表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法
【專利摘要】一種表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，包括如下步驟：鼠尾膠原的制備、人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)、復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備與觀察、復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備與觀察。本發(fā)明證實(shí)了在體外利用復(fù)方殼多糖組織工程皮膚和凝膠三維培養(yǎng)，一定濃度的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)、垂直振蕩培養(yǎng)，能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，且所形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及功能上與在體汗腺分泌部細(xì)胞相似，具有與正常汗腺分泌部細(xì)胞相似的生理結(jié)構(gòu)及生理作用基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，特別涉及一種表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮 細(xì)胞分化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 嚴(yán)重的皮膚缺損，如大面積的深度燒傷等，傷及皮膚全層及其附屬器，僅靠創(chuàng)面 自身難以實(shí)現(xiàn)皮膚再生，需要足夠的皮膚替代物進(jìn)行修復(fù)。目前構(gòu)建的表真皮雙層組織 工程皮膚雖已應(yīng)用于臨床，基本解決了創(chuàng)面覆蓋的問(wèn)題，但未達(dá)到真正的皮膚組織結(jié)構(gòu)和 功能的完全重建，其最大的問(wèn)題是缺乏皮膚附件，如皮脂腺、汗腺等附屬器。表皮干細(xì)胞 (Epidermalstemcell,ESC)是皮膚組織特異性干細(xì)胞，位于表皮基底層，在維持表皮更 新，保持細(xì)胞恒定等方面起著重要作用。表皮干細(xì)胞具有多向分化潛能，體內(nèi)證實(shí)能夠向皮 膚附屬器及表皮分化。若能在體外誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞向汗腺分化，將為研究帶汗腺的組織工 程皮膚提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種表皮干細(xì)胞向汗腺樣 上皮細(xì)胞分化的方法。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] -種表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，包括如下步驟：
[0006] 1)鼠尾膠原的制備
[0007] 將凍存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解凍后，去皮，采用D-Hanks液沖洗，抽出尾 腱，剪碎成泥，溶于無(wú)菌的冰醋酸中保存一段時(shí)間，其間反復(fù)振蕩，然后進(jìn)行離心處理，提取 上清溶液，得到乳白色半透明粘稠液體，即為所得物鼠尾膠原，將其貯存?zhèn)溆茫?br>
[0008] 2)人成纖維細(xì)胞（FB)的培養(yǎng)
[0009] 將健康成人包皮環(huán)切術(shù)的包皮標(biāo)本用酒精浸浴并擦拭，用PBS液反復(fù)沖洗；去除 皮下組織和真皮網(wǎng)狀層，將表真皮部分剪成長(zhǎng)方形條狀后進(jìn)行消化；然后將表皮從真皮上 揭下，刮真皮表面，將所得真皮剪成糊狀，加膠原酶，再加蓋，移至孵箱中并不時(shí)搖動(dòng)；接著 取出液體，篩網(wǎng)過(guò)濾，加PBS液，離心棄上清，加DMEM混勻成細(xì)胞懸液，移入孵箱中培養(yǎng)，待 原代培養(yǎng)的FB接近或達(dá)到融合后，用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)收 縮裂隙時(shí)，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)接終止消化，最后分析細(xì)胞體積及增殖情況，并按照 1:3傳代，建立FB細(xì)胞庫(kù)，提供來(lái)源統(tǒng)一的FB。
[0010] 3)表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0011] 先將人表皮干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)，包括下列步驟：
[0012]a)將取下的人包皮標(biāo)本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡鹽液沖洗，直至標(biāo)本 發(fā)白發(fā)漲；
[0013]b)將上述步驟a)中的人包皮標(biāo)本在培養(yǎng)皿中剪去皮下組織后剪成長(zhǎng)方形的條 狀，然后進(jìn)行分離消化；
[0014] C)將步驟b)中的人包皮標(biāo)本用PBS平衡鹽液漂洗，然后對(duì)人包皮標(biāo)本的表皮和真 皮進(jìn)行分離，再將分離后所得的表皮進(jìn)行消化，消化后進(jìn)行離心、篩網(wǎng)過(guò)濾，棄去上清液，再 放入K-SFM培養(yǎng)液中，制成細(xì)胞混懸液，計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞按5XIO4/孔接種在 預(yù)先鋪滿IV型膠原的培養(yǎng)板中，30min后吸盡未貼壁的細(xì)胞，計(jì)算吸出液中的細(xì)胞數(shù)和貼 壁率，并每天更換K-SFM培養(yǎng)液；
[0015] 再進(jìn)行人表皮干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，包括下列步驟：
[0016] d)待原代表皮干細(xì)胞融合約70 %后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS進(jìn)行洗滌；
