含有皮脂腺的皮膚組織及其形成方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了含有皮脂腺的皮膚組織及其形成方法和用途，其中，形成皮脂腺的方法包括：在凝膠中對(duì)真皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。利用該方法可以形成具有皮脂腺的皮膚組織。
【專利說明】含有皮脂腺的皮膚組織及其形成方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及形成皮脂腺的方法及其應(yīng)用，更具體地，涉及形成皮脂腺的方法，含有皮脂腺的皮膚組織以及形成皮脂腺的方法在皮膚再生中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]皮膚作為人體最大的組織，是與外界環(huán)境接觸的屏障，當(dāng)外界損傷或疾病等因素造成皮膚缺損時(shí)，常常造成皮膚的損傷和感染。我國(guó)人口眾多，每年燒傷與潰瘍患者達(dá)到1500萬(wàn)人，其中需要進(jìn)行皮膚移植的病例在350萬(wàn)人，皮膚需求量在4億平方厘米以上。因此，尋找一種理想的皮膚代用品一直是臨床上一個(gè)急需解決的難題。隨著細(xì)胞生物學(xué)、材料學(xué)、生物化學(xué)、生物工程學(xué)、移植學(xué)的飛速發(fā)展，人們對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)特性、人工材料的加工與合成等有了更深入的認(rèn)識(shí)，使在體外構(gòu)建組織工程皮膚成為可能。
[0003]皮脂腺是維護(hù)皮膚結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定最重要的附屬器官，因?yàn)槠ぶ倥c汗液以及脫落的上皮細(xì)胞等在皮膚表面形成一層皮脂汗液乳膠膜，其厚度7-10 μ m，其為皮膚表面三維脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以促進(jìn)皮膚屏障的完整性。如果缺少這層三維皮質(zhì)結(jié)構(gòu)，將會(huì)出現(xiàn)皮膚粗糙和毛發(fā)枯槁。由于手掌、足跖和手指、足趾的部分皮膚因?yàn)闆]有皮脂腺，所以經(jīng)常出現(xiàn)皮膚干裂現(xiàn)象。而現(xiàn)在的組織工程皮膚雖然有和正常皮膚類似的真皮和表皮層，但缺乏皮脂腺，無(wú)法為皮膚提供營(yíng)養(yǎng)滋潤(rùn)、抗菌抗氧化的保護(hù)以及水分保持，皮膚移植后，出現(xiàn)皮膚收縮變形嚴(yán)重、外表易干裂及易感染的等問題，同時(shí)組織工程皮膚的性能明顯低于天然正常皮膚。
[0004]然而，現(xiàn)有的組織工程皮膚仍有待改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種形成皮脂腺的方法。
[0006]需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作而完成的:
[0007]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于皮膚表皮的表皮干細(xì)胞和來(lái)源于皮膚真皮的真皮細(xì)胞，均具有大量擴(kuò)增的潛力，并且在體外分離培養(yǎng)后，表皮干細(xì)胞的特征為高表達(dá)整合素CD29，CD49f以及K15(角質(zhì)蛋白15)，而且在后續(xù)的傳代中兩種干細(xì)胞的特征標(biāo)記性分子表達(dá)穩(wěn)定。發(fā)明人將上述兩種細(xì)胞分別在不同的培養(yǎng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，然后將兩種細(xì)胞按比例移植到裸鼠皮膚，經(jīng)組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)有新形成的皮脂腺結(jié)構(gòu)。
[0008]因而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種形成皮脂腺的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:在凝膠中對(duì)真皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該方法可以形成具有皮脂腺的皮膚組織。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本申請(qǐng)形成具有皮脂腺的皮膚組織的方法，操作簡(jiǎn)單、方便快捷、容易控制、易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述共培養(yǎng)是在動(dòng)物的皮下進(jìn)行的。由此，促進(jìn)皮脂腺的皮膚組織的再生，并且再生的皮膚組織的結(jié)構(gòu)與正常皮膚類似。
[0010]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的成皮脂腺的方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0011]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述真皮細(xì)胞包括真皮干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的至少之一。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述真皮細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，并且在所述凝膠中含有胰島素、地塞米松、格列酮和XAV939(3，5，7，8-四氫-2-[4-(三氟甲基)苯基]_4H_噻喃并[4，3-d]嘧啶-4-酮)。由此，化學(xué)試劑誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞分化為自由皮脂腺，進(jìn)而形成與正常皮膚類似的皮脂腺結(jié)構(gòu)。
[0013]所述胰島素的終濃度為50-150 μ g/mL，所述地塞米松的終濃度為10_4_10_6M，所述類格列酮的終濃度為150-250 μ Μ，所述XAV939的終濃度為5_15 μ Μ。由此，化學(xué)試劑誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化為自由皮脂腺的效果好。
[0014]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述胰島素的終濃度為100 μ g/mL，所述地塞米松的終濃度為10_5M，所述類格列酮的終濃度為200 μ Μ，所述XAV939的終濃度為10 μ Μ。由此，化學(xué)試劑誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化為自由皮脂腺的效果更佳。
[0015]其中，需要說明的是，本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“終濃度”是指將各種化學(xué)試劑加入含混合細(xì)胞的凝膠后，該化學(xué)試劑在凝膠中的濃度。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述真皮細(xì)胞和所述表皮干細(xì)胞混合的數(shù)量比為10:1?
