本發(fā)明一株抗前列腺素f2α的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2及其應(yīng)用,涉及前列腺素f2α的雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的抗特異性單克隆抗體,屬于臨床檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
前列腺素(prostaglandins,pgs)是一類化學(xué)組成相似,且生物活性廣泛的不飽和羥基脂肪酸。pgs家族主要包括:前列腺素d2、前列腺素e2、前列腺素f2α、前列腺素i2和txa2,前列腺素在組織內(nèi)含量甚微,但活性極強(qiáng)。子宮內(nèi)膜是合成前列腺素的重要部位之一,前列腺素的e2和f2α是子宮內(nèi)膜合成的主要花生四烯酸產(chǎn)物。
目前前列腺素檢測(cè)多采用免疫親和色譜-氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定法(immuno-gc-ms)、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法(lc-ms)、氣質(zhì)聯(lián)用法(gc-ms)等。上述檢測(cè)方法可進(jìn)行定量分析并具有較低的檢測(cè)限,但是通常需要昂貴的儀器和復(fù)雜的操作,前處理及檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),嚴(yán)重制約了這些檢測(cè)方法的推廣,無法達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)大批量快速檢測(cè)的要求。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、對(duì)技術(shù)人員相對(duì)要求低等特點(diǎn),因此適用于大量樣品的快速篩查。本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)前列腺素f2α具有較高親和力和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備方法,為間接競(jìng)爭(zhēng)elisa試劑盒以及膠體金試紙條的研發(fā)推廣奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一株抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2,由該細(xì)胞株制備的抗體對(duì)前列腺素f2α具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度,可以用來建立前列腺素f2α的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案:一株抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,簡(jiǎn)稱cgmcc,保藏編號(hào)為cgmccno.13087。
抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體,它由所述保藏編號(hào)為cgmccno.13087的抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2分泌產(chǎn)生。
所述抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體的應(yīng)用,其在前列腺素f2α臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。
所述抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2的制備步驟為:
(1)免疫原的制備與鑒定:前列腺素f2α通過碳化二亞胺法(edc法)與蛋白載體的氨基相連,反應(yīng)結(jié)束后,通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原,完全抗原通過紫外吸收掃描方法鑒定;
(2)小鼠的免疫:將免疫原與福氏佐劑乳化完全后,通過皮下多點(diǎn)注射免疫balb/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐劑,加強(qiáng)免疫使用福氏不完全佐劑,沖刺免疫時(shí)免疫劑量為前一次免疫劑量的一半,與生理鹽水混合均勻后直接進(jìn)行腹腔注射;各次免疫間隔為三周。第三次免疫后,間隔一周采血檢測(cè)血清效價(jià)和抑制;
(3)細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立:通過聚乙二醇(peg2000)法,使小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合,通過hat培養(yǎng)基培養(yǎng),利用間接elisa檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔,并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果,通過有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆,最終篩選獲得抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2;
(4)雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定:采用小鼠單抗ig類/亞類鑒定用酶標(biāo)二抗套裝測(cè)定;ic50值和親和力的測(cè)定通過elisa法。
本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明獲得的抗前列腺素f2α單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,對(duì)前列腺素f2α有較好的檢測(cè)靈敏度和親和力;本發(fā)明還提供了一種新的合成前列腺素f2α免疫原的方法,半抗原的合成步驟更加簡(jiǎn)化,有效,為今后人們的研究提供了合成免疫原的思路與方法。
生物材料樣品保藏:?jiǎn)慰寺〖?xì)胞株wxx-2,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,簡(jiǎn)稱cgmcc,地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,保藏編號(hào)為cgmccno.13087,保藏日期2016年10月31日。
附圖說明
圖1免疫原的紫外吸收光譜表征。
圖2抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體對(duì)前列腺素f2α的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明,不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明通過將前列腺素f2α完全抗原免疫小鼠,通過細(xì)胞融合,hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng),通過間接elisa和間接競(jìng)爭(zhēng)elisa篩選細(xì)胞上清,最終得到了對(duì)前列腺素f2α有較好親和力和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
