本申請(qǐng)屬于動(dòng)物單細(xì)胞制備領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種魚(yú)類(lèi)單細(xì)胞懸液的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著醫(yī)學(xué)及細(xì)胞組學(xué)的快速發(fā)展，單細(xì)胞懸液制備已經(jīng)越來(lái)越重要。單細(xì)胞懸液制備研究中，國(guó)外最先見(jiàn)于對(duì)小鼠畸胎瘤組織用胰蛋白酶解離制備單細(xì)胞懸液的研究中，國(guó)內(nèi)最早見(jiàn)于對(duì)喉癌組織鱗狀上皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備。組織單細(xì)胞懸液的用途廣泛，可應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)等。流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，fcm)是在20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來(lái)的一種對(duì)細(xì)胞的物理和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行快速定性和定量的技術(shù)，該技術(shù)以大量的單個(gè)細(xì)胞為檢測(cè)單位，具有研究結(jié)果客觀準(zhǔn)確、靈敏且同時(shí)能夠檢測(cè)多個(gè)參數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，各種新型特異性熒光染料的不斷開(kāi)發(fā)和檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，促使fcm的應(yīng)用由臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸向其他生物學(xué)領(lǐng)域快速擴(kuò)展。

sequeira等(sequeirat,vilanovam,lobo-da-cunhaa,etal.flowcytometricanalysisofmolt-relatedchangesinhemocytetypeinmaleandfemalepenaeusjaponicus[j].thebiologicalbulletin,1995,189(3):376-380.)1995年對(duì)日本對(duì)蝦(penaeusjaponicus)在蛻皮間期和蛻皮時(shí)期的血細(xì)胞亞群組成情況進(jìn)行報(bào)道，magnadottir等(óttirbótm,óttirhkóttirsg.characterisationofmonoclonalantibodiestoseparateepitopesonsalmonigmheavychain[j].fish&shellfishimmunology,1996,6(3):185-198.)1996年對(duì)鮭魚(yú)血液?jiǎn)慰寺】贵w進(jìn)行研究。國(guó)內(nèi)關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的應(yīng)用較早見(jiàn)于對(duì)鮑、泥蚶、牡蠣，對(duì)蝦等的倍性、血細(xì)胞分群，細(xì)胞周期等的研究，之后部分魚(yú)類(lèi)的血液血細(xì)胞倍性分析，dna含量測(cè)定，細(xì)胞凋亡等方面的研究陸續(xù)被報(bào)道，但都主要集中于血液和血細(xì)胞的特性檢測(cè)，對(duì)魚(yú)類(lèi)活體器官組織做流式單細(xì)胞懸液制備及檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。

目前將動(dòng)物組織處理為單細(xì)胞懸液方法主要有機(jī)械法(剪切、研磨、吹打，網(wǎng)搓等)，化學(xué)試劑處理法(edta，egta陽(yáng)離子螯合劑等)，酶解法(胰酶、膠原酶、彈性蛋白酶，透明質(zhì)酸酶、溶菌酶)等三種方法，處理方法不同對(duì)組織的處理效果也各有優(yōu)劣。機(jī)械法操作簡(jiǎn)便，較為適合處理一些含纖維組織較少的軟組織，但此法易產(chǎn)生較多組織團(tuán)塊和細(xì)胞碎片，必須用細(xì)胞篩過(guò)濾去除團(tuán)塊。ca²⁺、mg²⁺在組織細(xì)胞間起黏連作用，化學(xué)試劑處理法則主要是通過(guò)化學(xué)試劑處理將ca²⁺、mg²⁺置換出來(lái)從而破壞黏連作用以達(dá)到分離細(xì)胞的目的。該方法在制備黏連性較大的實(shí)體臟器的單細(xì)胞懸液的過(guò)程中如腫瘤組織等，可以有效的防止單細(xì)胞再聚集，但此方法可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如edta能夠和緩沖液中的ca²⁺發(fā)生螯合反應(yīng)或?qū)?xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成破壞。

