膚干細胞可包括表皮干 細胞、黑素細胞干細胞和毛囊干細胞。表皮干細胞發(fā)現(xiàn)于表皮的基底層并負(fù)責(zé)不同表皮層 每天的再生。黑素細胞干細胞負(fù)責(zé)黑素細胞的再生。毛囊干細胞確保毛囊的穩(wěn)定更新并還 可在表皮和皮脂腺受損時再生這些組織。毛囊干細胞發(fā)現(xiàn)于毛囊的各個部位。
[0060] 因此，從完整皮膚樣品（包括表皮、真皮和真皮-表皮連接部）收獲的細胞可包括 皮膚干細胞和/或成纖維細胞。在某些實施方式中，收獲的細胞可包括角質(zhì)形成細胞、黑素 細胞干細胞、黑素細胞、成纖維細胞和/或朗格漢斯細胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方 法從組織樣品中收獲這些細胞。例如，可使用諸如解剖刀的工具從樣品表面刮下細胞，從 表皮開始直至收集到樣品中的基本所有細胞。還可使細胞通過合適尺寸網(wǎng)的篩選將其分 解。在一個實施方式中，如此收獲的細胞包括但不限于角質(zhì)形成細胞、朗格漢斯細胞、成纖 維細胞和黑素細胞。從組織樣品中收獲細胞后，其以懸浮的形式存在于營養(yǎng)液中（例如分 散的）。
[0061] 隨后可過濾細胞懸液。過濾可用于除去或收集過大的細胞聚集物以防止施涂機阻 塞并促進細胞懸液在受體位點的平均分布。在本發(fā)明的該優(yōu)選步驟中可使用能夠從懸液 中分離過大細胞聚集物的任何濾器。在一個實施方式中，所述濾器的尺寸可以是50 ym至 200 y m、75 y m 至 150 y m，或約 100 y m。
[0062] 在向受體位點應(yīng)用/分散前或緊接在過濾后，可稀釋細胞懸液以形成適用于懸液 使用目的的合適細胞密度。
[0063] 細朐懸液的伸用
[0064] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種通過本文所述方法生產(chǎn)的水性細胞 懸液。由該方法提供的細胞懸液適用于多種上皮相關(guān)過程。在上皮相關(guān)過程中使用這類懸 液的一個重要優(yōu)勢是能夠大量擴張能夠通過有限數(shù)量的可繁殖細胞的原位繁殖進行快速 處理的傷口或受體位點的面積或尺寸或體積。當(dāng)涉及皮膚時，所述上皮相關(guān)過程可以是皮 膚傷口處理、皮膚組織移植、皮膚美容過程或其他表皮和/或真皮處理。在傷口上均勻施涂 細胞懸液模擬了產(chǎn)前皮膚的愈合能力，從而通過細胞懸液的完全覆蓋使傷口均勻愈合并迅 速閉合，產(chǎn)生最佳的結(jié)構(gòu)和功能。所述皮膚傷口可以是急性傷口（例如燒傷或外傷導(dǎo)致的 撕裂）、人工產(chǎn)生的傷口（例如移植供體位點、美容適應(yīng)癥、整形過程或皮膚處理）或慢性 傷口（例如靜脈或糖尿病性潰瘍）。其他合適的適應(yīng)癥包括疤痕重塑、無毛皮膚損失損傷、 色素沉著問題、白斑病、白癜風(fēng)和美容年輕化過程。在多個實施方式中，接種在受體位點上 的細胞數(shù)目和/或濃度可根據(jù)療程和/或受體位點而變化，例如，通過改變懸液中細胞的濃 度，和/或通過使用適當(dāng)量的分布在給定面積或體積的受體位點上的懸液。
[0065] 通過將細胞置于營養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)患者處理的結(jié)果得到改善，所述營養(yǎng)液至少（i) 不含對于患者的異種血清，（ii)能夠維持收獲的細胞的活力，以及（iii)適合直接應(yīng)用于 患者的受體位點。不希望受到理論的束縛，部分解釋可以是歸因于從細胞懸液中排除了異 源血清，在某些實施方式中排除了任何血清。異源血清是標(biāo)準(zhǔn)的移植培養(yǎng)基中常見的添加 劑且被懷疑會引起潛在的感染和過敏性反應(yīng)。然而，這類血清通常是細胞的標(biāo)準(zhǔn)體外擴張 和中和胰蛋白酶的作用所必需的。本發(fā)明中使用的營養(yǎng)液不需要這類血清，因為懸液中的 細胞群在應(yīng)用至受體位點前不需要擴張或繁殖。而是，與體外培養(yǎng)系統(tǒng)相反，在受體位點 出現(xiàn)細胞繁殖。需要體外培養(yǎng)時，也可使用無血清培養(yǎng)基，任選補充合適的生長因子、試劑 (如透明質(zhì)酸和/或重組蛋白（如熱激蛋白和促血管生成素））。
