本發(fā)明涉及生物技術領域的一種細胞培養(yǎng)基，是一種用于間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血清培養(yǎng)基。

背景技術：

間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstem/stromalcell，mscs)是起源于中胚層的一類成體干細胞；其同樣具有多向分化潛能，在體內(nèi)外適宜條件下，間充質(zhì)干細胞可以分化為成骨細胞，軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、肌細胞等；由于其高效的分化潛能使其臨床應用備受人們關注，現(xiàn)已經(jīng)被用于多種疾病的治療研究。mscs可以通過分泌大量生物活性分子包括多種生長因子、細胞因子(cytokine)和趨化因子(chemokine)等，通過對所處微環(huán)境的影響來調(diào)控自身的各種基因的表達進而通過旁分泌的方式來影響周圍的細胞，發(fā)揮調(diào)控作用進而刺激受損細胞修復并抑制炎癥；且越來越多的研究表明，mscs通過特定的分化途徑取代那些受損的細胞可能僅是mscs發(fā)揮了其治療作用的一小部分功能而已；在機體受損如發(fā)生炎癥和/或腫瘤時，自身或外源的間充質(zhì)干細胞在一系列歸巢信號的引導下，可以自發(fā)的定向趨化性遷移到達損傷部位并定植存活發(fā)揮調(diào)節(jié)與組織修復作用，向缺血或損傷組織歸巢是mscs重要特征，而不會考慮是否是相關的組織；眾多研究均表明，mscs歸巢的數(shù)量與療效緊密相連，但歸巢的數(shù)量與移植的數(shù)量并無相關性，因此，msc的特異性歸巢與植入靶組織的能力和效率，是其對疾病有效性的關鍵；且大量的文獻表明，mscs可以與各種不同的免疫細胞如t淋巴細胞、自然殺傷性細胞等相互作用，影響細胞表型及調(diào)控細胞的增殖分化等達到調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能；由于其高效的多向分化潛能和免疫抑制功能等優(yōu)越特性，在過去的幾十年中，間充質(zhì)干細胞治療作為一種新的可治療多種疾病的治療方法，對它的臨床應用已經(jīng)取得長足的進步,目前已經(jīng)有部分產(chǎn)品得到一些國家食品藥品管理局的批準，用于不同疾病的治療。

由間充質(zhì)干細胞在正常成體組織或器官包括但不局限于骨髓、臍帶、脂肪組織、心臟、肝臟、十字韌帶、眼瞼、牙髓等部位；研究表明，這些低量的由于僅僅通過自體或異體分離的間充質(zhì)干細胞無法滿足臨床或科研需求，需要對間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)且擴增以滿足治療或科研需要；通常體外培養(yǎng)和擴增間充質(zhì)干干細胞需要在培養(yǎng)基中加入10％-20％的胎牛血清以滿足間充質(zhì)干細胞生長且保持其生物學特性。使用胎牛血清雖然可以滿足間充質(zhì)干細胞的正常生長增殖還能提供貼壁因子以滿足貼壁依賴細胞的貼壁生長等；但使用動物血清弊端隨著治療研究的開展也越漸明顯；動物血清存在成分不明確的未知蛋白為科研和治療帶來很大的干擾；且往往批次不同，動物血清之間的成分差異也大，穩(wěn)定性較差，對研究的穩(wěn)定性影響較大，動物血清還可能攜帶未知的感染物和具有免疫原性的異種蛋白將對治療帶來極大的威脅等；綜上，為了能更好的在體外培養(yǎng)和擴增間充質(zhì)干細胞，克服動物血清帶來的克重弊端，在細胞培養(yǎng)過程中尋找fbs等的替代物或采用無血清培養(yǎng)條件培養(yǎng)，取消非人產(chǎn)品的使用來降低潛在的風險是有必要的；學者們很早就開始了對無血清的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基的研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服現(xiàn)有培養(yǎng)技術的不足，避免了含動物血清的培養(yǎng)基對細胞產(chǎn)品帶來的潛在風險，為體外培養(yǎng)和擴增間充質(zhì)干細胞提供了一種化學成分明確的無血清培養(yǎng)基。