酶解法具有制得單細(xì)胞損傷較小，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，具有特異酶解作用等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此為目前將組織分散成單個(gè)細(xì)胞試驗(yàn)中最為常用的方法。胰酶能夠水解酯鍵和肽鍵，但如消化作用較強(qiáng)會(huì)損傷細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)；各種膠原酶都能夠有針對(duì)性的降解幾種膠原，膠原酶ⅳ含有多種蛋白酶，能夠不損傷其它蛋白質(zhì)和組織的同時(shí)特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，酶解作用較為溫和；彈性蛋白酶可以將起連接作用的糖蛋白和彈性蛋白水解破壞，透明質(zhì)酸酶能夠降解透明質(zhì)酸，溶菌酶則能夠水解蛋白質(zhì)和肽類(lèi)的糖苷鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本申請(qǐng)針對(duì)上述的問(wèn)題，提供了一種魚(yú)類(lèi)單細(xì)胞懸液的制備方法，本發(fā)明采用酶解研磨法，結(jié)合了研磨法和酶解法兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)酶解研磨對(duì)組織處理更充分，解決了制備魚(yú)類(lèi)單細(xì)胞懸液細(xì)胞得率低和細(xì)胞活力低的問(wèn)題。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本申請(qǐng)公開(kāi)了一種魚(yú)類(lèi)單細(xì)胞懸液的制備方法，包括以下步驟：

1)pbs試劑、d-han氏液和iv型膠原酶液的配制；

2)準(zhǔn)備試驗(yàn)魚(yú)的腎臟組織塊，放入提前置于冰浴中的平皿中，用pbs沖洗腎臟組織3次以上，將組織表面的血細(xì)胞沖洗干凈；

3)將腎臟組織塊放人冰浴中的平皿里，然后加入pbs，將腎臟組織剪切成為1mm³細(xì)小碎塊，移液槍小心吸走多余pbs，將腎臟組織塊放入scientz50高通量組織研磨器5ml離心管中；

4)將iv型膠原酶在水浴中加熱，取2ml加熱后的iv型膠原酶加入離心管中，同時(shí)加入水浴預(yù)熱的pbs定容至4ml，放入2顆氧化鋯球進(jìn)行研磨，研磨好后打開(kāi)研磨器開(kāi)關(guān)將組織勻漿放入恒溫水浴振蕩器中酶解消化；

5)用細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷的5ml離心管內(nèi)進(jìn)行離心處理，pbs洗3次，每次進(jìn)行低速離心處理，棄上清液除去細(xì)胞碎片，用細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液并用pbs定容為3ml，4℃保存待用。

進(jìn)一步地，步驟1)中的pbs試劑、d-han氏液和iv型膠原酶液的配制具體為：

1.1)pbs試劑配制：0.01mol/lpbs(ph＝7.2)：準(zhǔn)確稱(chēng)量8.00gnacl，0.20gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4，溶解于800ml經(jīng)高壓滅菌的超純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.2，滅菌超純水定容到1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2)d-han氏液配制：nacl8.00g，kcl0.40g，na2hp04·h2o0.06g，kh2po40.06g，nahco30.35g，酚紅0.02g，溶于800m1高壓滅菌的雙蒸水，調(diào)節(jié)ph值至7.2-7.4，滅菌超純水定容為1000ml，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3)iv型膠原酶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量50mgiv型膠原酶，室溫25℃攪拌溶解于100mld-han氏液，4℃過(guò)夜，0.22um過(guò)濾除菌，配制成0.5g/liv型膠原酶液。

進(jìn)一步地，步驟3)中的腎臟組織塊與pbs的質(zhì)量體積比為10-20g/l。

進(jìn)一步地，步驟4)中的水浴溫度為37℃，研磨轉(zhuǎn)速為2000r/min-3000r/min，研磨時(shí)間為1-3min；酶解消化時(shí)間為1小時(shí)-1.5小時(shí)。