[0066] 此外，營養(yǎng)液中可包含外源試劑或組分（如熱激蛋白、透明質(zhì)酸、富血小板血漿、 生長因子、細胞因子和/或脂肪干細胞），使得用于向受體位點分散的最終組合物可包含這 類試劑?；蛘?，可向受體位點單獨提供這類試劑?？上蝮w外培養(yǎng)系統(tǒng)提供一種或多種這些 試劑（在細胞培養(yǎng)中或當(dāng)細胞被接種至生物和合成的胞外基質(zhì)或基底時）。本文中較詳細 描述了熱激蛋白和透明質(zhì)酸。富血小板血漿（也稱作PRP)是富含血小板的血液血漿，所述 血小板通過由低速離心從外周血中除去血紅細胞的方式獲得。PRP包含大量生長因子（如 血小板中包含的血小板來源生長因子（PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子0 (TGF-0)、成纖維細胞生長 因子（FGF)、胰島素樣生長因子（IGF)等），并通過這些因子的協(xié)同作用起效（如血管生成、 骨生成、促進傷口愈合、組織再生等）。有用的生長因子和細胞因子包括但不限于表皮生長 因子、轉(zhuǎn)化生長因子-a和-0、肝實質(zhì)細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、血小板來源生長 因子、成纖維細胞生長因子1和2、胰島素樣生長因子1和2、白介素8、結(jié)締組織生長因子和 角質(zhì)形成細胞生長因子。脂肪干細胞包括收集自脂肪組織且具有繁殖和分化潛能的多種干 細胞。脂肪干細胞可在體外經(jīng)歷成脂、成骨、成軟骨、神經(jīng)原性和/或肌原性分化。單獨步 驟中也可提供外源試劑或組分。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的細胞懸液的另一個獨特特征是細胞懸液中的細胞組成 與來自供體位點（例如對皮膚而言，靠近真皮-表皮連接部）的原位組成相當(dāng)（即類似或 基本相同）。一種可能的解釋是，在標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中，皮膚細胞制備的培養(yǎng)利用角質(zhì)形成細胞的 選擇性培養(yǎng)，導(dǎo)致細胞組成物（對皮膚而言，如成纖維細胞和黑素細胞）的部分或全部損 失。相反的，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的細胞懸液具有與原位細胞組成類似或基本相同的細胞組成 (即不同細胞類型的相對比例或百分比）。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的細胞懸液的另一個特征是細 胞維持最高活力（由于其經(jīng)歷了最少的處理步驟和最短的收獲時間）并在溫和的營養(yǎng)液中 收獲。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種處理需要上皮相關(guān)過程的患者的方 法。通過該方法，可在收獲和過濾后，直接向患者的受體位點應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的細胞懸 液。