[0017] e)每孔加入0. 25%膜蛋白酶后放入冰箱，保持在4C;
[0018] f)待4-6h后將培養(yǎng)板取出，輕輕拍打細(xì)胞脫落，加入含10%FBS的DMEM中和； [0019]g)將液體吸入離心管中，用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)板后移入離心管中進(jìn)行離心；
[0020]h)棄去上清液，加入K-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，計(jì)算細(xì)胞數(shù)后備用；
[0021] 4)復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備
[0022] 按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DMEM; 再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4 ;在凝膠中加入FB細(xì)胞，細(xì)胞量達(dá)到IO5Ail;吸入多孔 培養(yǎng)板中，放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后，每孔輕輕加入濃度為8X105/ml的1代表皮干細(xì)胞， 最后再加入KGM培養(yǎng)基，置孵箱培養(yǎng)，每天進(jìn)行換液；待培養(yǎng)3天后，進(jìn)行行氣液界面培養(yǎng)， 將組織工程皮膚分為兩組：一組僅用KGM培養(yǎng)，一組在KGM中添加20ng/mlEGF;兩組均每 日垂直振蕩；待培養(yǎng)16天后，用4%多聚甲醛固定后行HE染色，觀察皮膚生長(zhǎng)情況；
[0023] 5)復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備
[0024] 按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DiffiM; 再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4 ;在凝膠中加入1代表皮干細(xì)胞，細(xì)胞量為8XIO5Ail; 吸入多孔培養(yǎng)板中，放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后，再加入KGM，置孵箱中培養(yǎng)，每天進(jìn)行換液； 每日垂直振蕩；待培養(yǎng)3天后，在KGM中添加濃度為20ng/ml的EGF;待培養(yǎng)16天后行組織 學(xué)及形態(tài)學(xué)檢查；
[0025] 6)組織工程凝膠的觀察
[0026] 步驟包括組織學(xué)觀察、免疫熒光觀察、透射電鏡下觀察以及激光共聚焦顯微鏡觀 察鈣通道。
[0027] 進(jìn)一步地，所述步驟1)中尾腱保存條件為4°C，保存48h，所得物鼠尾膠原的貯存 條件為4°C。
[0028] 進(jìn)一步地，所述各步驟中酒精的濃度均為75%，所述孵箱的條件為37°C、5% C02/95 %空氣、90 %以上濕度，所述篩網(wǎng)規(guī)格為200目。
[0029] 進(jìn)一步地，所述步驟1)中離心條件為3000rpm，離心Ih;所述步驟2)中離心條件 為1500rpm，離心5min;所述步驟3)中離心條件為IOOOrpm,離心5min。
[0030] 進(jìn)一步地，所述步驟2)和3)b)中人包皮標(biāo)本剪成長(zhǎng)方形條狀的尺寸為 0. 3cmX2cm〇
[0031] 進(jìn)一步地，所述步驟3)c)中分離采用0.25%分離酶進(jìn)行，其中所述分離酶與樣本 的比例為5:1，消化采用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行，其中表皮與所述胰蛋白酶體積比為3:1。
[0032] 進(jìn)一步地，所述步驟2)中采用且鑷子將表皮從真皮上揭下，彎頭鑷子刮真皮表 面；所述步驟3)c)中表皮和真皮進(jìn)行分離采用眼科鑷輕輕揭下表皮即完成表皮和真皮的 分離。
[0033] 進(jìn)一步地，所述步驟2)中所述FB為第4-10代；所述步驟3)、4)和5)中培養(yǎng)板為 24孔培養(yǎng)板。
[0034] 進(jìn)一步地，所述步驟2)中采用CASY?.系統(tǒng)分析細(xì)胞體積及增殖情況，所述步驟 3)c)中利用CASY?系統(tǒng)來(lái)分析計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù)。
[0035] 進(jìn)一步地，所述步驟4)和步驟5)中所述的混勻在冰浴條件下進(jìn)行和所述的垂直 振蕩條件為振蕩頻率為75次/分，振幅為2cm。
[0036] 由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果至少包括：
[0037] 本發(fā)明證實(shí)了在體外利用復(fù)方殼多糖組織工程皮膚和凝膠三維培養(yǎng)，一定濃度的 EGF(如，20ng/ml)在誘導(dǎo)條件下，垂直振蕩培養(yǎng)，能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，且所形成的管腔樣結(jié) 構(gòu)，在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及功能上與在體汗腺分泌部細(xì)胞相似，具有與正常汗腺分泌部細(xì)胞相 似的生理結(jié)構(gòu)及生理作用基礎(chǔ)。
[0038] 三維細(xì)胞培養(yǎng)（Threediamensionscellculture,TDCC)是將細(xì)胞培植在一定的 細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix,ECM)中，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白充當(dāng)生長(zhǎng)支架，使得細(xì)胞能 夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu)，所創(chuàng)建的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境能最大程度地模擬體內(nèi)環(huán) 境。這種培養(yǎng)方式一方面能夠?yàn)轶w外培養(yǎng)細(xì)胞提供近似體內(nèi)的微環(huán)境，從而有利于細(xì)胞增 殖、遷移和分化；另一方面可在體外構(gòu)建各類組織、器官相應(yīng)的細(xì)胞三維生長(zhǎng)類似物或等同 物，是基礎(chǔ)研究和體外構(gòu)建組織工程廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)方法。TDCC作為體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)及單 層細(xì)胞系統(tǒng)的研究與組織器官及整體研究的橋梁，顯示了它既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物 質(zhì)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢(shì)。