進(jìn)一步地，步驟5)中用細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷的5ml離心管內(nèi)進(jìn)行離心處理，pbs洗3次，每次進(jìn)行低速離心處理，棄上清液除去細(xì)胞碎片，用細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液并用pbs定容為3ml，4℃保存待用，具體為：以300目細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷的5ml離心管內(nèi)，1000/min-1500r/min離心3min-5min，pbs洗3次，每次以500r/min-800r/min低速離心3min-5min，棄上清液除去細(xì)胞碎片，以400目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液并用pbs定容為3ml，4℃保存待用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明采用魚(yú)類(lèi)腎臟組織制備單細(xì)胞懸液，檢測(cè)比較酶解研磨法、研磨法、酶解法、剪切法分別制備單細(xì)胞懸液的差異，采用流式細(xì)胞儀對(duì)其細(xì)胞得率、細(xì)胞活力、凋亡細(xì)胞，壞死及死細(xì)胞比例進(jìn)行測(cè)定分析，從而建立了一種最佳的魚(yú)類(lèi)單細(xì)胞懸液制備方法。

2)魚(yú)類(lèi)單細(xì)胞懸液酶解研磨制備法，處理組織后已完全成為單細(xì)胞懸液狀態(tài)；顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞分散良好，雜質(zhì)及細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)塊極少；所得細(xì)胞能夠方便地用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在流式點(diǎn)圖中含有三群細(xì)胞群，同鏡檢結(jié)果一致。

3)魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的細(xì)胞得率從高到低變化趨勢(shì)依次為酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差異極顯著(p<0.01)；用酶解研磨法制備的細(xì)胞得率遠(yuǎn)高于其他制備方法。

4)魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的細(xì)胞活力從高到低依次為酶解研磨法>酶解法>研磨法>剪切法，用酶解研磨法制備單細(xì)胞懸液的細(xì)胞活力極顯著高于另外3種制備方法(p<0.01)。

5)魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的活細(xì)胞比例從高到低變化趨勢(shì)依次為酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差異極顯著(p<0.01)；用酶解研磨法制備單細(xì)胞懸液的活細(xì)胞比例遠(yuǎn)高于其他制備方法。

6)用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的壞死和損傷細(xì)胞比例極顯著低于酶解法、研磨法和剪切法(p<0.01)。

當(dāng)然，實(shí)施本申請(qǐng)的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說(shuō)明

此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本申請(qǐng)腎臟單細(xì)胞懸液流式檢測(cè)圖，其中，r1、r2，r3分別為小圓上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、大圓上皮細(xì)胞；

圖2是本申請(qǐng)腎臟單細(xì)胞懸液鏡檢圖，其中，e.紅細(xì)胞；lre.大圓上皮細(xì)胞；src.小圓上皮細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本申請(qǐng)的實(shí)施方式，藉此對(duì)本申請(qǐng)如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

本發(fā)明提供一種魚(yú)類(lèi)單細(xì)胞懸液的制備方法，包括以下步驟：

1)試劑配制

1.1)pbs試劑配制：0.01mol/lpbs(ph＝7.2)：準(zhǔn)確稱(chēng)量8.00gnacl，0.20gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4，溶解于800ml經(jīng)高壓滅菌的超純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.2，滅菌超純水定容到1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2)d-han氏液配制：nacl8.00g，kcl0.40g，na2hp04·h2o0.06g，kh2po40.06g，nahco30.35g，酚紅0.02g，溶于800m1高壓滅菌的雙蒸水，調(diào)節(jié)ph值至7.2-7.4，滅菌超純水定容為1000ml，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3)iv型膠原酶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量50mgiv型膠原酶(sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：c012900)，室溫25℃攪拌溶解于100mld-han氏液，4℃過(guò)夜，0.22um過(guò)濾除菌，配制成0.5g/liv型膠原酶液。

