本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種人cd3+cd56+cik細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokineinducedkillercell,cik）是schmidt等于1986年報(bào)的從外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs）中誘導(dǎo)出的一群異質(zhì)性細(xì)胞。其主要效應(yīng)細(xì)胞因同時(shí)表達(dá)cd3+和cd56+兩種膜蛋白分子，因此又被稱為nk細(xì)胞樣t淋巴細(xì)胞（nkt細(xì)胞）。體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究表明，cik細(xì)胞具有殺瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及殺瘤效應(yīng)不受癌細(xì)胞多重耐藥的影響等優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了提供一種實(shí)用高效的體外擴(kuò)增人cik細(xì)胞的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種制備人cd3+cd56+細(xì)胞的方法，包括如下步驟：采集并分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs），用抗cd3單抗刺激，同時(shí)加入細(xì)胞因子rhil-15和rhil-2，置于37℃，5%co2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72小時(shí)后進(jìn)行半兩更換培養(yǎng)并補(bǔ)加等量的rhil-2，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2～3天進(jìn)行補(bǔ)加等量含有rhil-2和rhil-15的培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞密度為（0.5～2）×10⁶個(gè)/ml。10～15天即可獲得cd3+cd56+cik細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明，所述的pbmcs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離手機(jī)，并用生理鹽水洗滌2次，低速離心后獲得。所述rhil-15終濃度為1-50ng/ml、rhil-2終濃度為50-1500iu、抗cd3單抗終濃度為1-50ng/ml。根據(jù)pbmcs的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間約為10-15天。

本發(fā)明所用的原料和試劑除有特殊說明外，均市售可得。

本發(fā)明的有益效果：利用抗cd3單抗作為刺激劑，激活cik細(xì)胞，并聯(lián)合細(xì)胞因子rhrhil-15和rhil-2共同刺激。從而為臨床過繼性免疫細(xì)胞治療提供新的可選方案。

附圖說明

圖1為實(shí)施例集落和不規(guī)則的單個(gè)核細(xì)胞示意圖；

圖2為實(shí)施例細(xì)胞增殖倍數(shù)示意圖；

圖3為實(shí)施例flowjo分析結(jié)果示意圖；

圖4為實(shí)施例flowjo分析結(jié)果示意圖；

圖5為實(shí)施例flowjo分析結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

下面用實(shí)例說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實(shí)例中凡未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。

實(shí)施例1

本實(shí)例1是用抗cd3單抗刺激pbmcs，以獲得cd3+cd56+cik細(xì)胞。具體操作包括以下步驟：

1.無菌條件下用血細(xì)胞分離機(jī)或50ml注射器采集患者外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞。具體步驟為：1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56℃滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對(duì)倍稀釋沉淀的血細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按照1:2的比例加入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，放置時(shí)間較長(zhǎng)的血液離心30分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌兩次，轉(zhuǎn)速分別為1500轉(zhuǎn)/分，1200轉(zhuǎn)/分，均離心8分鐘，即可獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞。

2.將上述分離的pbmcs置于含有刺激劑和細(xì)胞因子為25ng/mlrhil-15、300iurhil-2、30ng/ml抗cd3單抗、100ng/ml抗cd28單抗和1-10%自體血漿的rpmi1640、optmizer、aim-v、scgm或gt-t551等培養(yǎng)基內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度為（1～2）×10⁶個(gè)/ml，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)班板、培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)袋內(nèi)，于37℃、5%co2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72小時(shí)后進(jìn)行半兩更換培養(yǎng)液并加等量的rhil-2，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2～3天進(jìn)行補(bǔ)加含有等量rhil-2的培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞密度為（0.5～2）×10⁶個(gè)/ml。10～15天即可獲得tscm細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)的第14天，培養(yǎng)增殖的人tscm細(xì)胞絕對(duì)擴(kuò)增細(xì)胞倍數(shù)平均為

實(shí)施例2

本實(shí)施例2將對(duì)上述培養(yǎng)的cik細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖能力及活率進(jìn)行檢測(cè)。具體操作包括以下步驟：

1.形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)即可見cik細(xì)胞沉于培養(yǎng)皿底部，仍呈單細(xì)胞狀態(tài)，48小時(shí)趨于集落話，培養(yǎng)3天后可以看到大的集落和不規(guī)則的單個(gè)核細(xì)胞見圖1。

