本發(fā)明屬于體外細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體是一種簡單高效制備記憶性γδt細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

t淋巴細(xì)胞根據(jù)表達(dá)t細(xì)胞抗原受體（tcellreceptor,tcr）的不同分為兩類：tcrαβt細(xì)胞和tcrγδt細(xì)胞，簡稱為αβt細(xì)胞和γδt細(xì)胞。其中γδt細(xì)胞是介于天然免疫和獲得性免疫之間的特殊免疫類型的細(xì)胞，具有抗原特異性識別功能而無mhc限制性。大多數(shù)為cd4和cd8雙陰性分子。γδt細(xì)胞主要分布于皮膚和黏膜組織，一般不超過t細(xì)胞總數(shù)的5%。當(dāng)機(jī)體受到病毒或者腫瘤細(xì)胞的侵襲時(shí)，γδt細(xì)胞起到第一道防線作業(yè)而進(jìn)行免疫監(jiān)視。但是由于γδt細(xì)胞在外周血和腫瘤組織中含量和殺傷特異性并不高的原因，因此我們要想獲得大量高效的對腫瘤有特異記憶性的γδt細(xì)胞是本發(fā)明闡述的關(guān)鍵。經(jīng)廣泛查閱國內(nèi)外專利文獻(xiàn)，迄今為止，均未見有此發(fā)明或報(bào)道。因此，發(fā)明一種簡單，高效的體外制備記憶性的γδt細(xì)胞對人類抗感染和抗腫瘤的作業(yè)非常重要，對于攻克解決惡性腫瘤疾病也具有十分重要的價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為提供一種簡單實(shí)用，高效的體外培養(yǎng)記憶性γδt細(xì)胞的制備方法，克服常規(guī)制備的γδt細(xì)胞的記憶特異性不高的限制。進(jìn)一步明確記憶性γδt細(xì)胞在生物學(xué)的特性提供研究平臺。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種制備記憶性γδt細(xì)胞的方法，本發(fā)明通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：

（1）制備外周血單個(gè)核細(xì)胞：采取健康志愿者的外周血，肝素抗凝，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度分離得到單個(gè)核細(xì)胞，用gt-t551培養(yǎng)基或rpmi1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

（2）單個(gè)核細(xì)胞分組：將所獲得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)計(jì)數(shù)并分為兩組，分別為常規(guī)對照組和記憶實(shí)驗(yàn)組。對照組和實(shí)驗(yàn)組均加入磷酸抗原刺激劑20ng/ml和rhil-2細(xì)胞因子1000iu/ml來誘導(dǎo)成為γδt細(xì)胞，此外實(shí)驗(yàn)室還加上一定量效靶比為10：1的腫瘤細(xì)胞為記憶誘導(dǎo)劑。

（3）記憶性γδt細(xì)胞誘導(dǎo)：步驟使用懸浮腫瘤細(xì)胞k562，預(yù)先對k562進(jìn)行cfse染色，染色條件控制在1－2x106/ml,37⁰c，30min，然后用pbs洗滌2次，1000rpm離心5ming，最后用gt-t551培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組的pbmc計(jì)算總數(shù)，按照e:t為10：1把需要腫瘤細(xì)胞的數(shù)量添加到實(shí)驗(yàn)組內(nèi)。

（4）記憶性γδt細(xì)胞表型檢測：收集細(xì)胞于第0天（pbmc）,第7天和第14天進(jìn)行表型檢測，檢測指標(biāo)有cd3,vγ9，cd4,cd8,cd27，cd45ro。并同時(shí)對cfse進(jìn)行熒光檢測。

（5）記憶性γδt細(xì)胞增值數(shù)量檢測：收集第0天，第3天，第6天，第8天，第10天，第13天和第14天細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)出細(xì)胞增長倍數(shù)。

（6）記憶性γδt細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)檢測：培養(yǎng)至第10天開始，收集細(xì)胞檢測細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)的殺傷效率，取對數(shù)生長期的k562細(xì)胞，用calcein－am對細(xì)胞染色后，調(diào)整細(xì)胞弄為2x10⁵，1x10⁵，5x10⁴，鋪板于24孔板中，效應(yīng)細(xì)胞為1x10⁶，最終使得效靶比為5：1，10：1和20:1,各孔分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37度培養(yǎng)箱共孵育24小時(shí)后，收集細(xì)胞上流式檢測細(xì)胞的殺傷效率。

（7）記憶性γδt細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測：培養(yǎng)至第13天，取細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子ifn-γ檢測，觀察常規(guī)的γδt和記憶性的γδt的胞內(nèi)ifn-γ的分泌量。

附圖說明

圖1是常規(guī)對照組與記憶性實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖倍數(shù)比較示意圖；

圖2是常規(guī)對照組與記憶性實(shí)驗(yàn)組的cfse熒光檢測比較示意圖；

圖3是常規(guī)對照組與記憶性實(shí)驗(yàn)組的記憶標(biāo)記cd45ro的流式結(jié)果圖比較示意圖；

圖4是常規(guī)對照組與記憶性實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較示意圖。

具體實(shí)施方式

下面用實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實(shí)例中凡未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。