2)準(zhǔn)備試驗(yàn)魚(yú)的腎臟組織塊(工業(yè)或者食品下腳料)，放入提前置于冰浴中的平皿中，用pbs沖洗腎臟組織3次以上，將組織表面的血細(xì)胞沖洗干凈；

3)將腎臟組織塊放人冰浴中的平皿里，加入pbs，其中，腎臟組織塊與pbs的質(zhì)量體積比為10-20g/l，剪切成約為1mm³細(xì)小碎塊，移液槍小心吸走多余pbs，將組織塊放入scientz50高通量組織研磨器5ml離心管中；若腎臟組織塊與pbs的質(zhì)量體積比低于10g/l時(shí)會(huì)造成pbs浪費(fèi)，并且增加處理操作時(shí)間；高于20g/l則容易造成組織塊前處理剪切不充分，因此，選擇腎臟組織塊與pbs的質(zhì)量體積比為10-20g/l；

4)在離心管中加入2ml提前在37℃水浴加熱的iv型膠原酶，同時(shí)加入37℃水浴預(yù)熱的pbs定容至4ml，放入2顆氧化鋯球(每顆均重0.11±0.01g)進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為2000r/min-3000r/min，2min后打開(kāi)研磨器開(kāi)關(guān)將組織勻漿放入37℃恒溫水浴振蕩器中酶解消化1小時(shí)-1.5小時(shí)；

5)以300目細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷的5ml離心管內(nèi)，1000r/min-1500r/min離心3min-5min，pbs洗3次，每次以500r/min-800r/min低速離心3min-5min，棄上清液除去細(xì)胞碎片，以400目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液并用pbs定容為3ml，4℃保存待用。先以300目細(xì)胞篩過(guò)濾后以400目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液的原因是在有效濾掉細(xì)胞團(tuán)塊的同時(shí)盡可能的減小單細(xì)胞的損失，從而增加細(xì)胞得率。如在操作中發(fā)現(xiàn)步驟5)中兩次都使用400目細(xì)胞篩，細(xì)胞團(tuán)塊最少，但得率會(huì)大幅降低；兩次均使用300目細(xì)胞篩則仍會(huì)有極少量的細(xì)胞團(tuán)塊出現(xiàn)；此外以300目過(guò)濾后以400目過(guò)濾效果比先以400目過(guò)濾后以300目過(guò)濾效果好。

實(shí)施例1

鯽魚(yú)腎臟組織單細(xì)胞懸液制備法：

1)試劑配制

1.1)pbs試劑配制：0.01mol/lpbs(ph＝7.2)：準(zhǔn)確稱(chēng)量8.00gnacl，0.20gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4，溶解于800ml經(jīng)高壓滅菌的超純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.2，滅菌超純水定容到1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2)d-han氏液配制：nacl8.00g，kcl0.40g，na2hp04·h2o0.06g，kh2po40.06g，nahco30.35g，酚紅0.02g，溶于800m1高壓滅菌的雙蒸水，調(diào)節(jié)ph值至7.2-7.4，滅菌超純水定容為1000ml，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3)iv型膠原酶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量50mgiv型膠原酶(sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：c012900)，室溫25℃攪拌溶解于100mld-han氏液，4℃過(guò)夜，0.22um過(guò)濾除菌，配制成0.5g/liv型膠原酶液；

2)準(zhǔn)確稱(chēng)取0.10g試驗(yàn)魚(yú)的腎臟組織塊，放入提前置于冰浴中的平皿中，用pbs沖洗腎臟組織3次以上，將組織表面的血細(xì)胞沖洗干凈；

3)將組織塊放人冰浴中的平皿里，加入10mlpbs，剪切成約為1mm3細(xì)小碎塊，移液槍小心吸走多余pbs，將組織塊放入scientz50高通量組織研磨器5ml離心管中；

