本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種多肽，具體涉及一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的多肽及其應(yīng)用，一種與趨化因子CXCL12相互作用的多肽及其在抑制癌癥遷移方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥是嚴(yán)重危害人類身體健康的一類疾病，癌癥是全世界的一個(gè)嚴(yán)重健康問題。在2007年，據(jù)估計(jì)全世界有760萬人死于癌癥。例如在英國，癌癥每年造成126,000人死亡，四分之一的人死于癌癥。癌癥遷移是導(dǎo)致癌癥病人死亡的主要原因。趨化因子是一類單鏈小分子蛋白質(zhì)，通過與細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體相互作用，引起細(xì)胞支架重排，與細(xì)胞的遷移、粘附和侵襲等行為有關(guān)。其中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF-1(stromalcell-derivedfactor-1)，也就是趨化因子CXCL12，及其特異性受體CXCR4在多種腫瘤和白血病細(xì)胞的器官特異性遷移中發(fā)揮著非常重要的作用。腫瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞表面高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，而趨化因子CXCL12在骨髓、淋巴結(jié)和某些器官中高表達(dá)。高表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞在CXCL12的趨化作用下，逆濃度梯度遷移至趨化因子產(chǎn)生源的某些器官，例如肺、肝臟等，形成器官特異性遷移(BalkwillF.,SeminImmunol,2003,15,49-55)。因此，使用抑制劑靶向阻斷CXCL12/CXCR4之間的相互作用可以阻斷癌癥細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的黏附，增加腫瘤細(xì)胞與化療藥物的敏感性，防止癌癥的遷移和復(fù)發(fā)。由于多肽易于合成，在人體內(nèi)易于代謝并且不會(huì)帶來毒副作用和嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，因此使用多肽來抑制腫瘤細(xì)胞的遷移是一種有效且無副作用的方法。CN105434347A公開了一種癌癥治療性多肽納米膠束，所述多肽能夠抑制癌癥遷移，該多肽靶向于細(xì)胞表面CXCR4受體，而本發(fā)明所提供的多肽靶向于CXCL12/CXCR4這條趨化軸中趨化因子CXCL12這一部分，在多肽濃度較低時(shí)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的多肽及其應(yīng)用，該多肽抑制劑與CXCL12能夠特異性結(jié)合，親和力較高，并且可以引起CXCL12二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，從而阻斷CXCL12與其受體CXCR4的結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞等的遷移。為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為SEQIDNO.1-6所示的氨基酸序列；所述氨基酸序列如下：SEQIDNO：1：GVSLSYDCGCDFFRSDV；SEQIDNO：2：RRRGGSRGDGVSLSYDCGCDFFRSDV；SEQIDNO：3：DDDGGSRGDGVSLSYDCGCDFFRSDV；SEQIDNO：4：GGRGDLDWIQRYLRDA；SEQIDNO：5：RRRGGRGDLDWIQRYLRDA；SEQIDNO：6：DDDGGRGDLDWIQRYLRDA。本發(fā)明針對(duì)CXCL12的結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵片段的序列，設(shè)計(jì)合成了一種特異性識(shí)別CXCL12的多肽，該多肽作用于CXCL12之后可以引起CXCL12二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，因此該多肽可以作為變構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合到CXCL12的變構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)上，引起CXCL12構(gòu)象的改變，從而影響CXCL12與CXCR4正構(gòu)位點(diǎn)(orthostericsite)的構(gòu)象，阻斷CXCL12與其受體CXCR4的結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞的遷移。第二方面，本發(fā)明提供了一種DNA片段，其包含編碼第一方面所述多肽的核苷酸序列。第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，所述重組載體含有至少一個(gè)拷貝的如第二方面所述的DNA片段。第四方面，本發(fā)明提供了一種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞含有第三方面所述的表達(dá)載體。第五方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重組載體或如第四方面所述的重組細(xì)胞在抑制腫瘤細(xì)胞遷移的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞遷移包括細(xì)胞的橫向遷移和細(xì)胞的縱向遷移。優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為CXCR4高表達(dá)相關(guān)癌癥細(xì)胞。優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞和/或白血病細(xì)胞。