[0039] 用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的支架材料需要滿足以下要求：①具有良好的組織相容性和生 物相容性；②無(wú)免疫排斥反應(yīng)；③具有可塑性，能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供三維立體支架；④無(wú)毒、 無(wú)污染性；⑤生物可降解性。 申請(qǐng)人:研制的復(fù)方殼多糖膠原凝膠是一種良好的三維培養(yǎng)細(xì) 胞的模型，在此基礎(chǔ)上研制復(fù)方殼多糖真皮基質(zhì)和人工雙層皮膚接近天然真皮和皮膚的生 物學(xué)特性（專利號(hào)：ZL01107099. 4,ZL200610095122. 9)，組織相容性及生物安全性高，無(wú)毒 副作用及免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)可根據(jù)不同的需要進(jìn)行隨意的塑形。
[0040] 細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)有表面培養(yǎng)、"三明治"培養(yǎng)、混合培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)等多種方 法。采用不同的三維細(xì)胞培養(yǎng)方法所獲結(jié)果是存在差異性的，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，為了更好的 接近體內(nèi)汗腺的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，發(fā)明人采用了表面培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的方法在體外構(gòu)建組織 工程皮膚。表面培養(yǎng)法就是將細(xì)胞接種在一定厚度的基質(zhì)材料表面上，使其向下生長(zhǎng)，有研 究表明，運(yùn)用表面培養(yǎng)法將分離純化后的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于膠原表面，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì) 胞能向膠原層內(nèi)遷移，形成三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和封閉的管腔樣腔隙?；旌吓囵B(yǎng)法就是將細(xì)胞和 基質(zhì)材料充分混合后培養(yǎng)，另有研究表明，使用混合法，將膠原溶液與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞混 合后灌注在培養(yǎng)皿中，待膠原凝固后，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞可以形成復(fù)雜的血 管樣結(jié)構(gòu)。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖IA為本發(fā)明人成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)中FB(XlOO)的原代培養(yǎng)生長(zhǎng)顯示 圖；
[0042] 圖IB為本發(fā)明人成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)中FB(XlOO)的傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)顯示 圖；
[0043] 圖2為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備中加入8XIOVml的ESC，僅用KGM 培養(yǎng)行氣液界面培養(yǎng)（X200)的表皮結(jié)構(gòu)分化顯示圖；
[0044] 圖3為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備中加入8X105/ml的ESC，在KGM中 添加濃度為20ng/ml的EGF(XlOO)的表皮結(jié)構(gòu)分化顯示圖；
[0045] 圖4為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備中加入8X105/ml的ESC，在KGM中 添加濃度為20ng/ml的EGF(X200)的表皮結(jié)構(gòu)分化顯示圖；
[0046] 圖5A為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的60μm冰凍 切片HE染色（XlOO)顯示圖；
[0047] 圖5B為本發(fā)明圖5A的放大顯示圖；
[0048] 圖6為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中免疫熒光觀察實(shí)驗(yàn)中采用CLSM掃描，利 用抗CK19抗體觀察細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯示圖；
[0049] 圖7為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中免疫熒光觀察實(shí)驗(yàn)中采用CLSM掃描， 抗-CK18免疫熒光染色表達(dá)陽(yáng)性的顯示圖；
[0050] 圖8為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中免疫熒光觀察實(shí)驗(yàn)中采用CLSM掃描， 抗-CEA免疫熒光染色表達(dá)陽(yáng)性的顯示圖；
