細(xì)胞懸液及其用圖
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年3月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/614, 112號(hào)和2012年 3月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/614, 115號(hào)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，其通過(guò)引用全文納入本 文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)單、快速且節(jié)約成本的制備細(xì)胞懸液的方法，尤其是包含活的 上皮細(xì)胞（如未分化的/祖細(xì)胞和/或分化的細(xì)胞）的懸液。這類(lèi)懸液可用于處理需要上 皮相關(guān)過(guò)程的患者。還提供了用于這類(lèi)制備的裝置和懸液的應(yīng)用。
[0004] 背景
[0005] 人類(lèi)組織再生非常有限且構(gòu)成損傷器官功能修復(fù)的主要難題。傷口處理是需要組 織再生的典型區(qū)域。哺乳動(dòng)物組織中的傷口（撕裂或開(kāi)口）可導(dǎo)致創(chuàng)面處組織破壞和微血 管凝結(jié)。這類(lèi)組織的修復(fù)代表了針對(duì)損傷有序、受控的細(xì)胞響應(yīng)。無(wú)論大小如何，所有軟組 織傷口都以類(lèi)似的方式愈合。組織生長(zhǎng)和修復(fù)的機(jī)制是生物系統(tǒng)，其中在氧梯度存在時(shí)出 現(xiàn)細(xì)胞增殖和血管生成。組織修復(fù)期間發(fā)生的連續(xù)形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變已得到非常詳細(xì)的表 征并在一些情況下對(duì)其進(jìn)行了定量。參見(jiàn)Hunt, T. K.，等，"Coagulation and macrophage stimulation of angiogenesis and wound healing(血管生成和傷口愈合的凝結(jié)和巨細(xì) 胞刺激）"，The surgical wound(《外科傷口》），第 1-18 頁(yè)，F(xiàn).Dineen 和 G.Hildrick-Smith 編（Lea&Febiger 公司，費(fèi)城，1981)。
[0006] 多個(gè)器官（如皮膚和心臟）中的組織再生依賴(lài)結(jié)締組織恢復(fù)血液供應(yīng)并使殘余的 器官特異性細(xì)胞（如角質(zhì)形成細(xì)胞或肌肉細(xì)胞）重新建立器官完整性。因此，間充質(zhì)細(xì)胞 (例如血管的成纖維細(xì)胞或者另外的內(nèi)皮細(xì)胞）的相關(guān)功能是分泌促進(jìn)愈合過(guò)程的因子， 例如促進(jìn)新的血管形成（血管形成）的因子或者促進(jìn)上皮重新形成的因子（通過(guò)增殖和迀 移角質(zhì)形成細(xì)胞）。
[0007] 傷口的細(xì)胞形態(tài)由三個(gè)不同的區(qū)域組成。中央無(wú)血管傷口空間是缺氧、酸中毒且 高度肥大的（hypercarbic)，并且具有高乳酸鹽水平。鄰近傷口空間的是局部缺血的梯度 區(qū)域，其通過(guò)分割成纖維細(xì)胞而居于其中。前導(dǎo)區(qū)域后是以成熟的成纖維細(xì)胞和許多新形 成的毛細(xì)血管（即新血管形成）為特征的活性膠原合成區(qū)域。雖然新的血管生長(zhǎng)（血管形 成）對(duì)于傷口組織的愈合是必需的，但血管新生劑通常無(wú)法滿足提供組織修復(fù)的其他生物 合成作用的長(zhǎng)期需要。除急性傷口（例如燒傷或外傷導(dǎo)致的撕裂）外，人工產(chǎn)生的傷口（例 如移植固體位點(diǎn)、美容適應(yīng)癥（aesthetic indication)、整形過(guò)程或真皮處理）、慢性傷口 (例如靜脈或糖尿病性潰瘍）和其他適應(yīng)癥（如疤痕重塑、無(wú)毛皮膚損失損傷、色素沉著問(wèn) 題、白斑病、白癜風(fēng)和美容年輕化過(guò)程）也需要快速且有效的處理。盡管存在對(duì)傷口（例如 嚴(yán)重?zé)齻⑼饪魄锌?、撕裂和其他外傷）更快速愈合的需要，但迄今為止在使用藥劑加速?口愈合方面僅取得了有限的成功。
