按8×10⁴cells/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。

5、MDSCs的鑒定

細(xì)胞爬片制作：將無(wú)菌蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板中，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，按5×10⁴cells/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL，生長(zhǎng)培養(yǎng)基為含20％FBS的DMEM/F12，培養(yǎng)24-48小時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)于蓋玻片上。

Desmin、Sca-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色:將放有蓋玻片6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液吸出，PBS緩沖液漂洗細(xì)胞鋪片5分鐘，重復(fù)3次。用4％多聚甲醛固定15分鐘，PBS緩沖液漂洗后甩干，中性樹膠粘附于載玻片上，4℃冰箱過(guò)夜。滴加3％過(guò)氧化氫孵育15分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次。分別滴加一抗兔抗人結(jié)蛋白(Desmin)抗體(1:200稀釋)、兔抗人Sca-1抗體(1:100稀釋)，37℃濕盒內(nèi)孵育1小時(shí)，4℃過(guò)夜。次日取出后PBS緩沖液漂洗5分鐘，滴加二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育40分鐘，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次，滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5-10分鐘，在光鏡下觀察，用自來(lái)水進(jìn)行沖洗終止顯色。將甩干片子后，蘇木素復(fù)染1分鐘，分化返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在鏡下觀察，以胞膜和/或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性，將陽(yáng)性的細(xì)胞用于后續(xù)誘導(dǎo)分化試驗(yàn)(MDSCs P2代形態(tài)圖見圖1和圖2)。

實(shí)施例2：本發(fā)明所述成脂分化的方法

1、培養(yǎng)基

(1)在高糖DMEM培養(yǎng)基中包含0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％的FBS；

(2)在高糖DMEM培養(yǎng)基中包含0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％的FBS；

(3)在高糖DMEM培養(yǎng)基中包含0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％的FBS；

2、誘導(dǎo)分化方法

取第3代MDSCs，按2×10⁴cells/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到80％融合以上時(shí)，采用實(shí)施例3中各組成脂誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21d后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色及成脂基因PPARγ-2和LPL表達(dá)檢測(cè)。

實(shí)施例3：成脂分化對(duì)比試驗(yàn)

為了驗(yàn)證本發(fā)明成脂分化誘導(dǎo)的效果，同時(shí)設(shè)置4組對(duì)照組和3組實(shí)驗(yàn)組，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行油紅O染色及成脂基因PPARγ-2和LPL表達(dá)檢測(cè)。

對(duì)照組1為陰性對(duì)照組，為常規(guī)培養(yǎng)組，使用的培養(yǎng)液為：含體積分?jǐn)?shù)10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液。

對(duì)照組2為陽(yáng)性對(duì)照組，為常規(guī)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)配方，使用的成脂誘導(dǎo)液為0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

對(duì)照組3為陽(yáng)性對(duì)照組，參考CN105462917A中使用的成脂誘導(dǎo)液，配方為：0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、10mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、體積分?jǐn)?shù)5％PRP、體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

對(duì)照組4為陽(yáng)性對(duì)照組，參考CN104830757A使用的成脂誘導(dǎo)液，配方為：1μM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、100nM胰島素、200μM吲哚美辛、10nM地塞米松、0.1μM鹽酸法舒地爾、體積分?jǐn)?shù)1％谷氨酰胺、體積分?jǐn)?shù)1％抗生素、體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)組1中使用的成脂誘導(dǎo)液為：0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)組2中使用的成脂誘導(dǎo)液為：0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)組3中使用的成脂誘導(dǎo)液為：0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

1、油紅O染色

取第3代MDSCs，按2×10⁴cells/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到80％融合以上時(shí)，采用上述各組成脂誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色。染色的具體方法為：

棄培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定15-20min；吸棄多聚甲醛，PBS清洗3次；加入油紅O染色液，室溫染色15-20min。結(jié)束后吸棄殘液，用37℃預(yù)熱的去離子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，各組細(xì)胞染色效果如圖3-9。有染色結(jié)果可以大致看出，在本發(fā)明培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，成脂細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于對(duì)照組數(shù)量較多。

同時(shí)，對(duì)油紅O染色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出各組的分化率進(jìn)行比較。倒置顯微鏡100倍放大視野下，每孔隨機(jī)記數(shù)3個(gè)視野，計(jì)算分化細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例，每次平行計(jì)數(shù)3個(gè)孔，計(jì)算平均數(shù)。

誘導(dǎo)分化率＝染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100％。

各組誘導(dǎo)分化率結(jié)果如表1所示，對(duì)應(yīng)柱形圖如圖10所示。

表1誘導(dǎo)分化率結(jié)果

注：*，※表示P﹤0.01。

結(jié)果顯示培養(yǎng)21d后，對(duì)照組1為陰性對(duì)照組，不含誘導(dǎo)因子，不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，因此沒(méi)有著色，成脂分化率為零。實(shí)驗(yàn)組1、3與各對(duì)照組均有顯著性差異(P﹤0.01，*)；實(shí)驗(yàn)組2與其他各組均有顯著性差異(P﹤0.01，※)；實(shí)驗(yàn)組2中的成脂分化率均值為84.06±1.52％，是常規(guī)誘導(dǎo)分化組(對(duì)照組2)的2.65倍，是CN105462917A和CN104830757A中使用的兩種配方的2倍以上。說(shuō)明本發(fā)明所示的成脂分化誘導(dǎo)液對(duì)MDSCs成脂分化誘導(dǎo)的效果最好。

2、PPARγ-2和LPL的表達(dá)檢測(cè)

按照實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M方法對(duì)MDSCs進(jìn)行培養(yǎng)或成脂分化誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d和21d后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PPARγ-2和LPL的表達(dá)檢測(cè)。

按TRIzol試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA提??；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。按SYBR Green定量PCR試劑盒說(shuō)明書對(duì)PPARγ-2、LPL表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參基因。以2^-△△Ct法進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖11和12所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)14d、21d后，在同一時(shí)間點(diǎn)，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(陰性對(duì)照組)比較，成脂細(xì)胞標(biāo)志性基因PPARγ-2、LPL表達(dá)水平均有極顯著性差異(*，P﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)組1、3與各對(duì)照組比較，均有極顯著性差異(※，p﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)組2與其他各誘導(dǎo)組均有極顯著性差異(**，p﹤0.01)。

以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。