[0051] 圖9為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的細(xì)胞內(nèi) 的類似分泌樣顆粒的高電子致密度物質(zhì)（箭頭所示）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體的顯示圖；
[0052] 圖10為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的細(xì)胞內(nèi) 的線粒體的顯示圖；
[0053] 圖11為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的細(xì)胞內(nèi) 指狀突起的顯不圖；
[0054] 圖12為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的細(xì)胞之 間可見(jiàn)連接（箭頭1)和類似分泌小管的腔隙（箭頭2)的顯示圖；
[0055] 圖13為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道實(shí)驗(yàn)中 在細(xì)胞外液高鈣時(shí)，氯化乙酰膽堿對(duì)管腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的作用曲線圖；
[0056] 圖14為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道實(shí)驗(yàn)中 在細(xì)胞外液高鈣時(shí)，阿托品對(duì)管腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的作用曲線圖；
[0057] 圖15為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道實(shí)驗(yàn)中 在細(xì)胞外液高鈣時(shí)，超純水對(duì)管腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的作用曲線圖；
[0058] 圖16為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道實(shí)驗(yàn)中 在細(xì)胞外液無(wú)鈣時(shí)，氯化乙酰膽堿對(duì)管腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的作用曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用 于限定本發(fā)明。
[0060] 下面通過(guò)具體的實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋。
[0061] -.材料和儀器
[0062] 1.主要儀器
[0063] 二氧化碳孵箱(TC2323) 美國(guó)SHELLAB公司 電熱鼓風(fēng)干燥箱(CS-101) 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠 電熱恒溫培養(yǎng)箱(ΗΗ·Β] 1365-S) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限 公司 倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(CKX41-32PH)日本Olympus公司 萬(wàn)分之一電子天平(BSIIOm 德國(guó)StartOrios公司 數(shù)顯普通離心機(jī)(KDC-40) 安徽中國(guó)科大中佳公司 24孔培養(yǎng)板 美國(guó)FALCON公司 微量移液器 法國(guó)Gilson Rios16 水純化糸統(tǒng) NMi丨丨iporeCorporation 數(shù)控超聲波清洗器(KQ-600DB) 浙江昆山市超聲儀器有限公司 壓力蒸汽滅菌器(ZDX-35SBI) 上海申安醫(yī)療器械廠 超低溫冰箱(MDF-382E) 日本Sanyo公司 CASY?細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 德國(guó)CASY公司 2.主要試劑
[0064] 胰蛋白酶 美國(guó)Hyclone公司 分離酶、膠原酶 美國(guó)Sigma公司 IV型膠原 美國(guó)Sigma公司 DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Hyclone公司 K-SFM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司 青霉素針、鏈霉素針 華北制藥股份有限公司 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 天津(特級(jí)） 多聚甲醛 美國(guó)Sigma公司 鼠抗人CK10、CK19抗體 北京中杉公司 鼠抗人整合素β?抗體 博士德公司 通用型SPkit 北京中杉公司 DAB顯色劑 北京中杉公司 CASYton 德國(guó)CASY公司 Trizol裂解液 美國(guó)Sigma公司 大鼠鼠尾 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬 醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心
[0065] 二·實(shí)施例
[0066] 實(shí)施例1:鼠尾膠原的制備
[0067] 具體操作步驟如下：
[0068] 1)解凍：凍存300g左右大白鼠鼠尾3根，于75%酒精溶液中解凍1小時(shí)；
[0069] 2)取腱：去皮，D-Hanks液沖洗3遍，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于無(wú)菌的1 %冰醋酸 250ml中，4°C保存48小時(shí)以上，其間反復(fù)振蕩；
[0070] 3)離心：3000rpm離心1小時(shí)，取上清；
[0071] 4)貯存：所得物位乳白色半透明粘稠液體，4°C貯存?zhèn)溆?，測(cè)得濃度為20mg/ml(濕 重）。
[0072] 實(shí)施例2人成纖維細(xì)朐的培養(yǎng)
[0073] 具體步驟如下：