所述受體位點可以是急性傷口（例如燒傷或外傷導(dǎo)致的撕裂）、人工產(chǎn)生的傷口（例如 移植供體位點、美學(xué)指征、整形過程或皮膚處理）或慢性傷口（例如靜脈或糖尿病性潰瘍） 的位點。所述受體位點可以是任何經(jīng)準(zhǔn)備的傷口床，包括從中采集皮膚的標(biāo)準(zhǔn)移植過程中 傳統(tǒng)的"供體區(qū)"、需要傳統(tǒng)皮膚移植的傳統(tǒng)"受體區(qū)"以及無需傳統(tǒng)皮膚移植的患者中的傷 口床。例如，根據(jù)目前的護理標(biāo)準(zhǔn)，無需進行傳統(tǒng)移植手術(shù)的相對輕的燒傷或傷口可通過本 發(fā)明的"細胞移植"療程處理。該細胞移植可用作獨立療程，或者與傳統(tǒng)移植手術(shù)聯(lián)用或作 為其補充。例如，當(dāng)傳統(tǒng)移植中使用網(wǎng)狀移植組織時，可向網(wǎng)狀移植體應(yīng)用本發(fā)明的細胞懸 液以增強上皮再生。
[0069] 可通過本發(fā)明的細胞移植處理的上皮相關(guān)過程包括但不限于皮膚傷口處理、皮膚 組織移植、皮膚疾病治療（例如白斑病、白癜風(fēng)和慢性潰瘍）、皮膚美容過程（例如皺紋和痤 瘡疤痕）或其他表皮和/或真皮處理。
[0070] 可通過數(shù)種技術(shù)中的任意一種使含有本發(fā)明細胞的液體懸液分布至受體位點上， 包括但不限于噴涂、鋪展、移液和/或涂布。同樣，所述懸液可用于隨后對傷口使用的傷口 敷料，或?qū)朐环罅舷路?，或在使用前接種至敷料上。在一個實施方式中，可將細胞懸液 噴涂至受體位點上?？赏ㄟ^將液體轉(zhuǎn)化為小空氣播散飛沫的任何類型噴嘴噴涂懸液。該實 施方式有兩項考慮。首先，不應(yīng)對溶液中的細胞施加可能破壞或殺死大量細胞的過量剪切 力或壓力。其次，不應(yīng)將細胞懸液與對其中細胞或傷口床有毒或有害的推進流體混合。容 易獲得的多種噴嘴都適用。這類噴嘴可以任意適當(dāng)方式連接至包含細胞懸液的容器。
[0071] 或者，可通過移液器、類似滴眼劑滴管的裝置、注射器及針頭，和/或其他類似裝 置遞送細胞懸液以將少量細胞懸液置于受體位點上。也可在受體位點上將細胞懸液注射至 組織中。
[0072] 在將細胞懸液應(yīng)用于受體位點后，可使用傷口敷料包扎該位點或傷口床?？墒褂?多種類型的敷料，包括膜（例如聚氨酯膜）、水膠體（連接至聚氨酯泡沫的親水性膠體顆 粒）、水凝膠（包含約至少60%水的交聯(lián)聚合物）、泡沫（親水或疏水的）、藻酸鈣（來自藻 酸鈣的纖維非織造復(fù)合材料）、透明質(zhì)酸衍生物（例如酯）和玻璃紙（具有增塑劑的纖維 素）。參見Kannon 等，Dermatol. Surg. 21:583-590(1995) ;Davies, Burns 10:94(1983)。 在一個實施方式中，所述敷料可以是Surfasoft?(-種織造尼龍敷料）或Hyalomatrix?(一種透明質(zhì)酸酯基質(zhì)）。通常，在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于皮膚移植處理的標(biāo)準(zhǔn)方案后 傷口床愈合。
[0073] 本發(fā)明的細胞懸液也可用于組織或器官再生系統(tǒng)（體內(nèi)或體外），如胞外基質(zhì)或 基質(zhì)材料（例如在氣管的再生長中）。在多個實施方式中，所使用的胞外基質(zhì)或基質(zhì)材料可 以是合成的或生物的，如膠原、藻酸鹽、藻酸鹽珠、瓊脂糖、纖維蛋白、纖維蛋白膠、纖維蛋白 原、血漿纖維蛋白珠子、全血漿或其組分、層連蛋白、纖連蛋白、蛋白多糖、HSP、殼聚糖、肝素 和/或其他合成聚合物或聚合物支架以及能夠維持或粘附至細胞的固體支持材料（如傷口 敷料）。在某些實施方式中，用于再生系統(tǒng)的細胞懸液可促進其上的上皮再生。一旦完成， 即可將所述再生系統(tǒng)移植至所需患者。