1:10ο
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于每3mm2皮膚，混合細(xì)胞的數(shù)量不少于14個(gè)。由此，混合細(xì)胞的數(shù)量滿足皮脂腺皮膚組織再生的需求。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述凝膠為選自Matrigel、膠原或者水凝膠的至少一種。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述真皮細(xì)胞和所述表皮干細(xì)胞均為來(lái)源于自體、同種異體或者異種的細(xì)胞。其中需要說明的是，所述來(lái)源于異種的細(xì)胞用于免疫缺陷動(dòng)物的皮脂腺再生。由此，再生的皮脂腺皮膚組織排異作用小。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述真皮細(xì)胞和所述表皮干細(xì)胞分別獨(dú)立地預(yù)先在液體培養(yǎng)基中被貼壁培養(yǎng)O?30代，所述液體培養(yǎng)基中含有細(xì)胞活性因子和細(xì)胞外基質(zhì)分子，所述細(xì)胞活性因子為選自bFGF、EGF的至少一種，所述細(xì)胞外基質(zhì)分子為選自透明質(zhì)酸、纖維粘連蛋白的至少一種。由此，真皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞的活性高，細(xì)胞變異小。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法進(jìn)一步包括:利用原位質(zhì)譜鑒定所述含再生皮脂腺的皮膚組織表面的油脂分泌。由此，能夠更加精確的鑒定所述含再生皮脂腺的皮膚組織表面的油脂分泌情況。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種含有皮脂腺的皮膚組織。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述皮脂腺是通過前述的本發(fā)明實(shí)施例的所述的方法形成的。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該皮膚組織具有與正常皮膚組織類似的皮脂腺的結(jié)構(gòu)。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提夠了前述的方法在皮膚再生中的用途。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述方法用于再生皮脂腺，或含有皮脂腺的皮膚組織。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在皮膚再生中應(yīng)用該方法，可以獲得具有與正常皮膚類似的皮脂腺。
[0024]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0026]圖1顯不了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的表皮干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD49f的表達(dá)結(jié)果的圖片；
[0027]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的真皮干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志Nestin的表達(dá)結(jié)果的圖片；
[0028]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的正常皮膚組織切片的共聚焦顯微鏡觀察的圖片；
[0029]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的由表皮干細(xì)胞和真皮干細(xì)胞共同移植后形成的皮膚組織切片的共聚焦顯微鏡觀察的圖片；
[0030]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的由表皮干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混合后用化學(xué)試劑誘導(dǎo)共同移植后形成的皮膚組織切片的共聚焦顯微鏡觀察的圖片；
[0031]圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的MALDI質(zhì)譜檢測(cè)移植后形成的皮膚組織的皮脂腺分泌結(jié)果的圖片。

【具體實(shí)施方式】
[0032]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0033]本申請(qǐng)的實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)廣品。
[0034]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，如無(wú)特殊說明，下述實(shí)施例中離體皮膚干細(xì)胞從C57小鼠的皮膚或人的頭皮組織分離并培養(yǎng)；真皮干細(xì)胞培養(yǎng)基組成為DMEM/F12 (3:1)(購(gòu)買于 Invitrogen 公司)，含 2 % B27 (購(gòu)買于 Invitrogen 公司)，40ng/ μ L bFGF (Peprotech)和20ng/ μ L EGF(Peprotech);成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM含10%胎牛血清；Accutase購(gòu)于sigma ;3M膜為Tegaderm? Film ;懸浮細(xì)胞培養(yǎng)皿，購(gòu)自于廣州杰特生物過濾制品有限公司，貨號(hào)為MCD-000-090。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)皿，購(gòu)自于Corning公司。Matrigel購(gòu)自于BD公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0035]實(shí)施例1
