一種溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法，其步驟為：將溪蟹組織切成碎片，放入5-10℃、pH7.0-7.5的PBS溶液中，加入胰蛋白酶，進(jìn)行酶解，用100-200目細(xì)胞篩過濾，酶液在8-12℃、800-1000rpm離心1-2分鐘，去上清后，沉淀用PBS洗滌兩次，即可。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，它能將溪蟹的組織細(xì)胞完全分離得到單細(xì)胞懸液，并且成活率達(dá)到95%以上。利用本方法分離得到的單細(xì)胞可以直接進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)及單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
【專利說明】一種溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物單細(xì)胞懸液的制備，具體是一種溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物細(xì)胞與完整動(dòng)物組織和個(gè)體一樣具有相同的生理反應(yīng)能力，能感受各種激素、代謝物、環(huán)境信號(hào)和病原體誘導(dǎo)子等刺激，并對(duì)各種刺激做出相應(yīng)生理反應(yīng)。結(jié)合現(xiàn)代的遺傳學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法，將外援基因?qū)爰?xì)胞，通過短時(shí)間外援基因表達(dá)確定基因的功能，進(jìn)一步闡述動(dòng)物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。利用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系為基因表達(dá)的調(diào)控提供了一種方便而有效的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)在于體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞是一個(gè)相對(duì)比較均一的單細(xì)胞群體，導(dǎo)入外源基因后的表達(dá)有較好的同步性；其次不需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的組織培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞及表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于研究，如激素以及干旱、重金屬、紫外等多種生物和非生物脅迫對(duì)細(xì)胞損傷、基因表達(dá)、蛋白的定位和功能的影響。在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，熒光素或熒光蛋白基因常被用作一個(gè)報(bào)告基因，通過熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析，可以原位跟蹤各種分子、特定基因在逆境和發(fā)育過程時(shí)空上的特意表達(dá)，定量分析目的基因的表達(dá)水平，顯示其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和量的變化，為探討該基因在細(xì)胞中的作用及分子機(jī)制提供便利條件。目前對(duì)動(dòng)物單細(xì)胞分離和培養(yǎng)多集中在人類的細(xì)胞株和細(xì)胞系的培養(yǎng)，這些細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)的建立，為臨床研究各種生理機(jī)制提供良好模型，為研究提供了一定的途徑。但有關(guān)較低等的無脊椎動(dòng)物，相關(guān)的細(xì)胞分離技術(shù)和培養(yǎng)還未有發(fā)現(xiàn)。河南華溪蟹屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、軟甲亞綱、囊甲總目、十足目、爬行亞目、短尾部、溪蟹總科、溪蟹科、華溪蟹屬，常年生活在水體基底層，直接面對(duì)水體污染。大量水體污染物可以通過呼吸、消化和皮膚滲透等作用進(jìn)入體內(nèi)影響溪蟹的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。目前，以溪蟹為材料進(jìn)行相關(guān)的毒理研究也取得了一定的進(jìn)展，但研究多集中于組織水平，而細(xì)胞水平的研究都因無法得到大量的、成活率高的單細(xì)胞懸液而成為進(jìn)一步科學(xué)研究的瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是建立一種簡(jiǎn)便，易行，分離效果好、成活率高的溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法，從而為無脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞水平的研究提供可能的技術(shù)條件。
[0004]本發(fā)明提供的一種溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法，其原理為動(dòng)物細(xì)胞間主要通過果膠質(zhì)連接，利用胰蛋白酶的水解作用，首先將組織剪成0.5mm2的切片，使胰蛋白酶液進(jìn)入到組織間隙中進(jìn)行溶解細(xì)胞間的連接，最終將細(xì)胞分離。
[0005]本發(fā)明提供的一種溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法，包括如下步驟:
[0006]剖取溪蟹組織，在不破壞細(xì)胞完整性的情況下，將組織切成0.5-lmm2的碎片，放入5-10。。、pH 7.0-7.5的PBS溶液中，加入胰蛋白酶至濃度為2.0-3.0%，酶液在8-12。。(酶解溫度優(yōu)選10°C)下10-20.轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上酶解5-15分鐘，用100-200目細(xì)胞篩過濾，800-1000rpm離心1_2分鐘，去上清后，沉淀用PBS洗滌兩次，即可得到溪蟹單細(xì)胞懸液。[0007]利用上述方法得到的溪蟹單細(xì)胞懸液可進(jìn)行細(xì)胞的體外培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和細(xì)胞水平的分析研究。如:利用單細(xì)胞凝膠電泳進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等儀器并結(jié)合熒光素及熒光蛋白等對(duì)生物大分子進(jìn)行亞細(xì)胞定位、定量及功能分析實(shí)驗(yàn)。