[0074] 1)標(biāo)本系健康成人包皮環(huán)切術(shù)之包皮（健康包皮，由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大 學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科和中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容中心提 供，患者均知情并同意。下同），用75%酒精在凈化工作臺(tái)中浸浴并擦拭5min后，用PBS液 反復(fù)沖洗3遍，每遍3-5min;
[0075] 2)盡量去除皮下組織和真皮網(wǎng)狀層，在另一清潔培養(yǎng)皿中將表真皮部分剪成 2(^1\0.3(^大小，移入裝有0.25%分離酶10-201111的玻璃小瓶中，加蓋后置于41：消化 18-20小時(shí)；
[0076] 3)取出皮片至清潔培養(yǎng)皿，用且鑷子將表皮從真皮上揭下，彎頭鑷子刮真皮表面， 所得真皮盡量剪成糊狀，轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿，加〇. 2%膠原酶，所加量以浸沒(méi)全部真皮碎泥 為度，加蓋，移至37°C孵箱2-3小時(shí)，并不時(shí)搖動(dòng)；
[0077] 4)取出，成液體，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，加PBS液，1500rpm離心5min，棄上清，反復(fù)5 次。加DMEM至離心管，混勻成細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶中，置37°C、5%C02/95%空氣、90%以 上濕度孵箱培養(yǎng)，每2-3天換液1次；
[0078] 5)待原代培養(yǎng)的FB接近或達(dá)到融合，用0. 25%胰蛋白酶消化，在倒置顯微鏡下觀 察，細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)收縮裂隙時(shí)，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)接終止消化，CASY?]系 統(tǒng)分析細(xì)胞體積及增殖情況，并按照1:3傳代，建立FB細(xì)胞庫(kù)，為本實(shí)驗(yàn)提供來(lái)源統(tǒng)一的 FB。本實(shí)驗(yàn)所用FB為第4-10代。
[0079] 6) !CASY?:系統(tǒng)分析細(xì)胞體積及增殖情況：
[0080] 取CASY測(cè)量杯，每杯加入IOml的CASYton ;
[0081] 取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吹打均勻后，取50ul滴加于CASY測(cè)量杯中；
[0082] 將CASY測(cè)量杯置于測(cè)量毛細(xì)管；
[0083] 將鉬電極浸沒(méi)其中測(cè)量各標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞活力；
[0084] 每標(biāo)本測(cè)量3次。
[0085] 實(shí)施例3表皮干細(xì)朐的培養(yǎng)
[0086] 1.人表皮干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)
[0087] 標(biāo)本取自健康包皮。
[0088] 標(biāo)本取下后浸泡于PBS平衡鹽液中，4°C冰箱中保存，按下列步驟操作：
[0089]1)酒精浸泡5min后，置超凈工作臺(tái)上，用酒精棉球?qū)?biāo)本輕輕擦拭三遍；
[0090] 2)標(biāo)本移至培養(yǎng)皿中，用PBS平衡鹽液反復(fù)沖洗標(biāo)本3遍，每個(gè)角落均要沖洗到， 每遍不少于5min，直至標(biāo)本發(fā)白發(fā)脹；
[0091] 3)在培養(yǎng)皿中用手術(shù)剪剪去皮下組織，并將標(biāo)本剪成0. 3cmX2cm大小的皮條；
[0092] 4)將皮條置于培養(yǎng)皿中，加0.25%分離酶浸沒(méi)組織（分離酶與標(biāo)本之比為5:1);
[0093] 5) 4°C冰箱中消化過(guò)夜；
[0094] 6)取出消化后的標(biāo)本置于另一潔凈培養(yǎng)皿中，PBS平衡鹽液漂洗兩遍；
[0095] 7)用眼科鑷輕輕揭下表皮，真皮部分置于另一培養(yǎng)皿中（可用于分離培養(yǎng)成纖維 細(xì)胞），揭下的表皮置于培養(yǎng)皿中，加〇.25%胰蛋白酶2-3ml( -般表皮與胰蛋白酶體積比 為3 :1)，在37°C孵箱中消化30min ;
[0096] 8)消化時(shí)間滿30min后取出置于另一培養(yǎng)皿中，加含10%FBS的DMEM終止胰蛋 白酶消化，用吸管小心反復(fù)吹打，盡量使表皮分散；
[0097] 9)200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，IOOOrpm離心 5min;
[0098] 10)棄上清，加K-SFM于其中，制成細(xì)胞混懸液，利用CASY?甘算細(xì)胞活力及細(xì) 胞數(shù)；
[0099] 11)細(xì)胞按5XIO4/孔接種在預(yù)先鋪滿IV型膠原的24孔板中，30min后吸盡未貼 壁的細(xì)胞，利用CASY?·計(jì)算吸出液中的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算貼壁率=(接種的細(xì)胞總數(shù)-懸浮 的細(xì)胞數(shù)）/接種的細(xì)胞總數(shù)；
[0100] 12)以后每天更換K-SFM培養(yǎng)液。
[0101] 2.人表皮干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
[0102] 1)待原代表皮干細(xì)胞融合約70%后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌2-3遍；
[0103] 2)每孔加入0· 25%胰蛋白酶Iml后放入4°C冰箱；
[0104] 3)待4h后將培養(yǎng)板取出，輕輕拍打細(xì)胞脫落，加入含10%FBS的DMEM中和；
[0105] 4)將液體吸入15ml離心管中，用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)板后移入離心管中，IOOOrpm/ s，離心 5min;
[0106] 5)棄去上清液，加入K-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，CASY?i計(jì)數(shù)后備用。