實(shí)施例1抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2的制備
(1)完全抗原的合成:
完全抗原的合成:取4mg半抗原f2α,再加入5.0mgedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和3.7mgnhs(n-羥基琥珀酰亞胺),使用dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶解,室溫?cái)嚢?,活?h;另取15mgbsa(牛血清白蛋白)溶解于3ml、0.05m、ph9.6的cbs(碳酸鹽緩沖溶液)溶液中;將上述活化液逐滴加入bsa溶液中,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜后,取出免疫原pbs透析3天,-20℃分裝保存。
(2)動(dòng)物免疫:選擇健康的6~8周齡的balb/c小鼠進(jìn)行免疫。取前列腺素f2α完全抗原(1mg/ml)與等量福氏佐劑乳化均勻后,通過皮下多點(diǎn)注射免疫balb/c小鼠,每只100μl。首次免疫采用福氏完全佐劑,加強(qiáng)免疫使用福氏不完全佐劑,沖刺免疫時(shí)免疫劑量為前一次免疫劑量的一半,與生理鹽水混合均勻后直接進(jìn)行腹腔注射;各次免疫間隔為三周。第三次免疫后,間隔一周采血檢測(cè)血清效價(jià)和抑制;選擇抑制最好的小鼠,在五免后18天沖刺免疫,準(zhǔn)備融合。
(3)細(xì)胞融合:在沖刺免疫三天后,按照常規(guī)peg(聚乙二醇,分子量為2000)方法進(jìn)行細(xì)胞融合,具體步驟如下:
無菌取小鼠脾臟,研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);
收集sp2/0細(xì)胞,懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);
將脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞按照2-10:1的計(jì)數(shù)比例混合,離心后用peg融合,時(shí)間1min,之后按照從慢到快,加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液,離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中,加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(4)細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立:在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液,第5天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液,在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分兩步:第一步先用間接elisa篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔,第二步選用前列腺素f2α為標(biāo)準(zhǔn)品,用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選擇對(duì)前列腺素f2α有較好抑制的細(xì)胞孔,采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次,獲得抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2。
(5)抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體的制備與鑒定:取8-10周齡balb/c小鼠,每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml;7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞wxx-2,從第七天開始收集腹水,將腹水通過辛酸-飽和硫酸銨法純化,獲得的單抗置于-20℃保存。
使用小鼠單抗亞型鑒定試劑盒對(duì)腹水純化獲得的單克隆抗體進(jìn)行免疫球蛋白亞型鑒定,其亞型為igg1型,具體如表1所示。
表1前列腺素f2α單克隆抗體的亞型鑒定
使用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法,測(cè)定單克隆抗體對(duì)前列腺素f2α的ic50為1.8μg/l,可用于前列腺素f2α的特異性快速檢測(cè),具體如圖2所示。
(6)抗體應(yīng)用:將抗前列腺素f2α特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株wxx-2通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于前列腺素f2α樣品測(cè)定試驗(yàn),具體步驟如下:
6.1用碳酸鹽緩沖液(cbs)稀釋好的0.1μg/ml的前列腺素f2α包被作為包被原包被96孔酶標(biāo)板,每孔100μl,37℃包被2h后,用pbst洗液洗板三次,每次每孔200μl,每次3min,拍干;
6.2用含0.2%明膠的cbs進(jìn)行封閉,每孔200μl,37℃封閉2h,用pbst洗液洗板三次,每次每孔200μl,每次3min,拍干;
6.3用磷酸鹽緩沖液(pbs)分別配置0,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1μg/l的前列腺素f2α標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液以及待檢測(cè)樣品提取液,分別加入到已經(jīng)封閉好的酶標(biāo)板中,每孔50μl,每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔,再每孔加入50μl1︰16000稀釋的抗前列腺素f2α單克隆抗體,37℃反應(yīng)0.5h后,洗板拍干;
6.4每孔加入100μl用含0.1%明膠的pbs1︰3000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg二抗,37℃反應(yīng)0.5h后,洗板拍干;
6.5每孔加入100μltmb顯色液,37℃顯色15min后,每孔加入50μl2mh2so4終止液,450nm測(cè)吸光值。
溶液的配置:
碳酸鹽緩沖液(cbs):稱取na2co31.59g,nahco32.93g,分別溶于少量雙蒸水后混合,加雙蒸水至約800ml混勻,調(diào)ph值至9.6,加雙蒸水定容至1000ml,4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>
磷酸鹽緩沖液(pbs):8.00gnacl,0.2gkcl,0.24gkh2po4,3.62gna2hpo4·12h2o,溶于800ml純水中,用naoh或hcl調(diào)ph到7.2~7.4,定容至1000ml;
pbst:含0.05%tween20的pbs;
tmb顯色液:a液:na2hpo4·12h2o18.43g,檸檬酸9.33g,純水定容至1000ml;b液:60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比1︰5混合即為tmb顯色液,現(xiàn)用現(xiàn)混。
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾,都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。