4)在離心管中加入2ml提前在37℃水浴加熱的iv型膠原酶，同時(shí)加入37℃水浴預(yù)熱的pbs定容至4ml，放入2顆氧化鋯球進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為2000r/min，2min后打開(kāi)研磨器開(kāi)關(guān)將組織勻漿放入37℃恒溫水浴振蕩器中酶解消化1小時(shí)；

5)以300目細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷的5ml離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，pbs洗3次，每次以500r/min低速離心3min，棄上清液除去細(xì)胞碎片，以400目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液并用pbs定容為3ml，4℃保存待用。

采用本發(fā)明方法所得細(xì)胞能夠方便地用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，如圖1所示，在流式點(diǎn)圖中含有三群細(xì)胞群r1、r2，r3，根據(jù)細(xì)胞大小及顆粒度分別對(duì)應(yīng)圖2中的小圓上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、大圓上皮細(xì)胞；因此，同鏡檢結(jié)果一致。

對(duì)照試驗(yàn)采用剪切法、研磨法和組織酶解法，其中，剪切法、研磨法和組織酶解法的具體操作步驟如下：

剪切法是通過(guò)手術(shù)剪刀等器具將組織逐漸剪切為勻漿狀，是組織機(jī)械法處理中較常用的一種方法。將活體組織塊放人冰浴中的平皿里，加入10mlpbs，剪切成約為1mm³細(xì)小碎塊后用200目細(xì)胞篩過(guò)濾，pbs清洗以沖掉組織內(nèi)血細(xì)胞。將組織塊轉(zhuǎn)入平皿中，加入10mlpbs將組織塊用眼科剪繼續(xù)剪至勻漿狀。先以300目細(xì)胞篩過(guò)濾到在預(yù)冷處理過(guò)的10ml離心管中，1000r/min離心沉淀5min，棄上清后加2ml預(yù)冷的pbs重懸并轉(zhuǎn)移到5ml離心管，pbs洗3次，每次以500r/min低速離心3min，棄上清除去細(xì)胞碎片。用400目細(xì)胞篩過(guò)濾并定容為3ml，4℃保存待用。

研磨法即利用普通研磨器對(duì)組織進(jìn)行研磨處理，是機(jī)械法處理組織的另一種較為常用的方法。腎臟組織塊前處理同剪切法，后將處理后的組織塊轉(zhuǎn)入預(yù)冷處理過(guò)的5ml高通量組織研磨器離心管中，放入兩顆氧化鋯球。加入pbs定容到4ml，轉(zhuǎn)速為2000r/min，2min后打開(kāi)研磨器開(kāi)關(guān)將組織勻漿，以300目細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷過(guò)的的5ml離心管中。1000r/min離心5min棄上清，pbs洗3次每次以500r/min3min低速離心，棄上清除去細(xì)胞碎片，以400目細(xì)胞篩過(guò)濾并用預(yù)冷pbs定容為3ml，4℃保存待用(bing,ke-wuh,jia-jial.preparationofsinglecellsuspensionfromrabbitmusclevx2tumorwithscissorsversushomogenatemethod[j].chinesejournaloftissueengineerin2007；11(41):8315-8317.)。

組織酶解法即利用酶的特異性酶解作用而對(duì)組織進(jìn)行處理的一種方法。腎臟組織塊前處理同剪切法，后轉(zhuǎn)入5ml離心管中，加入2mlpbs和2mliv型膠原酶(終濃度0.25mg/ml)在37℃水浴1h，期間不斷震蕩充分消化，確保組織被消化成單細(xì)胞。先以300目細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷處理的5ml離心管內(nèi)；1000r/min離心5min，pbs洗3次，每次以500r/min3min低速離心，棄上清除去細(xì)胞碎片；以400目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液計(jì)并用pbs定容為3ml，4℃保存待用(陳朱波，曹雪濤.流式細(xì)胞術(shù)：原理、操作及應(yīng)用(第二版)[m].北京：科學(xué)出版社，2014.1，54-55)。