[0107] 在上述實(shí)施例中，采用膠原酶消化法消化健康成人包皮真皮獲得FB，進(jìn)行原代培 養(yǎng)。
[0108] 如圖IA所示，剛移入培養(yǎng)瓶的FB，在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為各層面的大量的懸浮圓 形細(xì)胞，30min后即可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁并伸展，12小時(shí)后絕大部分細(xì)胞貼壁，并伸出較鈍細(xì) 胞突出，并隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，表現(xiàn)為突起變長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，基本平行，在接種的7-10天 培養(yǎng)的FB可融合，且排列緊密呈漩渦狀生長(zhǎng)。如圖IB所示，傳代培養(yǎng)的FB生長(zhǎng)旺盛，呈梭 形，排列緊密有序，在不斷通過(guò)胰蛋白酶消化提供種子細(xì)胞用于組織工程皮膚制備的同時(shí)， 細(xì)胞庫(kù)的FB-直保持正常的生長(zhǎng)活性，未發(fā)生污染現(xiàn)象。
[0109] 實(shí)施例4復(fù)方殼多糖組織工稈皮膚制備
[0110] 具體步驟如下：
[0111] 1)在冰浴條件下按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性 蛋白及濃縮DMEM;
[0112] 2)用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4 ;
[0113] 3)在凝膠中加入FB細(xì)胞，細(xì)胞量達(dá)到IOVml;
[0114] 4)吸入24孔板培養(yǎng)板中，每孔1ml，放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后，每孔輕輕加入1代 表皮干細(xì)胞Iml(濃度分別為8XIO5Ail)，最后再加入KGM培養(yǎng)基，置37°C、5%C02/95%空 氣、90%以上濕度孵箱培養(yǎng)，每天換液1次；
[0115] 5)培養(yǎng)3天后，用不銹鋼篩網(wǎng)支架抬高3_，行氣液界面培養(yǎng)，并將組織工程皮膚 分為兩組：一組僅用KGM培養(yǎng)，一組在KGM中添加EGF(濃度為20ng/ml);兩組均每日垂直 振蕩，振蕩頻率為75次/分，振幅為2cm;
[0116] 6)培養(yǎng)16天后，用4%多聚甲醛固定后行HE染色，觀察皮膚生長(zhǎng)情況。
[0117] 7)HE染色
[0118]脫水：組織工程皮膚的各個(gè)標(biāo)本按照30%酒精30min---50(%酒精3〇111；[11---75% 酒精30min 80 %酒精30min 95 %酒精30min(兩次）無(wú)水酒精30min(兩次），梯度 脫水，
[0119] 浸蠟，石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片；
[0120] 脫蠟水洗：烤片一二甲苯I、11各5min-一水洗（無(wú)水酒精、95%酒精、80%酒 精各Imin蒸饋水）；
[0121] HE染色按常規(guī)進(jìn)行。
[0122] 在上述實(shí)施例中，如圖2所示，加入8XIO5Ail的ESC，僅用KGM培養(yǎng)行氣液界面培 養(yǎng)，可見(jiàn)表皮結(jié)構(gòu)分化良好，并大致可分為基底層，棘層和角質(zhì)層，角質(zhì)層較厚，基底層排列 規(guī)則，各層均有層數(shù)不等的扁平梭形細(xì)胞，但未見(jiàn)細(xì)胞向真皮內(nèi)生長(zhǎng)分化；如圖3和圖4所 示，加入8XIO5Ail的ESC，在KGM中添加濃度為20ng/ml的EGF，可見(jiàn)皮膚熟化程度較高， 表皮分化良好，表真皮結(jié)合較好，見(jiàn)表皮細(xì)胞向真皮基質(zhì)凝膠內(nèi)生長(zhǎng)，并出現(xiàn)管腺樣結(jié)構(gòu)。
[0123]實(shí)施例5復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備
[0124] 具體操作步驟如下：
[0125] 1)在冰浴條件下按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性 蛋白及濃縮DMEM;
[0126] 2)用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4;
[0127] 3)在凝膠中加入1代表皮干細(xì)胞，細(xì)胞量為SXlOVml;
[0128] 4)吸入24孔板培養(yǎng)板中，每孔lml，放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后，再加入KGM，置 37°C、5%C02/95%空氣、90%以上濕度孵箱培養(yǎng)，每天換液1次；
[0129] 5)每日垂直振蕩，振蕩頻率為75次/分，振幅為2cm ;
[0130] 6)培養(yǎng)3天后，在KGM中添加EGF(濃度為20ng/ml);
[0131] 7)培養(yǎng)16天后行組織學(xué)及形態(tài)學(xué)檢查。
[0132]實(shí)施例6組織工程凝膠的觀察
[0133]1.組織學(xué)觀察
[0134] 1)將長(zhǎng)有細(xì)胞團(tuán)的組織工程凝膠置于特制的小盒中，加入適量OTC包埋劑浸沒(méi)凝 膠，液氮下速凍5-lOsec，使OTC固化呈乳白色后取出；
[0135]2)冰凍切片機(jī)開(kāi)始切片，切片厚度為60um ;
[0136] 3)將切片貼附在涂有多聚賴氨酸的載玻片上，室溫下風(fēng)干后，置于無(wú)水乙醇和甲 醛液各半配制的溶液中固定30min，PBS漂洗5minX3次；
[0137] 4)按常規(guī)進(jìn)行HE染色。
[0138] 在上述實(shí)驗(yàn)中，如圖5A和圖5B所示，組織切片HE染色可見(jiàn)凝膠內(nèi)的細(xì)胞成團(tuán)生 長(zhǎng)形成管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔結(jié)構(gòu)的管壁由單層細(xì)胞構(gòu)成，中間可見(jiàn)較大腔隙，細(xì)胞胞漿紅染， 部分細(xì)胞核位于基底部，顏色較深，部分細(xì)胞形態(tài)可見(jiàn)腔面窄、基底部大，排列有一定的極 性，與汗腺分泌部管狀結(jié)構(gòu)相似。