本發(fā)明多肽抑制乳腺癌細(xì)胞的橫向遷移，抑制乳腺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞的縱向遷移。第六方面，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包括如如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重組載體或如第四方面所述的重組細(xì)胞。第七方面，本發(fā)明提供了如第六方面所述的組合物在制備治療癌癥相關(guān)藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述癌癥為CXCR4高表達(dá)相關(guān)癌癥。優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為乳腺癌和/或白血病。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，采用表面等離子激元共振(SPR)方法進(jìn)行檢測(cè)本發(fā)明多肽與CXCL12的親和力。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，采用圓二色譜(CD)方法進(jìn)行檢測(cè)本發(fā)明CXCL12的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，采用細(xì)胞劃痕方法進(jìn)行檢測(cè)腫瘤橫向遷移。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，采用transwell方法進(jìn)行檢測(cè)腫瘤縱向遷移。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明所述的多肽對(duì)CXCL12的親和力高，可以特異性地結(jié)合到CXCL12上，并且引起CXCL12二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，從而阻斷CXCL12與其受體CXCR4的結(jié)合，抑制癌癥的遷移；(2)本發(fā)明多肽具有作為治療或輔助性治療癌癥的藥物的潛力，尤其是作為針對(duì)乳腺癌和白血病這兩種疾病的治療和輔助性治療藥物。附圖說明圖1為本發(fā)明多肽SEQIDNO：4(W4)對(duì)CXCL12誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞橫向遷移的抑制作用結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明多肽SEQIDNO：4(W4)對(duì)CXCL12誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞橫向遷移的抑制作用結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明多肽SEQIDNO：4(W4)對(duì)CXCL12誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞縱向遷移的抑制作用結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明多肽SEQIDNO：4(W4)對(duì)CXCL12誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞縱向遷移的抑制作用結(jié)果圖；圖5為本發(fā)明多肽SEQIDNO：1-6(W1-6)對(duì)CXCL12誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞縱向遷移的抑制作用結(jié)果圖；圖6為本發(fā)明多肽SEQIDNO：1-6(W1-6)對(duì)CXCL12誘導(dǎo)U937細(xì)胞縱向遷移的抑制作用結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明多肽SEQIDNO：4(W4)與CXCL12結(jié)合及其對(duì)CXCL12與MCF-7細(xì)胞結(jié)合的抑制作用結(jié)果圖，其中，7(a)圖表示CXCL12結(jié)合到MCF-7細(xì)胞表面的量，7(b)圖表示CXCL12與W4相互作用后，結(jié)合到MCF-7細(xì)胞表面的量明顯降低；7(c)圖表示W(wǎng)4在MCF-7細(xì)胞表面幾乎沒有結(jié)合；圖8為本發(fā)明多肽SEQIDNO：4(W4)與CXCL12結(jié)合及其對(duì)CXCL12與MDA-MB-231細(xì)胞結(jié)合的抑制作用結(jié)果圖，其中，8(a)圖表示CXCL12結(jié)合到MDA-MB-231細(xì)胞表面的量，8(b)圖表示CXCL12與W4相互作用后，結(jié)合到MDA-MB-231細(xì)胞表面的量明顯降低；8(c)圖表示W(wǎng)4在MDA-MB-231細(xì)胞表面幾乎沒有結(jié)合。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和白血病細(xì)胞系HL-60、U937均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。除非特別指明，以下實(shí)施例中所用水溶液的溶劑均為無菌超純水。除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的磷酸鹽緩沖液(PBS)均為1×PBS溶液。實(shí)施例1：多肽的合成按照下表序列合成多肽(由上海科肽生物科技有限公司合成，純度為98％)，實(shí)驗(yàn)前配制成合適濃度的母液。表1合成的多肽名稱序列編號(hào)W1GVSLSYDCGCDFFRSDVSEQIDNO：1W2RRRGGSRGDGVSLSYDCGCDFFRSDVSEQIDNO：2W3DDDGGSRGDGVSLSYDCGCDFFRSDVSEQIDNO：3W4GGRGDLDWIQRYLRDASEQIDNO：4W5RRRGGRGDLDWIQRYLRDASEQIDNO：5W6DDDGGRGDLDWIQRYLRDASEQIDNO：6實(shí)施例2：多肽與CXCL12的親和力實(shí)驗(yàn)將W1-W6六條多肽以及抗CXCL12的抗體(RayBiotech，美國)配置成1mg/mL的水溶液，取5μL溶液滴在羧基化的SPR芯片(Plexera，美國)上，通過氨基酸縮合反應(yīng)將多肽和抗體固定在SPR芯片上，作為固定相。