用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的細(xì)胞得率最高為(27.99±0.19)×10⁷/g，活細(xì)胞比例最高為91.67±0.81，細(xì)胞得率和活細(xì)胞比例從高到低變化趨勢(shì)一致依次為酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差異極顯著(p<0.01)；用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的細(xì)胞活力最高為92.33±1.80，極顯著高于另外三種方法(p<0.01)；用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的壞死和損傷細(xì)胞比例最低為8.20±0.75，極顯著低于酶解法、研磨法和剪切法(p<0.01)(見(jiàn)表1)。

表1鯽魚(yú)腎臟組織單細(xì)胞懸液制備效果比較表

n＝3；means±sd

注：表格中所給數(shù)據(jù)為平均數(shù)及3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差；同列肩標(biāo)有相同大寫(xiě)字母或無(wú)字母表示差異不極顯著(p>0.01)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(p<0.01)，同列肩標(biāo)有相同小寫(xiě)字母或無(wú)字母表示差異不顯著(p>0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(p<0.05)，下表同。

實(shí)施例2

臺(tái)灣泥鰍腎臟組織單細(xì)胞懸液制備法：

1)試劑配制

1.1)pbs試劑配制：0.01mol/lpbs(ph＝7.2)：準(zhǔn)確稱(chēng)量8.00gnacl，0.20gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4，溶解于800ml經(jīng)高壓滅菌的超純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.2，滅菌超純水定容到1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2)d-han氏液配制：nacl8.00g，kcl0.40g，na2hp04·h2o0.06g，kh2po40.06g，nahco30.35g，酚紅0.02g，溶于800m1高壓滅菌的雙蒸水，調(diào)節(jié)ph值至7.2，滅菌超純水定容為1000ml，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3)iv型膠原酶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量50mgiv型膠原酶(sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：c012900)，室溫25℃攪拌溶解于100mld-han氏液，4℃過(guò)夜，0.22um過(guò)濾除菌，配制成0.5g/liv型膠原酶液。

2)準(zhǔn)備臺(tái)灣泥鰍的腎臟組織塊(工業(yè)或者食品下腳料)，放入提前置于冰浴中的平皿中，用pbs沖洗腎臟組織3次以上，將組織表面的血細(xì)胞沖洗干凈；

3)將腎臟組織塊放人冰浴中的平皿里，加入pbs，其中，腎臟組織塊與pbs的質(zhì)量體積比為10g/l，剪切成約為1mm³細(xì)小碎塊，移液槍小心吸走多余pbs，將組織塊放入scientz50高通量組織研磨器5ml離心管中；

4)在離心管中加入2ml提前在37℃水浴加熱的iv型膠原酶，同時(shí)加入37℃水浴預(yù)熱的pbs定容至4ml，放入2顆氧化鋯球進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為3000r/min，2min后打開(kāi)研磨器開(kāi)關(guān)將組織勻漿放入37℃恒溫水浴振蕩器中酶解消化1.5小時(shí)；

5)以300目細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷的5ml離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，pbs洗3次，每次以500r/min低速離心5min，棄上清液除去細(xì)胞碎片，以400目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液并用pbs定容為3ml，4℃保存待用。

對(duì)照試驗(yàn)采用剪切法、研磨法和組織酶解法，其中，剪切法、研磨法和組織酶解法的具體操作步驟同實(shí)施例1。

用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的細(xì)胞得率最高為(25.31±1.35)×10⁷/g，活細(xì)胞比例最高為92.73±0.35，細(xì)胞得率和活細(xì)胞比例從高到低變化趨勢(shì)一致依次為酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差異極顯著(p<0.01)；用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的細(xì)胞活力最高為92.83±0.45，極顯著高于另外三種方法(p<0.01)；用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的壞死和損傷細(xì)胞比例最低為7.13±0.35，極顯著低于酶解法、研磨法和剪切法(p<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2臺(tái)灣泥鰍腎臟組織單細(xì)胞懸液制備效果比較表