[0008] 傷口常規(guī)處理的主要目的是實(shí)現(xiàn)傷口閉合。開(kāi)放的皮膚傷口代表一種重要的傷口 類(lèi)型。該類(lèi)型包括急性外科和外傷性傷口，例如慢性潰瘍、燒傷傷口以及慢性傷口（如神經(jīng) 性潰瘍、壓瘡、動(dòng)脈和靜脈（靜態(tài)）或混合的動(dòng)脈-靜脈潰瘍和糖尿病性潰瘍）。開(kāi)放的皮膚 傷口通常通過(guò)包含六個(gè)主要要素的過(guò)程愈合：i)炎癥、ii)成纖維細(xì)胞增殖、血管增殖、iv) 結(jié)締組織合成、V)上皮形成和Vi)傷口收縮。當(dāng)這些要素單獨(dú)或作為整體無(wú)法正確發(fā)揮功 能時(shí)，傷口愈合受損。許多要素可以影響傷口愈合，包括營(yíng)養(yǎng)不良、感染、藥劑（例如細(xì)胞毒 性藥物和皮質(zhì)類(lèi)固醇）、糖尿病和年齡過(guò)大。參見(jiàn)Hunt等，Current Surgical Diagnosis & Treatment (《新編外科診斷和治療》）（Way ;Appleton 和 Lange)，第 86-98 頁(yè)（1988)。
[0009] 不能容易愈合的皮膚傷口會(huì)導(dǎo)致對(duì)象出現(xiàn)顯著的物理、情緒和社交苦惱以及大量 的財(cái)務(wù)花費(fèi)。參見(jiàn)例如 Richey 等，Annals of Plastic Surgery 23 (2): 159-65 (1989)。事實(shí) 上，無(wú)法正確愈合的傷口最后可能需要積極的外科處理，如自體皮膚移植（移植多片皮膚） 或培養(yǎng)的真皮移植。例如，培養(yǎng)的表皮自體移植（CEA)方法從患者身上取下皮膚細(xì)胞以在 實(shí)驗(yàn)室中生長(zhǎng)為片狀的新皮膚細(xì)胞。新的片狀皮膚被用作移植體。然而，這些移植的轉(zhuǎn)換率 并不令人滿意。參見(jiàn)例如Sood等，Journal of Burn Care Research 31(4) :559_68(2010)〇 較新的移植方法將CEA與基質(zhì)組合以獲得更多的支撐。例如，當(dāng)前可用的經(jīng)培養(yǎng)或工 程改造的真皮是具有不同基質(zhì)、基質(zhì)中整合有成纖維細(xì)胞的產(chǎn)品，如TransCyte?和 Dermagraft?。然而，這些產(chǎn)品在誘導(dǎo)大傷口的上皮形成中并不有效。經(jīng)培養(yǎng)/工程改造 的皮膚整合的表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是市售可得的，商品名稱(chēng)是Apligraf? (諾華制藥公 司（NOVARTIS Pharma))和VivoDerm? (百時(shí)美施貴寶公司（Bristol-Myers Squibb))。 然而，存在關(guān)于培養(yǎng)的表皮層和真皮層之間親和性以及所得臨床效果不足的問(wèn)題。
[0010] 存在對(duì)改進(jìn)的傷口愈合（和更廣泛的組織再生）技術(shù)的需要。本發(fā)明提供了一種 適用于在多個(gè)受體位點(diǎn)應(yīng)用的自體細(xì)胞懸液，其使用與傷口的類(lèi)型或組織或患者群體的本 質(zhì)無(wú)關(guān)。還提供了制備和/或使用所述懸液的方法以及用于制備的裝置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明涉及一種獨(dú)特的細(xì)胞懸液及其制備方法，可以迅速、有效且簡(jiǎn)單地制備并 應(yīng)用。還涉及一種使用所述獨(dú)特的細(xì)胞懸液處理需要上皮相關(guān)過(guò)程的患者的方法，該方法 不僅促進(jìn)了傷口愈合/閉合，還促進(jìn)了組織再生。本發(fā)明可應(yīng)用于任何上皮相關(guān)過(guò)程以促 進(jìn)組織再生，包括皮膚上皮（例如無(wú)毛上皮）、呼吸上皮、血管上皮、腺上皮、角膜上皮等。還 提供了適用于制備和/或處理方法的設(shè)備。所描述裝置的使用有助于實(shí)施本發(fā)明的方法， 并被發(fā)現(xiàn)可顯著減少替代性過(guò)程中所用時(shí)間和與常規(guī)移植技術(shù)的使用相關(guān)的復(fù)雜性。此 外，本發(fā)明的細(xì)胞懸液提供了活的功能性細(xì)胞，其可在患者體內(nèi)或體上、或者在受體位點(diǎn)上 的基質(zhì)或支架或基底中體外或原位大面積存在。否則，臨床醫(yī)師將受到限制或無(wú)法取得這 類(lèi)自體上皮細(xì)胞。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于上皮相關(guān)過(guò)程的細(xì)胞懸液。