然后將濃度分別為50nM、100nM和200nM的CXCL12(R&DSystems，美國)的PBS溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行SPR分析，并計(jì)算平衡解離常數(shù)，結(jié)果如下表所示。表2多肽和CXCL12抗體對(duì)CXCL12的親和力從表2中可以看出多肽W1-W6與CXCL12有較強(qiáng)的親和力，并且與CXCL12抗體的結(jié)合常數(shù)相近。實(shí)施例3：W4多肽對(duì)CXCL12二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響配置含有不同濃度W4多肽的5μM的CXCL12蛋白的水溶液，之后將溶液遷移到0.1cm光程的超薄石英比色皿中，在190-260nm內(nèi)掃描溶液的CD(J-1500，JASCO，日本)光譜，掃描速度為200nm/min，帶寬為2nm，并且波長(zhǎng)間隔為0.5nm。同一樣品測(cè)量三次取平均值，并且扣除W4多肽本身的測(cè)量信號(hào)。之后使用JASCO軟件分析二級(jí)結(jié)構(gòu)。表3W4多肽對(duì)CXCL12二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響如表3所示，隨著W4多肽的加入，CXCL12的螺旋結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檎郫B和無規(guī)卷曲，說明W4與CXCL12的相互作用可以會(huì)引起CXCL12二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。實(shí)施例4：W4多肽對(duì)CXCL12誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞橫向遷移的抑制作用在六孔板中，每孔使用2mL含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)培養(yǎng)5×105個(gè)MCF-7細(xì)胞，將六孔板在37℃、5％CO2條件的孵箱中培養(yǎng)24h，MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)至臨近90％融合時(shí)，用10μL無菌槍頭在培養(yǎng)板的孔中沿直線劃痕，然后用PBS溶液將細(xì)胞輕柔的洗滌3遍，后每孔加入含有100ng/mL的CXCL12以及不同濃度W4多肽的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后的0h、24h用10×鏡頭的顯微鏡(IX71，奧林巴斯，日本)觀察細(xì)胞移動(dòng)情況以及劃痕寬度的變化，計(jì)算細(xì)胞遷移率，只加入CXCL12組的細(xì)胞遷移寬度設(shè)為100％。如圖1所示，加入W4多肽可以有效地抑制MCF-7細(xì)胞被CXCL12誘導(dǎo)的橫向遷移。實(shí)施例5：W4多肽對(duì)CXCL12誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞橫向遷移的抑制作用在六孔板中，每孔使用2mL含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)培養(yǎng)3×105個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞，將六孔板在37℃、5％CO2條件的孵箱中培養(yǎng)24h，MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)至臨近90％融合時(shí)，用10μL無菌槍頭在培養(yǎng)板的孔中沿直線劃痕，然后用PBS溶液將細(xì)胞輕柔的洗滌3遍，后每孔加入含有100ng/mL的CXCL12以及不同濃度W4多肽的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后的0h、24h用10×鏡頭的顯微鏡觀察細(xì)胞移動(dòng)情況以及劃痕寬度的變化，計(jì)算細(xì)胞遷移率，只加入CXCL12組的細(xì)胞遷移寬度設(shè)為100％。如圖2所示，加入W4多肽可以有效地抑制MDA-MB-231細(xì)胞被CXCL12誘導(dǎo)的橫向遷移。實(shí)施例6：W4多肽對(duì)CXCL12誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞縱向遷移的抑制作用收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，將200μL含有1×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基加入transwell小室(直徑為8μm的PET微孔濾膜，密理博，瑞士)的上室，下室加入800μL含有100ng/mL的CXCL12以及不同濃度W4多肽的培養(yǎng)基。24孔培養(yǎng)板在37℃、5％CO2條件的孵箱中培養(yǎng)24h后取出transwell小室，用棉簽小心擦除濾膜上室面的未遷移細(xì)胞，用結(jié)晶紫溶液固定遷移到小室膜下表面的細(xì)胞并染色20min，清水沖洗后用10×顯微鏡(DMI3000B，徠卡，德國)觀察遷移的細(xì)胞。每個(gè)小室膜按照上下左右中的方位取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)遷移的細(xì)胞數(shù)N，取平均值后計(jì)算細(xì)胞遷移率，只加入CXCL12組的細(xì)胞遷移數(shù)設(shè)為100％。如圖3所示，加入W4多肽可以有效地抑制MCF-7細(xì)胞被CXCL12誘導(dǎo)的縱向遷移。實(shí)施例7：W4多肽對(duì)CXCL12誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞縱向遷移的抑制作用收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，將200μL含有1×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基加入transwell小室(直徑為8μm的PET微孔濾膜)的上室，下室加入800μL含有100ng/mL的CXCL12以及不同濃度W4多肽的培養(yǎng)基。