根據(jù)上述培養(yǎng)基的需求，本發(fā)明用于體外培養(yǎng)和擴增間充質(zhì)干細胞無血清，其特征在于，本發(fā)明是一種水溶液，其組分包含如下：

所述的基礎培養(yǎng)基為α-mem、dmem、imdm/f12(體積比：imdm:f12＝1:1)、dmem/f12(體積比：dmem:f12＝1:1)的培養(yǎng)基中的一種。

所述的培養(yǎng)基的細胞因子中，堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)為培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞所必需成分，成纖維細胞生長因子(egf)、表皮生長因子(tgfβ1)和血小板衍生因子(pdgf-bb)可任選兩種組分組合配置。

所述的胰島素添加量為1-20ug/ml，可為臨床級用藥或重組蛋白。

所述的微量元素以亞硒酸鈉化合物形式提供，亞硒酸鈉添加量為10～50um。

所述培養(yǎng)基的抗氧化劑為巰基乙醇、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、亞硒酸鈉的一種或幾種。所述組分中的10～50um的巰基乙醇和10～50um的亞硒酸鈉可被50-150u/ml的氧化氫酶、或50-150u/ml的超氧化物歧化酶所替代，或多種組合使用。

所述的α-mem、dmem、imdm與ham’sf12、dmem與ham’sf12基礎培養(yǎng)基的組分在已有的文獻中已有公開報道，這里不再贅述。

其中各組分及其作用如下表：

本發(fā)明的有益效果為：體外培養(yǎng)和擴增間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基既要能滿足細胞正常的生長增殖，又要能維持其多向分化潛能。培養(yǎng)基中各營養(yǎng)成分需要合理均衡，以滿足細胞生長、代謝和功能維持的需求。碳水化合物、氨基酸、無機鹽、激素生長因子、微量元素等眾多成分需要按照一定的比例添加，過多過少都會對細胞的生長狀態(tài)造成不良影響。因此在體外培養(yǎng)過程中，本發(fā)明為了維持間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能，在培養(yǎng)基中加入適當比例的堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子或轉(zhuǎn)化生長因子等，在促進細胞正常生長增殖的同時又維持了間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能特性。利用本發(fā)明培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞在體外誘導培養(yǎng)基處理下能分化為脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞，且能夠有效地避免因使用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞產(chǎn)品帶來的潛在危險。

附圖說明

圖1中1.1－1.4是本發(fā)明中無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細胞至匯合的實物圖(其中，左側(cè)圖均為顯微鏡下4x放大的細胞狀態(tài)實物圖，右側(cè)圖均為顯微鏡下10x放大的細胞狀態(tài)實物圖)；

其中；圖1.1脂肪間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)第2天時細胞狀態(tài)實物圖；

圖1.2脂肪間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)第5天時細胞狀態(tài)實物圖；

圖1.3脂肪間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)第8天時細胞狀態(tài)實物圖；

圖1.4脂肪間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)第12天時細胞狀態(tài)實物圖；

圖2是本發(fā)明中無血清培養(yǎng)基和dmem+10％fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細胞同時培養(yǎng)十天的生長形態(tài)學的比較實物圖(左、右側(cè)圖均為顯微鏡下4x放大的細胞狀態(tài)實物圖)；

圖3是rtca實時無標記細胞分析儀監(jiān)測本發(fā)明中無血清培養(yǎng)基和dmem+10％fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細胞的細胞生長速率的示意圖；

圖4是本發(fā)明中無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞至匯合的實物圖(三圖均為顯微鏡下10x放大的細胞狀態(tài)實物圖)；

圖5是流式細胞儀檢測本發(fā)明中無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細胞表面標志物示意圖；