所述細(xì) 胞懸液包括細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包括來(lái)源于上皮組織樣品的活細(xì)胞。所述活細(xì)胞可處于多 個(gè)分化階段并且可以是功能性的（例如，發(fā)揮其預(yù)編程功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生某些蛋白， 分泌某些因子，迀移或增殖）。所述細(xì)胞可包括成熟/分化的細(xì)胞以及能夠分裂或分化的細(xì) 胞。所述活細(xì)胞也可以是處于迀移和增殖狀態(tài)。在上皮相關(guān)過(guò)程中使用前，所述細(xì)胞群處 于選自應(yīng)激和外源試劑的狀態(tài)下。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群可表現(xiàn)出應(yīng)激誘導(dǎo)的特 征。在一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)激誘導(dǎo)的特征可導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)愈合過(guò)程介導(dǎo)的蛋白。在某 些實(shí)施方式中，可向所述細(xì)胞群提供外源試劑或組分（如熱激蛋白、透明質(zhì)酸、富血小板血 漿、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和/或脂肪干細(xì)胞）。在所述上皮相關(guān)過(guò)程中使用并在體內(nèi)應(yīng)用于 患者的受體位點(diǎn)時(shí)，具有或不具有外源供應(yīng)性試劑的所述細(xì)胞群可促進(jìn)上皮組織的處理、 愈合、重建、表面重修、色素再生和/或再生。還可將所述細(xì)胞群接種至基質(zhì)或支架或基底 (體外或原位），其中細(xì)胞能夠例如生長(zhǎng)以形成人工組織或器官。
[0013] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種上皮相關(guān)過(guò)程中使用的組合物。所述組合物包 括細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包括來(lái)源于上皮組織樣品的活細(xì)胞。所述活細(xì)胞可以處于多個(gè)分化 階段并包括具有功能的成熟/分化的細(xì)胞以及能夠分裂或分化的細(xì)胞。所述細(xì)胞也可以是 處于迀移和增殖狀態(tài)。在上皮相關(guān)過(guò)程中使用前，所述細(xì)胞群處于選自應(yīng)激和外源試劑的 條件下。所述組合物可包括例如由細(xì)胞在應(yīng)激下表達(dá)的熱激蛋白或者分離或重組的熱激蛋 白或其片段。所述熱激蛋白可以是以有效量促進(jìn)所需患者的皮膚愈合。在一些實(shí)施方式 中，所述組合物還可包括外源或外部供應(yīng)的試劑或組分，如透明質(zhì)酸、富血小板血漿、生長(zhǎng) 因子、細(xì)胞因子和/或脂肪干細(xì)胞。在上皮相關(guān)過(guò)程中使用并在體內(nèi)應(yīng)用于患者的受體位 點(diǎn)時(shí)，所述組合物可促進(jìn)上皮組織的處理、愈合、重建、表面重修、色素再沉著和/或再生。 所述組合物還可在體外或原位應(yīng)用于基質(zhì)或支架或基底，其中所述細(xì)胞能夠生長(zhǎng)（例如體 外培養(yǎng)或原位繁殖）以形成例如人工組織或器官。
[0014] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在上皮相關(guān)過(guò)程中制備和使用細(xì)胞的方法。所 述方法包括：提供包括來(lái)源于上皮組織樣品的活且有功能細(xì)胞的細(xì)胞群；并使所述細(xì)胞群 處于選自應(yīng)激和外源試劑的條件下。所述活細(xì)胞可以處于多個(gè)分化階段并包括具有功能的 成熟/分化的細(xì)胞以及能夠分裂或分化的細(xì)胞。所述細(xì)胞也可以是處于迀移和增殖狀態(tài)。 在一些實(shí)施方式中，所述方法包括誘導(dǎo)所述細(xì)胞群表達(dá)熱激蛋白，從而獲得上皮相關(guān)過(guò)程 中使用的細(xì)胞，所述細(xì)胞中所述熱激蛋白的水平高于沒(méi)有所述應(yīng)激條件下時(shí)所述熱激蛋白 的對(duì)照水平。