實(shí)施例1

本實(shí)施例1是用外周血的提取pbmc細(xì)胞并進(jìn)行分組，包括以下步驟：

1.采取健康志愿者外周血，用肝素納抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液ficoll進(jìn)行密度梯度分離獲得單個(gè)核細(xì)胞。具體步驟：510g/分，離心7分鐘，降速度為2，離心完畢后，吸取上層血漿層，56度滅活30分鐘后510g/分，離心7分鐘，取上層血漿層轉(zhuǎn)到干凈離心管備用。沉淀的血細(xì)胞用生理鹽水稀釋后，將人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按照1：2的比例加入離心管中，680g/分,離心20分鐘，升降速都調(diào)為1，離心完畢后，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，510g/分，離心7分鐘。最后沉淀用gt-t551重懸沉淀，即可得到pbmc細(xì)胞。

2.將上述的pbmc細(xì)胞，取少量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用gt-t551培養(yǎng)基調(diào)整濃度在（1－2）x10⁶/ml，平均分為2組，一組為常規(guī)對照組，二組為記憶實(shí)驗(yàn)組；兩組均加入磷酸抗原激活劑和gd1因子和rhil-2因子，于37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)；此外記憶實(shí)驗(yàn)組還要加入效靶比為10：1的數(shù)量的經(jīng)過cfse標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞抗原作為記憶性的誘導(dǎo)劑。每隔2－3天進(jìn)行半量補(bǔ)加培養(yǎng)基，并維持細(xì)胞密度在（1－2）x10⁶/ml。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為10－15天；選擇在第7天和第14天進(jìn)行細(xì)胞表型檢測，在第10天開始細(xì)胞功能性檢測。

實(shí)施例2

本實(shí)施例2對上述培養(yǎng)的γδt細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖倍數(shù)、免疫表型檢測和細(xì)胞功能檢測。具體步驟如下：

1.細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)即可見γδt細(xì)胞沉于培養(yǎng)器皿底部，并趨于集落化，培養(yǎng)48小時(shí)集落開始變大，培養(yǎng)6－10天可見大的集落和不規(guī)則的單個(gè)核細(xì)胞。

2.分別取第0、3、6、8、10、13、14天細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，利用beckman公司的z2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行，對細(xì)胞進(jìn)行稀釋，使得細(xì)胞濃度在10⁵－10⁷范圍之內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞粒徑大小5－15um,每次計(jì)數(shù)重復(fù)3次測量，最后得出平均值。平均值乘以培養(yǎng)的體積即為當(dāng)天的細(xì)胞總數(shù)。根據(jù)各天的總數(shù)即可以得出細(xì)胞的增殖曲線，將最后的總數(shù)與第一天進(jìn)行比較，即可以得到增殖倍數(shù)。結(jié)果顯示在培養(yǎng)至14天時(shí)常規(guī)對照組增長倍數(shù)為32倍而記憶實(shí)驗(yàn)組的增長倍數(shù)為45倍。

3.取第0、7、14天細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞表型檢測，取細(xì)胞用pbs洗滌1次，再用pbs重懸細(xì)胞沉淀，分為3，其中a組為加入抗體（cd3-percp，vγ9－fitc,cd27-pe,cd56-apc）,b組加入抗體（cd3-fitc,cd4-pe,cd8-percp,cd45ro-apc）,c組為空白對照組。避光染色30min，上bdaccuric6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的各個(gè)表型指標(biāo)。

4.培養(yǎng)至到第10天后，開始對細(xì)胞功能檢測。取細(xì)胞用pbs洗滌2次，然后再用t551培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度為1x10⁶個(gè)/ml,鋪板于24孔板，設(shè)定對照組，為陰性對照組，刺激對照組，阻斷對照組和陽性對照組。每個(gè)組別設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。加入刺激劑pma(10ug/ml)，ionomycin（1ug/ml）和阻斷劑bfa（5ug/ml）后24小時(shí)收集細(xì)胞，用bd公司固定破膜劑（cytofix/cytopermfixationpermeabilization）4度破膜10分鐘，用對應(yīng)的破膜洗滌劑（perm/washbuffer）洗滌2次，最后然胞內(nèi)因子抗體inf-γ，避光30分鐘，上流式細(xì)胞儀檢測ifn－γ含量。結(jié)果顯示記憶實(shí)驗(yàn)組的ifn-γ分泌量比對照組的高。

5.取對數(shù)生長期的k562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2x105，1x105，5x104/ml,鋪板于24孔板，再取γδt細(xì)胞，調(diào)整濃度為1x10⁶/ml，鋪板于24孔板，使得最后效靶比為5：1，10：1，20：1，各孔對應(yīng)重復(fù)3次復(fù)孔，并設(shè)置空白對照孔，培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞，pbs洗滌2次，加入pi染色15分鐘，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞殺傷率。結(jié)果顯示，在效靶比為5：1的時(shí)候，記憶實(shí)驗(yàn)組殺傷率為53.5%，而對照組的是35.2%，同樣，隨著效靶比的增高，殺傷率隨之增強(qiáng)，當(dāng)效靶比為20：1時(shí)，記憶實(shí)驗(yàn)組的殺傷率高達(dá)76.2%，而常規(guī)對照組的只有68.7%。