圖6是采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增后誘導脂肪、成骨和軟骨分化后的染色圖(三圖均為顯微鏡下10x放大的細胞狀態(tài)實物圖)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖說明就具體實施方式，進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本的、發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領域技術人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。

為了理解本發(fā)明，下面對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。

以下實施例給出本發(fā)明用于間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血清培養(yǎng)基的具體實施方式，但本發(fā)明不限于這些實施例。

實施例1

以dmem為基礎培養(yǎng)基，其組分如下，

將上述組分溶于超純水或三蒸水中，在室溫(18-25℃)情況下攪拌溶解，并用0.5mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.1±0.1，定容至1l，0.22um濾膜過濾除菌后，即可用于間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增。

以脂肪間充質(zhì)干細胞為例：

脂肪間充質(zhì)干細胞(admscs)體外培養(yǎng)：將脂肪組織置于75cm²細胞培養(yǎng)瓶中，加入等體積的內(nèi)含1％雙抗(青霉素和鏈霉素)和5ug/ml的兩性霉素b的pbs(磷酸鹽緩沖液)，旋緊瓶蓋，劇烈搖晃5-10s后，靜置，使脂肪組織與pbs分層，脂肪組織位于上層，隨后移去pbs。上述步驟反復3次以上，直至下層pbs清亮無血色時停止清洗。在清洗好的脂肪組織中加入等體積的i型膠原酶，添加dnasei(dna酶1型)，使得dnasei的終濃度為10ug/ml；在所述三者混合溶液中再添加1％的雙抗和5ug/ml的兩性霉素b，劇烈搖晃5-10s后，放入37℃水浴鍋中消化1-2h,消化過程中每10分鐘取出培養(yǎng)瓶劇烈搖晃5-10s，使脂肪組織與i型膠原酶充分接觸；直至脂肪組織呈現(xiàn)湯狀時停止，加入等體積的上述配制的無血清培養(yǎng)基，終止消化；靜置5min，待其分層后，棄掉上層未消化的脂肪組織，將下層的細胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中在400g條件下離心10min，離心結(jié)束后去除上清溶液；將留置于離心管中的細胞團用20ml配制好的紅細胞裂解液重懸，并于室溫(18-25℃)下孵育10min,其中在孵育5min時重新混勻細胞與紅細胞裂解液，以使紅細胞完全破裂；隨后于300g條件下離心10min；將離心后的細胞去除上清，加入5ml的清洗液，吹打重懸后，放置1min，使還未消化的微小組織塊沉降，然后將細胞懸液用70um過濾網(wǎng)過濾；隨后收集過濾后的濾液，以400g條件下離心10min,棄去上清；加入10ml上述配制的無血清培養(yǎng)基重懸，取出10ul的細胞懸液于細胞計數(shù)板中計數(shù)，然后調(diào)整細胞濃度至1×10⁵個/ml；將調(diào)整好的細胞接種到25cm²的細胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％co2、100％濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每3天換一次無血清培養(yǎng)基，10天后即可長至90％的匯合度，此時可進行細胞傳代培養(yǎng)。

細胞生長速率檢測：將rtca儀器淋灑75％酒精消毒后放入co2培養(yǎng)箱中；向e-plate檢測板中分別添加dmem+10％fbs培養(yǎng)基及上述無血清培養(yǎng)基并測定兩種培養(yǎng)基的背景阻抗值；收集對數(shù)期細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度，分別加入5000個細胞到含有兩種培養(yǎng)基(上述配置的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)和dmem+10％fbs培養(yǎng)基)的e-plate檢測板中，每種培養(yǎng)基設置2個平行，并將檢測板放入檢測臺上，進行實時動態(tài)細胞增殖檢測；實時監(jiān)測72小時后，停止監(jiān)測繪制生長曲線。

上述實施例1的培養(yǎng)過程詳見附圖1至附圖3。

實施例2

以dmem/f12為基礎培養(yǎng)基，其組分如下：

將上述組分溶于超純水或三蒸水中，在室溫(18-25℃)情況下攪拌溶解，，并用0.5mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.1±0.1，定容至1l，0.22um濾膜過濾除菌后，即可用于間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增。