[0036]表皮干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)及鑒定過程具體如下:
[0037](I)取胎鼠全層皮膚，加入質(zhì)量濃度0.25% dispase II酶4°C過夜。
[0038](2)剝離胎鼠的皮膚表皮，將表皮剪碎后加入質(zhì)量濃度0.25%膠原酶，37°C消化30min后終止反應(yīng)，獲得消化后的表皮干細(xì)胞的原代細(xì)胞。
[0039](3)將獲得的原代細(xì)胞過80目篩網(wǎng)，然后300Xg離心lOmin，棄上清后以CnT-07 (由CELLnTEC公司生產(chǎn))培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。
[0040](4)將CnT-07懸浮的原代細(xì)胞接種于鋪有小鼠I型膠原的1CM細(xì)胞培養(yǎng)板上，孵育60min后，以0.01mol/L HBSS洗滌細(xì)胞2次，再加入CnT-07培養(yǎng)。
[0041](5)待原代細(xì)胞長(zhǎng)至60%?80%融合時(shí)，用Accutase酶消化，然后按1: 2比例傳代。
[0042](6)表皮干細(xì)胞的鑒定:即細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定，方法如下:取第1、3、5代表皮干細(xì)胞做細(xì)胞爬片，對(duì)其進(jìn)行整合素CD29和CD49f以及K15的免疫熒光染色，觀察細(xì)胞的著色情況。觀察發(fā)現(xiàn)，表皮干細(xì)胞的整合素⑶29，⑶49f和K15均高表達(dá)，具體結(jié)果如圖1所示。
[0043]實(shí)施例2
[0044]真皮干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)及鑒定過程具體如下:
[0045](I)取胎鼠全層皮膚，將皮膚剪碎后，加入質(zhì)量濃度0.25% dispase酶4°C過夜。
[0046](2)剝離胎鼠的表皮，分離真皮，并將真皮剪碎，加入質(zhì)量濃度0.25%胰蛋白酶，37°C消化20?40min后終止反應(yīng)，獲得消化后的真皮干細(xì)胞的原代細(xì)胞。
[0047](3)將真皮干細(xì)胞的原代細(xì)胞過200目篩網(wǎng)，然后，300Xg離心lOmin，棄上清后，以真皮干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮原代細(xì)胞。
[0048](4)將真皮干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮原代細(xì)胞接種于不貼壁培養(yǎng)皿中。
[0049](5)待不貼壁培養(yǎng)皿中出現(xiàn)較多細(xì)胞球后，將真皮干細(xì)胞按1: 2的比例傳代。
[0050](6)真皮干細(xì)胞的鑒定:即細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定，具體方法如下:取第1、3、5代真皮干細(xì)胞做細(xì)胞甩片，對(duì)真皮干細(xì)胞的Nestin和Fibixmectin進(jìn)行免疫熒光染色，觀察細(xì)胞的著色情況。免疫焚光分析發(fā)現(xiàn)，真皮干細(xì)胞的Nestin和Fibronectin均高表達(dá)，其中，Nestin陽(yáng)性的結(jié)果如圖2所示。
[0051]實(shí)施例3
[0052]利用真皮干細(xì)胞誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞形成皮脂腺結(jié)構(gòu)，具體過程如下:
[0053](I)培養(yǎng)實(shí)施例1中獲得的表皮干細(xì)胞，將第3代表皮干細(xì)胞用Accutase酶消化后，制備總細(xì)胞數(shù)100萬(wàn)的表皮干細(xì)胞懸液于PBS中。
[0054](2)培養(yǎng)實(shí)施例2中獲得的真皮干細(xì)胞，制備第3代真皮干細(xì)胞總細(xì)胞數(shù)100萬(wàn)細(xì)胞懸液于PBS中。
[0055](3)將(I)和⑵中的兩種細(xì)胞懸液混合，300g離心5min。
[0056](4)取離心后的細(xì)胞，棄上清，在細(xì)胞沉淀中加入10微升Matrigel，混勻，待用。
[0057](5)將BALB/c裸鼠用I %的戊巴比妥鈉麻醉，用打孔器在其背部皮膚上制造面積約7mm2的傷口。
[0058](6)將步驟(4)中制備獲得的混有皮膚干細(xì)胞的Matrigel移植到裸鼠皮膚傷口表面。
[0059](7)用3M膜覆蓋裸鼠傷口表面，然后用繃帶將裸鼠傷口包扎。
[0060](8)正常飼養(yǎng)裸鼠，3周后拆開繃帶去除3M膜，切取細(xì)胞移植的皮膚組織，并固定染色后，觀察皮脂腺結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有大量皮脂腺結(jié)構(gòu)形成。
[0061]實(shí)施例4