[0139] 2、免疫熒光觀察
[0140] 1)將凝膠置于4%多聚甲醛中固定2h，PBS漂洗5minX3次；
[0141] 2)加一抗工作液（CK19、CK18、CEA)，濕盒內(nèi)37°C孵箱內(nèi)放置30min，PBS漂洗 5minX3 次；
[0142] 3)加入熒光標(biāo)記的抗體羊抗鼠IgG-FITC1:100,濕盒內(nèi)37°C孵箱內(nèi)放置30min， PBS漂洗 5minX3 次；
[0143] 4)緩沖甘油封片；
[0144] 5)將制備的樣品放在激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，在倒置顯微鏡下尋找細(xì) 胞后轉(zhuǎn)到激光光源進(jìn)行掃描。
[0145] 在上述實(shí)驗(yàn)中，ESC和汗腺細(xì)胞均表達(dá)的CK19,在CLSM掃描下，利用抗-CK19抗體 觀察凝膠中細(xì)胞的形態(tài)。如圖6所示，可以發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔結(jié) 構(gòu)由單層細(xì)胞構(gòu)成的管壁和中央空腔組成，與汗腺分泌部的管狀結(jié)構(gòu)相似。如圖7和圖8 所示，管腔樣結(jié)構(gòu)抗-CK18和抗-CEA免疫熒光染色均表達(dá)陽(yáng)性。
[0146] 3.透射電鏡下觀察
[0147] 1)2. 5%的戊二醛固定膠原凝膠中的細(xì)胞團(tuán)2h;
[0148] 2)PBS漂洗lh;
[0149] 3)1 %鋨酸固定Ih;
[0150] 4)PBS漂洗 3 次，每次 5min;
[0151] 5)50%、70%、80%、90%、無(wú)水丙酮1、無(wú)水丙酮11，分別脫水1511^11;
[0152] 6) 1:1丙酮和環(huán)氧樹(shù)脂的混合劑室溫中浸透3h ;
[0153] 7) 1:2丙酮和環(huán)氧樹(shù)脂的混合劑室溫中浸透Ih;
[0154] 8)純丙酮 37°C浸透 2h。；
[0155] 9)環(huán)氧樹(shù)脂包埋液注入干燥的塑料模板中；
[0156] 10)細(xì)胞團(tuán)移至塑料模板的液面上，使其自然沉落；
[0157] 11)貼標(biāo)簽，包埋后的模板依次置于 37°C(12h)、45°C(12h)、60°C(24h);
[0158] 12)行半薄切片定位，光學(xué)顯微鏡觀察，確定檢測(cè)范圍；
[0159] 13)制備超薄切片；
[0160] 14)撈片：鑷子夾持銅網(wǎng)，蘸取液面上的切片；
[0161] 15)濾紙吸干銅網(wǎng)；
[0162] 16)醋酸鈾乙醇液染色20min;
[0163] 17)雙蒸水沖洗；
[0164] 18)檸檬酸鉛液染色I(xiàn)Omin;
[0165] 19)雙蒸水沖洗；
[0166]20)透射電鏡下觀察。
[0167] 在上述實(shí)驗(yàn)中，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，如圖9所示，電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有成束的 張力細(xì)絲,含有類似分泌樣顆粒的高電子致密度物質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成分泌增多,較多核糖體， 如圖10所示，細(xì)胞中則含有較多線粒體；如圖11所述，細(xì)胞有指狀突起，如圖12所示，細(xì)胞 之間可見(jiàn)緊密連接和縫隙連接，有以及類似分泌小管的腔隙。
[0168] 4、激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道
[0169] 1)實(shí)驗(yàn)分組：取24孔培養(yǎng)板中生長(zhǎng)良好的汗腺腺上皮管腔樣細(xì)胞團(tuán)20孔，隨機(jī) 分為4組。具體見(jiàn)下表1:
[0170]表1激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道的實(shí)驗(yàn)分組
[0171]
【權(quán)利要求】
1. 一種表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 鼠尾膠原的制備 將凍存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解凍后，去皮，采用D-Hanks液沖洗，抽出尾腱，剪 碎成泥，溶于無(wú)菌的冰醋酸中保存一段時(shí)間，其間反復(fù)振蕩，然后進(jìn)行離心處理，提取上清 溶液，得到乳白色半透明粘稠液體，即為所得物鼠尾膠原，將其貯存?zhèn)溆茫? 2) 人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 將健康成人包皮環(huán)切術(shù)的包皮標(biāo)本用酒精浸浴并擦拭，再用PBS液反復(fù)沖洗；去除皮 下組織和真皮網(wǎng)狀層，將表真皮部分剪成長(zhǎng)方形條狀后進(jìn)行消化；然后將表皮從真皮上揭 下，刮真皮表面，將所得真皮剪成糊狀，加膠原酶，加蓋，移至孵箱中并不時(shí)搖動(dòng)；接著取出 液體，篩網(wǎng)過(guò)濾，加PBS液，離心棄上清，加DMEM混勻成細(xì)胞懸液，移入孵箱中培養(yǎng)，待原代 培養(yǎng)的FB接近或達(dá)到融合后，用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)收縮裂 隙時(shí)，用含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)接終止消化，最后分析細(xì)胞體積及增殖情況，并按照1:3傳 代，建立FB細(xì)胞庫(kù)，提供來(lái)源統(tǒng)一的FB。 