在一些實(shí)施方式中，所述外源試劑可以是透明質(zhì)酸、富血小板血漿、生長(zhǎng)因子、 細(xì)胞因子和/或脂肪干細(xì)胞中的一種或多種。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種在上皮相關(guān)過(guò)程中制備和使用細(xì)胞的方法。所述方 法包括：在所需患者的受體位點(diǎn)上應(yīng)用包含來(lái)源于上皮組織樣品的活細(xì)胞的細(xì)胞群；并向 所述細(xì)胞群提供選自應(yīng)激和外源試劑的條件以促進(jìn)所述患者中的上皮處理、愈合、重建、表 面重修、色素再沉著和/或再生。在一些實(shí)施方式中，所述條件是能夠誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)熱激蛋 白或者外源性提供的分離或重組的熱激蛋白或其片段的有效量的應(yīng)激，從而促進(jìn)所述患者 中的上皮處理、愈合、重建、表面重修、色素再沉著和/或再生。在一些實(shí)施方式中，可向所 述患者的受體位點(diǎn)單獨(dú)或者與所述細(xì)胞群聯(lián)合提供外源性熱激蛋白。在某些實(shí)施方式中， 所述外源試劑可以是透明質(zhì)酸、富血小板血漿、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和/或脂肪干細(xì)胞中的 一種或多種。
[0016] 在某些實(shí)施方式中，當(dāng)所述上皮組織樣品是皮膚組織樣品時(shí)，所述活細(xì)胞可來(lái)源 于所述皮膚組織樣品的真皮層、表皮層或者真皮和表皮層，且所述細(xì)胞群可包括角質(zhì)形成 細(xì)胞、黑素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞或前述細(xì)胞的任意組合。在一些實(shí)施方式中，所 述細(xì)胞群可包括皮膚干細(xì)胞和/或其他皮膚細(xì)胞。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)激誘導(dǎo)的特征是選自Hsp90和Hsp90a的蛋白表達(dá)水 平升高。所述應(yīng)激誘導(dǎo)的特征可以與缺氧、熱、機(jī)械外傷、營(yíng)養(yǎng)缺乏、酶暴露或其他應(yīng)激誘導(dǎo) 的操作相關(guān)。
[0018] 在某些實(shí)施方式中，當(dāng)所述上皮組織樣品是皮膚組織樣品時(shí)，所述上皮相關(guān)過(guò)程 包括皮膚傷口處理、皮膚組織移植、皮膚美容過(guò)程或真皮處理。所述皮膚傷口可以是急性傷 口、人工產(chǎn)生的傷口或慢性傷口。所述上皮組織樣品也可獲自呼吸上皮、血管上皮、角膜上 皮或腺上皮，且其來(lái)源的細(xì)胞可用于處理相應(yīng)的上皮病癥。
[0019] 從參考以下示意圖進(jìn)行的后續(xù)描述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地了解本發(fā)明的 其他方面和優(yōu)勢(shì)。
[0020] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0021] 圖1顯示了皮膚組織的典型結(jié)構(gòu)和組成。
[0022] 圖2A顯示了開(kāi)蓋并在適當(dāng)位置有第二部件的示例性設(shè)備的透視圖。
[0023] 圖2B顯示了開(kāi)蓋且第二部件被移開(kāi)并倒置的示例性設(shè)備的透視圖。
[0024] 圖3A顯示了示例性設(shè)備的第一元件的透視圖。
[0025] 圖3B顯示了示例性設(shè)備的第一元件的透視后視圖。
[0026] 圖4顯不了不例性設(shè)備的底部的透視圖。
[0027] 圖5顯示了使用不同透明質(zhì)酸水凝膠進(jìn)行的角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞活力試驗(yàn)的結(jié)果。
[0028] 圖6顯示了使用不同透明質(zhì)酸水凝膠進(jìn)行的角質(zhì)形成細(xì)胞跨孔迀移試驗(yàn)的結(jié)果。
[0029] 圖7顯示了使用不同透明質(zhì)酸水凝膠進(jìn)行的角質(zhì)形成細(xì)胞體外刮擦試驗(yàn)的結(jié)果。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，除了具體描述的那些以外，還可以對(duì)本文所述的發(fā)明進(jìn) 行變化和修改。應(yīng)理解本發(fā)明