[0062]利用化學(xué)試劑誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞形成皮脂腺結(jié)構(gòu)，具體過程如下:
[0063](I)培養(yǎng)實(shí)施例1中獲得的表皮干細(xì)胞，將第3代表皮干細(xì)胞用Accutase酶消化后，制備200萬(wàn)的細(xì)胞懸液于PBS中。
[0064](2)將成纖維細(xì)胞用Accutase酶消化后，制備200萬(wàn)的細(xì)胞懸液于PBS中。
[0065](3)將(I)和(2)中的兩種細(xì)胞懸液混合，并平均分成2份，一份作為實(shí)驗(yàn)組，另一份作為對(duì)照組，300g，離心5min。
[0066](4)將上述2份離心后的細(xì)胞棄上清，分別在細(xì)胞沉淀中加入10微升Matrigel，混勻。
[0067](5)在實(shí)驗(yàn)組的Matrixgel中加入適量的胰島素，地塞米松，類格列酮以及XAV939，使其最終濃度為:胰島素100 μ g/mL,地塞米松10-5M，類格列酮200 μ Μ，XAV93910 μ Μ，將上述化學(xué)試劑充分吹吸混勻。對(duì)照組不添加上述化學(xué)試劑。
[0068](6)將BALB/c裸鼠用I %的戊巴比妥鈉麻醉，用打孔器在其背部皮膚上制造面積約7mm2的傷口。
[0069](7)將步驟(5)中制備獲得的2組混有皮膚干細(xì)胞的Matrigel分別移植到裸鼠皮膚傷口表面。
[0070](8)用3M膜覆蓋裸鼠傷口表面，然后用繃帶將裸鼠傷口包扎。
[0071](9)正常飼養(yǎng)裸鼠，3周后拆開繃帶去除3M膜，切取細(xì)胞移植的皮膚組織，并固定染色后，觀察皮脂腺結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組有大量皮脂腺結(jié)構(gòu)形成而對(duì)照組只有很少量的皮脂腺結(jié)構(gòu)形成。
[0072]實(shí)施例5
[0073]對(duì)實(shí)施例3和實(shí)施例4中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的干細(xì)胞移植的皮膚組織進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)鑒定，具體如下:
[0074]1、制備表皮干細(xì)胞再生皮脂腺結(jié)構(gòu)組織切片:
[0075](I)分別切取實(shí)施例3和實(shí)施例4中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的干細(xì)胞移植的皮膚組織區(qū)域，4 %多聚甲醛固定過夜，PBS浸泡3小時(shí)，30 %蔗糖脫水8小時(shí)。
[0076](2) OCT包埋組織，冰凍切片，取10 μ m厚度的組織切片。
[0077](3)將組織切片自然晾干。
[0078](4)將組織切片用PBS洗三遍，每次5分鐘。
[0079](5)用0.2-0.5% triton X-100 (PBS配制)對(duì)組織切片做透膜處理10分鐘。
[0080](6)將透膜處理后的組織切片用PBS洗三遍，每次5分鐘。
[0081](7)將組織切片用2% BSA封閉30分鐘，然后用PBS洗兩遍。
[0082](8)將封閉后的組織切片加入抗生物素Cy3標(biāo)記的I抗，室溫孵育3小時(shí)。
[0083](9)將連接I抗的組織切片用PBS洗三遍，每次5分鐘。
[0084](10)加入 0.5 μ g/ml DAPI (PBS 配制)染色 10 分鐘。
[0085](11)將染色后組織切片用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。
[0086](12)將去除多余的DAPI的組織切片加入20 μ I封片劑封片。
[0087](13)封片好的組織染色樣品置于4度冰箱中，可存放2周以上。
[0088]2、組織切片的組織形態(tài)學(xué)鑒定:
[0089]采用共聚焦顯微鏡觀察組織切片，觀察發(fā)現(xiàn)，正常皮膚的皮脂腺，免疫熒光染色顯示其有大量生物素(B1tin)合成，細(xì)胞呈現(xiàn)為空泡狀結(jié)構(gòu)；實(shí)施例3的再生皮膚組織中有皮脂腺結(jié)構(gòu)的形成，其結(jié)構(gòu)形態(tài)與正常皮膚中的皮脂腺類似；實(shí)施例4中有化學(xué)試劑誘導(dǎo)的組織(即實(shí)驗(yàn)組)有大量生物素合成的皮脂腺結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組幾乎沒有類似的結(jié)構(gòu)形成，具體結(jié)果如圖3-5所示。
[0090]實(shí)施例6
[0091]利用原位質(zhì)譜鑒定實(shí)施例4中移植后的皮膚組織的皮脂腺的油脂分泌能力的方法具體如下:
[0092](I)將實(shí)施例4中干細(xì)胞皮膚移植的BALB/c裸鼠用I %的戊巴比妥鈉麻醉，用100%的乙醇擦洗其背部皮膚，使其皮膚表面的油脂類物質(zhì)全部洗掉。
[0093](2)分別切取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞移植后的皮膚組織，用皮膚活檢器切取2mm直徑的皮膚組織，其中包括正常皮膚和干細(xì)胞移植皮膚，將該組織片置于37°C的培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，使其組織內(nèi)的皮脂向皮膚表面分泌。