n＝3；means±sd

實(shí)施例3

瓦氏黃顙魚(yú)腎臟組織單細(xì)胞懸液制備法：

1)試劑配制

1.1)pbs試劑配制：0.01mol/lpbs(ph＝7.2)：準(zhǔn)確稱(chēng)量8.00gnacl，0.20gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4，溶解于800ml經(jīng)高壓滅菌的超純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.2，滅菌超純水定容到1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2)d-han氏液配制：nacl8.00g，kcl0.40g，na2hp04·h2o0.06g，kh2po40.06g，nahco30.35g，酚紅0.02g，溶于800m1高壓滅菌的雙蒸水，調(diào)節(jié)ph值至7.4，滅菌超純水定容為1000ml，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3)iv型膠原酶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量50mgiv型膠原酶(sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：c012900)，室溫25℃攪拌溶解于100mld-han氏液，4℃過(guò)夜，0.22um過(guò)濾除菌，配制成0.5g/liv型膠原酶液。

2)準(zhǔn)備瓦氏黃顙魚(yú)的腎臟組織塊，放入提前置于冰浴中的平皿中，用pbs沖洗腎臟組織3次以上，將組織表面的血細(xì)胞沖洗干凈；

3)將腎臟組織塊放人冰浴中的平皿里，加入pbs，其中，腎臟組織塊與pbs的質(zhì)量體積比為20g/l，剪切成約為1mm³細(xì)小碎塊，移液槍小心吸走多余pbs，將組織塊放入scientz50高通量組織研磨器5ml離心管中；

4)在離心管中加入2ml提前在37℃水浴加熱的iv型膠原酶，同時(shí)加入37℃水浴預(yù)熱的pbs定容至4ml，放入2顆氧化鋯球進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為2000r/min，2min后打開(kāi)研磨器開(kāi)關(guān)將組織勻漿放入37℃恒溫水浴振蕩器中酶解消化1.2小時(shí)；

5)以300目細(xì)胞篩過(guò)濾到預(yù)冷的5ml離心管內(nèi)，1500r/min離心3min，pbs洗3次，每次以800r/min低速離心3min，棄上清液除去細(xì)胞碎片，以400目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液并用pbs定容為3ml，4℃保存待用。

對(duì)照試驗(yàn)采用剪切法、研磨法和組織酶解法，其中，剪切法、研磨法和組織酶解法的具體操作步驟同實(shí)施例1。

用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的細(xì)胞得率最高為(33.85±0.50)×10⁷/g，活細(xì)胞比例最高為90.60±0.50，細(xì)胞得率和活細(xì)胞比例從高到低變化趨勢(shì)一致依次為酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差異極顯著(p<0.01)；用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的細(xì)胞活力最高為89.47±1.10，極顯著高于另外三種方法(p<0.01)；用酶解研磨法制備的魚(yú)類(lèi)腎臟單細(xì)胞懸液的壞死和損傷細(xì)胞比例最低為9.23±0.45，極顯著低于酶解法、研磨法和剪切法(p<0.01)(見(jiàn)表3)。

表3瓦氏黃顙魚(yú)腎臟組織單細(xì)胞懸液制備效果比較表

n＝3；means±sd

如在說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來(lái)指稱(chēng)特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會(huì)用不同名詞來(lái)稱(chēng)呼同一個(gè)成分。本說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求并不以名稱(chēng)的差異來(lái)作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”為一開(kāi)放式用語(yǔ)，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”?！按笾隆笔侵冈诳山邮盏恼`差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問(wèn)題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說(shuō)明書(shū)后續(xù)描述為實(shí)施本申請(qǐng)的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說(shuō)明本申請(qǐng)的一般原則為目的，并非用以限定本申請(qǐng)的范圍。本申請(qǐng)的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。

還需要說(shuō)明的是，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒(méi)有更多限制的情況下，由語(yǔ)句“包括一個(gè)……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還存在另外的相同要素。

上述說(shuō)明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。