24孔培養(yǎng)板在37℃、5％CO2條件的孵箱中培養(yǎng)24h后取出transwell小室，用棉簽小心擦除濾膜上室面的未遷移細(xì)胞，用結(jié)晶紫溶液固定遷移到小室膜下表面的細(xì)胞并染色20min，清水沖洗后用10×顯微鏡觀察遷移的細(xì)胞。每個(gè)小室膜按照上下左右中的方位取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)遷移的細(xì)胞數(shù)N，取平均值后計(jì)算細(xì)胞遷移率，只加入CXCL12的細(xì)胞遷移數(shù)設(shè)為100％。如圖4所示，加入W4多肽可以有效地抑制MDA-MB-231細(xì)胞被CXCL12誘導(dǎo)的縱向遷移。實(shí)施例8：W1-W6多肽對(duì)CXCL12誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞縱向遷移的抑制作用收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，將200μL含有2×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基加入transwell小室(直徑為8μm的PET微孔濾膜)的上室，下室加入800μL含有200ng/mL的CXCL12以及不同濃度W4多肽的培養(yǎng)基。24孔培養(yǎng)板在37℃、5％CO2條件的孵箱中培養(yǎng)24h后取出transwell小室，計(jì)數(shù)每個(gè)下室遷移的細(xì)胞數(shù)目N，并且計(jì)算細(xì)胞遷移率，只加入CXCL12組的細(xì)胞遷移數(shù)設(shè)為100％。如圖5所示，加入W4多肽可以有效地抑制HL-60細(xì)胞被CXCL12誘導(dǎo)的縱向遷移。實(shí)施例9：W1-W6多肽對(duì)CXCL12誘導(dǎo)U937細(xì)胞縱向遷移的抑制作用收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞，將200μL含有2×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基加入transwell小室(直徑為5μm的PET微孔濾膜)的上室，下室加入800μL含有200ng/mL的CXCL12以及不同濃度W4多肽的培養(yǎng)基。24孔培養(yǎng)板在37℃、5％CO2條件的孵箱中培養(yǎng)24h后取出transwell小室，計(jì)數(shù)每個(gè)下室遷移的細(xì)胞數(shù)目N，并且計(jì)算細(xì)胞遷移率，只加入CXCL12組的細(xì)胞遷移數(shù)設(shè)為100％。如圖6所示，加入W4多肽可以有效地抑制U937細(xì)胞被CXCL12誘導(dǎo)的縱向遷移。實(shí)施例10：W4多肽與CXCL12結(jié)合對(duì)CXCL12與MCF-7細(xì)胞結(jié)合的抑制效應(yīng)將1mL含有1×105個(gè)MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)基加入玻底培養(yǎng)皿中，過夜待細(xì)胞貼壁后，將含有1μM異硫氰酸羅丹明B(RBITC，北京安必奇生物科技有限公司)標(biāo)記的CXCL12、1μM異硫氰酸熒光素(FITC，上?？齐纳锟萍加邢薰?標(biāo)記的W4以及同時(shí)含有1μMRBITC-CXCL12和1μMFITC-W4的培養(yǎng)基分別加入培養(yǎng)皿，37℃作用1h后用PBS洗去未結(jié)合的蛋白和多肽，加入細(xì)胞核染料Hoechst.33342(西格瑪奧德里奇，美國)染色10min，在40×共聚焦顯微鏡(LSM760，蔡司，德國)下拍照。如圖7(a)和7(b)所示，W4加入之后，結(jié)合到MCF-7細(xì)胞表面的RBITC-CXCL12的量明顯減少，并且圖7(c)顯示FITC-W4在MCF-7細(xì)胞表面幾乎沒有結(jié)合，這說明W4多肽是通過與CXCL12相互作用從而抑制了MCF-7細(xì)胞的遷移，而不是與細(xì)胞表面CXCR4結(jié)合的效果。實(shí)施例11：W4多肽與CXCL12結(jié)合對(duì)CXCL12與MDA-MB-231細(xì)胞結(jié)合的抑制效應(yīng)將1mL含有1×105個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞的培養(yǎng)基加入玻底培養(yǎng)皿中，過夜待細(xì)胞貼壁后，將含有1μMRBITC-CXCL12、1μMFITC-W4以及同時(shí)含有1μMRBITC-CXCL12和1μMFITC-W4的培養(yǎng)基分別加入培養(yǎng)皿，37℃作用1h后用PBS洗去未結(jié)合的蛋白和多肽，加入細(xì)胞核染料Hoechst.33342染色10min，在40×共聚焦顯微鏡下拍照。如圖8(a)和8(b)所示，W4加入之后，結(jié)合到MDA-MB-231細(xì)胞表面的RBITC-CXCL12的量明顯減少，并且圖8(c)顯示FITC-W4在MDA-MB-231細(xì)胞表面幾乎沒有結(jié)合，這說明W4多肽是通過與CXCL12相互作用從而抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移，而不是與細(xì)胞表面CXCR4結(jié)合的效果。上述實(shí)驗(yàn)顯示：本發(fā)明所述的多肽與CXCL12可以特異性結(jié)合，親和力較高，并且該多肽作用于CXCL12之后可以引起CXCL12二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，從而阻斷CXCL12與其受體CXCR4的結(jié)合，抑制癌癥的遷移。該多肽為癌癥遷移的抑制提供了可行的治療方法。申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實(shí)施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3