[0094](3)利用原位質(zhì)譜鑒定上述皮膚組織表面油脂的分泌前，需對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理，其過程為用含0.1 % TFA的50 % ACN水溶液配制成15g/L的CHCA基質(zhì)溶液，用蠕動(dòng)泵以5 μ Ι/s推動(dòng)100 μ I基質(zhì)溶液均勻噴灑在組織表面上，待組織表面溶液將干時(shí)，再次噴灑基質(zhì)溶液，循環(huán)2次。
[0095](4)將噴好基質(zhì)的組織切片放在室溫下，待溶劑揮發(fā)析出結(jié)晶后放入干燥器中干燥2ho
[0096](5)干燥后的組織切片用導(dǎo)電膠帶貼在MALDI不銹鋼靶板上，送入質(zhì)譜儀分析。
[0097](6)質(zhì)譜條件隨機(jī)取每片組織切片3個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)累加1000次掃描數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖，3個(gè)點(diǎn)累加后得到總質(zhì)譜圖。用正離子反射式模式檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍m/z 100-1000 ；正離子線性模式檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍m/z 100-2000。
[0098]結(jié)果如圖6所示，其中紅線代表正常皮脂腺分泌的油脂，綠線代表再生皮脂腺分泌的油脂，質(zhì)譜結(jié)果表明，再生皮脂腺有和正常皮脂腺類似的油脂分泌能力。
[0099]在本說明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0100]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1.一種形成皮脂腺的方法，其特征在于，包括: 在凝膠中對(duì)真皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)是在動(dòng)物的皮下進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述真皮細(xì)胞包括真皮干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的至少之一， 任選地，所述真皮細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，并且在所述凝膠中含有胰島素、地塞米松、格列酮和 XAV939， 任選地，所述胰島素的終濃度為50-150 μ g/mL，所述地塞米松的終濃度為10_4_10_6M，所述類格列酮的終濃度為150-250 μ M，所述XAV939的終濃度為5_15 μΜ， 任選地，所述胰島素的終濃度為100 μ g/mL，所述地塞米松的終濃度為10_5M，所述類格列酮的終濃度為200 μ Μ，所述XAV939的終濃度為10 μ Μ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述真皮細(xì)胞和所述表皮干細(xì)胞混合的數(shù)量比為10:1?1:10， 任選地，對(duì)于每3_2皮膚，混合細(xì)胞的數(shù)量不少于10 4個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝膠為選自Matrigel、膠原或者水凝膠的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述真皮細(xì)胞和所述表皮干細(xì)胞均為來(lái)源于自體、同種異體或者異種的細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述真皮細(xì)胞和所述表皮干細(xì)胞分別獨(dú)立地預(yù)先在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)O?30代，其中，真皮干細(xì)胞為懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基組成為DMEM/F12 (3:1),2% B27，40ng/ μ L bFGF 和 20ng/ μ L EGF ;表皮干細(xì)胞為貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基為CnT-07培養(yǎng)基；其中，所述真皮干細(xì)胞液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步含有細(xì)胞活性因子和細(xì)胞外基質(zhì)分子，其中所述細(xì)胞活性因子為選自bFGF、EGF的至少一種，所述細(xì)胞外基質(zhì)分子為選自透明質(zhì)酸、纖維粘連蛋白的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括:利用原位質(zhì)譜鑒定所述含再生皮脂腺的皮膚組織表面的油脂分泌。
9.一種含有皮脂腺的皮膚組織，其特征在于，所述皮脂腺是通過權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法形成的。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法在皮膚再生中的用途。
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK104491931SQ201410723513
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】吳耀炯, 王瀟瀟, 王旭升 申請(qǐng)人:清華大學(xué)深圳研究生院