以臍帶間充質(zhì)干細胞為例：

臍帶間充質(zhì)干細胞(ucmscs)體外培養(yǎng)：從采集瓶中取出臍帶，將臍帶放置于預先添加有無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，洗去臍帶殘留血液；將洗凈的臍帶用經(jīng)高壓消毒滅菌的剪刀將臍帶剪成2-3cm的若干小段，再次漂洗，縱行剖開臍帶，剔除1條臍靜脈、兩條臍動脈，剝離出華通氏膠(wharton'jelly)，再次用剪刀將華通膠剪碎成1mm³的若干小組織塊，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，加入上述配置的間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，加入的無血清培養(yǎng)基剛好沒過組織塊即可；于5％co2、37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天；每3天需更換一次新鮮的無血清培養(yǎng)基，14天后細胞匯合度達到85％時消化收獲細胞。

流式細胞儀檢測ucmscs表型：利用上述配制的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代到第3代的臍帶間充質(zhì)干細胞進行流式細胞術檢測，當?shù)?代的細胞長到85-90％匯合度時，采用常規(guī)傳代方法收集細胞，用pbs重懸細胞，計數(shù)，并將細胞調(diào)整到2x10⁶個/ml。分別在5個流式管中添加50ul的細胞；采用單染法，分別添加3種不同熒光標記的5ul的陽性抗體(cd73,cd90和cd105)、20ul的陰性抗(cd11borcd14,cd34,cd45,cd19orcd79α,hla-dr)孵育30分鐘，加入500ul預冷的pbs洗滌，300g條件下離心8min后，棄上清用100ulpbs重懸，上機檢測。

根據(jù)isct的標準，脂肪間充質(zhì)干細胞至少需要滿足陽性表達cd73,cd90andcd105三種表面標志物，且純度要求在95％以上，不表達造血系統(tǒng)來源的表面標志物cd11borcd14,cd34,cd45,cd19orcd79α,hla-dr，并且表達這些表面標志物的細胞數(shù)量應控制在2％以下。

ucmscs分化能力檢測：利用上述配制的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代到第3代的細胞進行流式細胞術檢測，當?shù)?代的細胞長到85-90％匯合度時，采用常規(guī)傳代方法收集細胞，用pbs重懸細胞，計數(shù)，并將細胞調(diào)整到1×10⁵個/ml并分別接種至6孔板上培養(yǎng)。當長至80％匯合度時，將常規(guī)的完全培養(yǎng)基替換成分化培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1個月，每3天換液。1個月后，去除培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，用pbs清洗，去除pbs后每孔添加1ml的4％多聚甲醛于常溫下孵育15-30min。然后去除多聚甲醛，滅菌水清洗。

成脂分化染色：添加1000ul的oilredo染色液于細胞培養(yǎng)板中，室溫孵育5min。去除染色液，滅菌水至少清洗3次以除去未結(jié)合的染料。蘇木精染色10min后，去除染液，并用滅菌水清洗。倒置顯微鏡下觀察染色情況，脂滴會被染成紅色，核質(zhì)染成藍色或紫色。

成骨分化染色：添加1000ul的alizarinreds染色液于細胞培養(yǎng)板中，并室溫孵育5min。去除染液，滅菌水充分清洗至少3次以除去未結(jié)合的染料。倒置顯微鏡下觀察染色情況，分化后的細胞外基質(zhì)存在大量的鈣質(zhì)，染色后細胞被染成紅色。

成軟骨分化染色：添加1000ul的alcianblue染色液于細胞培養(yǎng)板中，并室溫孵育5min。去除染液，滅菌水充分清洗至少3次以除去未結(jié)合的染料，倒置顯微鏡下觀察染色情況，分化后的細胞外基質(zhì)存在大量氨基萄聚糖，被染成藍色。

上述實施例2的培養(yǎng)過程詳見附圖4至附圖6。