3) 表皮干細(xì)胞的培養(yǎng) 先將人表皮干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)，包括下列步驟： a)將取下的人包皮標(biāo)本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡鹽液沖洗，直至標(biāo)本發(fā)白 發(fā)漲； b)將上述步驟a)中的人包皮標(biāo)本剪去皮下組織后剪成長(zhǎng)方形的條狀，然后進(jìn)行分離 消化； c)將步驟b)中的人包皮標(biāo)本用PBS平衡鹽液漂洗，對(duì)人包皮標(biāo)本的表皮和真皮進(jìn)行分 離，將分離后所得的表皮進(jìn)行消化，消化后進(jìn)行離心、篩網(wǎng)過(guò)濾，棄去上清液，再放入K-SFM 培養(yǎng)液中，制成細(xì)胞混懸液，計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞按5 X 104/孔接種在預(yù)先鋪滿IV 型膠原的培養(yǎng)板中，30min后吸盡未貼壁的細(xì)胞，計(jì)算吸出液中的細(xì)胞數(shù)和貼壁率，并每天 更換K-SFM培養(yǎng)液； 再進(jìn)行人表皮干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，包括下列步驟： d)待原代表皮干細(xì)胞融合約70%后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS進(jìn)行洗滌； e) 每孔加入0. 25 %膜蛋白酶后放入冰箱，保持在4C; f)待4h后將培養(yǎng)板取出，輕輕拍打細(xì)胞脫落，加入含10% FBS的DMEM中和； g) 將液體吸入離心管中，用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)板后移入離心管中進(jìn)行離心； h)棄去上清液，加入K-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，計(jì)算細(xì)胞數(shù)后備用； 4) 復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備 按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DMEM;再 用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4;在凝膠中加入FB細(xì)胞，細(xì)胞量達(dá)到105/ml ;吸入多孔培 養(yǎng)板中，放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后，每孔輕輕加入濃度為8X105/ml的1代表皮干細(xì)胞，最 后再加入KGM培養(yǎng)基，置孵箱培養(yǎng)，每天進(jìn)行換液；待培養(yǎng)3天后，進(jìn)行行氣液界面培養(yǎng)，將 組織工程皮膚分為兩組：一組僅用KGM培養(yǎng)，一組在KGM中添加EGF;兩組均每日垂直振蕩； 待培養(yǎng)16天后，用4%多聚甲醛固定后行HE染色，觀察皮膚生長(zhǎng)情況； 5) 復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備 按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DMEM;再 用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4 ;在凝膠中加入1代表皮干細(xì)胞，細(xì)胞量為8X105/ml;吸 入多孔培養(yǎng)板中，放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后，再加入KGM，置孵箱中培養(yǎng)，每天進(jìn)行換液；每 日垂直振蕩；待培養(yǎng)3天后，在KGM中添加濃度為20ng/ml的EGF;待培養(yǎng)16天后行組織學(xué) 及形態(tài)學(xué)檢查； 6)組織工程凝膠的觀察 步驟包括組織學(xué)觀察、免疫熒光觀察、透射電鏡下觀察以及激光共聚焦顯微鏡觀察鈣 通道。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述步驟1)中尾腱保存條件為4°C，保存48h，所得物鼠尾膠原的貯存條件為4°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述各步驟中酒精的濃度均為75%，所述孵箱的條件為37°C、5%C02/95%空氣、90%以上濕 度，所述篩網(wǎng)規(guī)格為200目。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述步驟1)中離心條件為3000rpm，離心lh;所述步驟2)中離心條件為1500rpm，離心5min; 所述步驟3)中離心條件為lOOOrpm，離心5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述步驟2)和3)b)中人包皮標(biāo)本剪成長(zhǎng)方形條狀的尺寸為0. 3cmX 2cm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述步驟3)c)中分離采用0. 25%分離酶進(jìn)行，其中所述分離酶與樣本的比例為5:1，消化采 用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行，其中表皮與所述胰蛋白酶體積比為3:1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述步驟2)中采用且鑷子將表皮從真皮上揭下，彎頭鑷子刮真皮表面；所述步驟3)c)中表皮 和真皮進(jìn)行分離采用眼科鑷輕輕揭下表皮即完成表皮和真皮的分離。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述步驟2)中所述FB為第4-10代；所述步驟3)、4)和5)中培養(yǎng)板為24孔培養(yǎng)板。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述步驟2)中采用CASY?系統(tǒng)分析細(xì)胞體積及增殖情況，所述步驟3)c)中利用CASY* 系統(tǒng)來(lái)分析計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所 述步驟4)和步驟5)中所述的混勻在冰浴條件下進(jìn)行和所述的垂直振蕩條件為振蕩頻率為 75次/分，振幅為2cm。
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK104399125SQ201410718190
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】王元元, 伍津津, 楊亞?wèn)|, 魯元?jiǎng)? 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院