[0074]用于制備和使用細胞懸液的裝置
[0075] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生組織再生溶液的設(shè)備。所述設(shè) 備可具有適用于將酶溶液加熱至預(yù)設(shè)溫度并能夠在合適的時間中將溶液維持在所需溫度 下的加熱裝置。所述設(shè)備還可包括能夠從細胞懸液中分離大細胞聚集物（例如直徑大于約 200 ym)的過濾裝置。
[0076] 在一個實施方式中，所述設(shè)備還可包括能夠使組織樣品浸沒在營養(yǎng)液中的容器， 所述營養(yǎng)液能夠維持組織樣品中細胞的活力。在某些實施方式中，所述容器可以是具有足 夠尺寸以允許組織樣品的操作，例如允許組織細胞層（例如表皮和真皮）的分離和從表皮 和/或真皮中收獲細胞，從而產(chǎn)生上皮相關(guān)過程中使用的細胞懸液。
[0077] 所述設(shè)備還可包括一種或多種流體容納孔或囊以儲存流體（如營養(yǎng)液）?；蛘撸?述孔可用作接受容器，如容納營養(yǎng)液的塑料或玻璃瓶。優(yōu)選地，所述孔能夠容納至少l〇ml 體積。這類孔使得流體能夠方便地應(yīng)用于組織樣品。這類流體緊密相鄰的儲存方式還提 供了降低流體意外泄露風(fēng)險的優(yōu)勢，并可方便地獲得流體以精確遞送至組織樣品或細胞懸 液。
[0078] 在一些實施方式中，所述設(shè)備可包括第一和第二元件，其中：
[0079] (1)所述第一元件包括：
[0080] (a)至少一個適用于將酶溶液加熱至預(yù)設(shè)溫度并能夠在合適的時間中將溶液維持 在所需溫度下的加熱裝置；
[0081] (b)至少一個能夠從細胞懸液中分離大細胞聚集物的過濾裝置；以及
[0082] (c)至少一個用于儲存營養(yǎng)液的流體容器；
[0083] (2)所述第二元件形成能夠使組織樣品浸沒在營養(yǎng)液中的容器；以及
[0084] 所述第一元件提供了組織樣品操作期間能夠在其上放置所述第二元件的位置。
[0085] 在其他實施方式中，所述第一元件可提供儲存本文所述方法中所用工具和溶液的 儲存隔室。當(dāng)設(shè)備中提供這類隔室時，所述第二元件可為該隔室提供蓋子或閉合。使用中， 所述蓋子可從所述隔室頂部移開并反轉(zhuǎn)。所述蓋子的底面優(yōu)選形成儲器，使得所述第二元 件具有雙重功能。可從所述隔室中獲得該方法中所用工具和溶液。隨后可將反轉(zhuǎn)的蓋子放 回所述隔室上，為所述設(shè)備提供儲器。
[0086] 所述設(shè)備可由金屬、塑性或任何其他合適的材料制成。此外，所述容器可根據(jù)其預(yù) 期用途和滅菌（如通過Y射線輻射和/或環(huán)氧乙烷處理）的需要制備成任何合適的尺寸。
[0087] 應(yīng)理解所述設(shè)備中使用的所述加熱裝置可以是位于所述第一元件頂上的一個或 多個加熱墊。在一個實施方式中，為避免被加熱容器的意外逸出，可將一個或多個加熱裝置 放置于所述第一元件的凹陷處。該凹陷處還可放置至少一個容器，所述容器中可放入組織 樣品以使其接觸酶溶液。在一個替代性實施方式中，可將一個或多個加熱裝置置于所述設(shè) 備的基部。在這種構(gòu)造中，所述第一元件可含有至少一個開口以接收用于容納流體的容器， 所述開口可使所述容器接觸所述加熱裝置。
[0088] 應(yīng)理解，如果所述設(shè)備被設(shè)計為多項用途，可重復(fù)加熱和冷卻所述加熱裝置?；?者，可使所述設(shè)備配備多個加熱單元以促進多個加熱事件，其中各加熱單元可設(shè)計為單次 使用。
[0089] 在所述設(shè)備的