[0008]與現(xiàn)有分離方法相比，已有的單細(xì)胞分離方法多只對(duì)于哺乳動(dòng)物或植物，對(duì)于無脊椎動(dòng)物溪蟹，尤其是鰓、肝胰腺等組織的單細(xì)胞分離技術(shù)還沒有報(bào)道。本方法能非常好的將不同組織分離成單細(xì)胞，分離效果良好；而且單細(xì)胞的成活率可達(dá)到95%以上。利用本發(fā)明所得到的單細(xì)胞懸液再結(jié)合螢光素F1UO-3AM可用于對(duì)細(xì)胞中Ca2+濃度的變化進(jìn)行檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1:河南華溪蟹鰓單細(xì)胞顯微鏡觀察圖(放大倍數(shù)100 X )
[0010]圖2 =CdCl2處理前后溪蟹鰓單細(xì)胞中鈣離子濃度變化圖。其中:
[0011]A1、A2分別為CdCl2處理前和處理30分鐘后熒光顯微鏡下溪蟹鰓單細(xì)胞細(xì)胞中鈣離子的濃度變化圖。
[0012]BUB2分別為CdCl2處理前和處理30分鐘后激光共聚焦顯微鏡下溪蟹鰓單細(xì)胞細(xì)胞中鈣離子的濃度變化圖。
[0013]圖3:河南華溪蟹肝胰腺單細(xì)胞顯微鏡觀察圖(放大倍數(shù)400X )。其中:·[0014]B為分泌細(xì)胞；E為胚細(xì)胞；F為吸收細(xì)胞；R為儲(chǔ)藏細(xì)胞；LD為脂肪滴。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下給出本發(fā)明的實(shí)施例。
[0016]實(shí)施例1
[0017]取成年溪蟹一只，用鋒利剪刀將溪蟹頭胸甲剪開，露出位于鰓腔兩側(cè)的鰓絲，用鑷子從鰓絲基部取鰓絲，沿著鰓軸的垂直和平行的方向?qū)Ⅵw片切成0.5mm2的碎片，放入10°C、pH 7.2的PBS溶液中，加入胰蛋白酶至終濃度為2.5%，在10°C下10轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上酶解10分鐘，用200目細(xì)胞篩過濾，IOOOrpm離心酶液2分鐘，去上清后，沉淀用PBS洗滌兩次，即可得到溪蟹鰓單細(xì)胞懸液。用臺(tái)盼藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察，無色細(xì)胞為活細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞為死細(xì)胞。如圖1所示，死細(xì)胞個(gè)數(shù)為O,活細(xì)胞個(gè)數(shù)為35,成活率=活細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)=100%。
[0018]實(shí)施例2
[0019]取實(shí)施例1制備的新鮮單細(xì)胞懸液，加入能與Ca2+特異結(jié)合的熒光素Fluo-3AM孵育30分鐘，用PBS洗滌2次，將細(xì)胞濃度調(diào)整后用2.9mg/LCdCl2處理細(xì)胞，30分鐘用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察(見圖2)。細(xì)胞中Ca2+濃度低，F(xiàn)luo-3與Ca2+不結(jié)合，熒光顯微鏡下細(xì)胞沒有綠色熒光；Ca2+濃度升高，F(xiàn)luo-3與Ca2+結(jié)合，熒光顯微鏡下細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，綠色熒光越強(qiáng)，Ca2+越高。Al是CdCl2未處理細(xì)胞，細(xì)胞Ca2+低，細(xì)胞沒有熒光；A2是CdCl2處理30分鐘后，細(xì)胞中Ca2+濃度升高，細(xì)胞綠色熒光明顯增強(qiáng)。BI是CdCl2未處理細(xì)胞，細(xì)胞Ca2+低，激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞沒有熒光；B2是CdCl2處理30分鐘后，細(xì)胞中Ca2+濃度升高，激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞綠色熒光明顯增強(qiáng)。
[0020]實(shí)施例3[0021 ] 取成年溪蟹一只，用鋒利剪刀將溪蟹頭胸甲剪開，用鑷子取肝胰腺，將腺管橫切成
0.長(zhǎng)度的碎片，放入10°C、pH 7.2的PBS溶液中，加入胰蛋白酶至終濃度為2.0%，
在10°C下10轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上酶解5分鐘，用100目細(xì)胞篩過濾，IOOOrpm離心酶液1.5分鐘，去上清后，沉淀用PBS洗滌兩次，即可得到溪蟹肝胰腺單細(xì)胞懸液。用臺(tái)盼藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察，無色細(xì)胞為活細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞為死細(xì)胞。如圖3所示，死細(xì)胞個(gè)數(shù)為0，活細(xì)胞個(gè)數(shù)為47,成活率=活細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)=100`%。
【權(quán)利要求】
1.一種溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:剖取溪蟹組織，在不破壞細(xì)胞完整性的情況下，將組織切成0.5-lmm2的碎片，放入5_10°C、pH 7.0-7.5的PBS溶液中，加入胰蛋白酶至終濃度為2.0-3.0%，酶液在8-12°C下10-20轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上酶解5-15分鐘，用100-200目細(xì)胞篩過濾，800-1000rpm離心1_2分鐘，去上清后，沉淀用PBS洗滌兩次，即可得到溪蟹單細(xì)胞懸液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種溪蟹單細(xì)胞懸液的制備方法，其特征在于，所述的酶液的酶解溫度為10 °C。
【文檔編號(hào)】C12N5/07GK103436487SQ201310406493
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】王金香, 王蘭, 劉娜, 落繼先, 王茜, 井維鑫 申請(qǐng)人:山西大學(xué)