2.在第0、3、5、7、9、12、14天分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和細(xì)胞計(jì)數(shù)板，將當(dāng)前細(xì)胞總數(shù)除以開始培養(yǎng)的細(xì)胞總數(shù)，所得數(shù)值即為細(xì)胞增殖數(shù)，依次進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞增殖情況作為細(xì)胞補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基時(shí)的參考，細(xì)胞增殖倍數(shù)圖見圖2。

3.在第0、3、5、7、9、12、14天分別對(duì)細(xì)胞活率進(jìn)行檢測(cè)，取培養(yǎng)至相應(yīng)天數(shù)的細(xì)胞，用含有0.1%疊氮鈉的pbs洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度0.5×10⁶/ml，加入100ng/mlpi染料，室溫避光孵育15分鐘，用上述pbs洗滌2次，并重懸在上述的pbs中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活率。

實(shí)施例3

本實(shí)施例3是對(duì)cd3+cd56+cik細(xì)胞進(jìn)行免疫表型檢測(cè)。步驟如下：

取第0天和第14天的細(xì)胞，用含5%的新生牛血清和0.1%疊氮鈉的pbs洗滌2次，調(diào)整密度為1×10⁶/ml，重懸在100μl的上述pbs中，加入熒光抗體（cd3-fitc、cd4-pe、cd8-percp、cd56-apc）染色，4℃孵育30分鐘，用上述pbs洗滌2次，加入含有1%的多聚甲醛的pbs溶液固定后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)用flowjo分析，見圖3。

實(shí)施例4

本實(shí)施例4是對(duì)cd3+cd56+cik細(xì)胞及不同亞型的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒活性的檢測(cè)。包括以下步驟：

1.取培養(yǎng)13天的cik細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)人白血病k562腫瘤細(xì)胞株的殺傷活性；

2.取k562細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×10⁶/ml，加入0.05μmcalcein-am37℃染色30分鐘；

3.用pbs洗滌2次，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

4.調(diào)整k562的細(xì)胞密度為5×10⁵/孔，24孔板，每孔500μl，分別按照1:10、1:20、1:40的比例分別于cik細(xì)胞混合，同時(shí)設(shè)置單獨(dú)靶細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）對(duì)照、pi單染靶細(xì)胞對(duì)照、calcein-am單染靶細(xì)胞對(duì)照、pi和calcein-am雙染靶細(xì)胞對(duì)照、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照。于37℃、5%co2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)4小時(shí)；

5.將細(xì)胞從24孔板中轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集細(xì)胞；

6.用100μl的pbs重懸細(xì)胞，加入100ng/mlpi，避光孵育15分鐘；

7.用100μl的pbs洗滌兩次，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

8.用流式儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)用flowjo分析，見圖4。

實(shí)施例5

本實(shí)施例5是對(duì)cik細(xì)胞及不同亞型的細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)因子ifn-γ的檢測(cè)。包括以下步驟：

1.配置5%的新生牛血清和0.1%疊氮鈉的pbs；

2.取cik細(xì)胞1500rpm離心5分鐘，重選于含10%新生牛血清的rpmi1640中，進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整密度至2×10⁶/ml；

3.分別設(shè)置陰性對(duì)照組，刺激對(duì)照組，阻斷對(duì)照組、陽性組，24孔板，向每孔中加入500μl的cik細(xì)胞，陰性對(duì)照組加入500μl的無血清rpmi1640培養(yǎng)基，刺激對(duì)照組加入500μl含有1μg/mlionomycin、10ng/mlpma的rpmi1640，阻斷對(duì)照組加入10μg/mlbfa，陽性組加入500μl含有1μg/mlionomycin、10ng/mlpma、10μg/mlbfa的rpmi1640。37℃、5%co2及飽和濕度下孵育4小時(shí)；

4.將細(xì)胞移至1.5mlep管中，400×g離心5分鐘；

5.棄上清，收集細(xì)胞沉淀，重懸在上述pbs中，加入胞外熒光染料（cd3-fitc、cd56-apc），4℃避光孵育30分鐘；

6.400×g離心5分鐘，洗滌兩次；

7.向每支ep管中加入500μl破膜固定劑，4℃避光孵育20分鐘；

8.向每支ep管中加入500μl固定洗液，400×g離心5分鐘；

9.向每支ep管中加入500μl固定洗液，400×g離心5分鐘，洗滌兩遍；

10.用100μl上述pbs重懸，加入胞內(nèi)細(xì)胞染料ifn-γ，4℃避光孵育30分鐘；

11.用上述pbs洗滌2次，400×g離心5分鐘；

12.重懸于100μl的上述pbs中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用flowjo分析，見圖5。