本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，涉及一組新型肽，特別涉及在醫(yī)學中應用的具有鎮(zhèn)痛作用的肽或它們藥學上可以接受的鹽。此外，本發(fā)明還涉及該組肽用于制備藥物組合物。

背景技術：

2000年，美國約州立大學Frederick Sachs博士從一種智利狼蛛(Chilean tarantula)毒液中成功分離出多肽GsMTx-4(Sachs F，et a.，J Gen Physiol.115，Po583-598，2000)，有報道指出，這是一種對機械力敏感離子通道具有特異抑制作用的多肽。GsMTx-4被發(fā)現(xiàn)可以用于阻止由細胞腫脹產(chǎn)生的充血性心力衰竭，特別在肺、肝、腿等部位(Sachs F et al.，JGP 2000)。也有報告指出GsMTx-4可以抑制兔子心房顫動而不對心臟的其它功能產(chǎn)生影響，因此它可以用于治療心臟病(Sachs，F(xiàn).et al.，Nature 409，pp 35～36，2001；Hamill，0.P.，Martinac，B.，Physiol.Rev.81，pp 685～740，2001.)。此外，GsMTx-4可能可以治療腦瘤(Sachs，F(xiàn).et al.，J.Gen.Physiol.115，pp 583～598，2000)。

上述提到的多肽GsMTx-4，含有34個氨基酸，其分子量為1，094Da，其中有6個半胱氨酸殘基，形成三對半胱氨酸結(jié)(ICK：Inhibitor cysteine Knot motif)結(jié)構(gòu)的特性(Robert.et al.，J.Biol.Chem.277(37)：34443-34450，2002)。這種結(jié)構(gòu)限制了它化學合成和生物合成時的產(chǎn)量，原因在于難以折疊成正確的構(gòu)象。雖然最近有專利用于指導在酵母中合成全長GsMTx-4多肽，但成本和產(chǎn)量仍然是藥物開發(fā)的瓶頸。

發(fā)明人于2016年12月9日申請的專利(申請?zhí)枺?01611128087.6)中通過比較GsMTx-4、GsMTX-2等多種含半胱氨酸結(jié)(ICK)的多肽序列，并通過對大鼠疼痛模型的行為學檢測，確定了在GsMTx-4多肽中起鎮(zhèn)痛作用的藥效團(位于環(huán)2的結(jié)構(gòu)域)，發(fā)現(xiàn)了GsMTx-4的部分多肽片段有不遜于全長的抑制疼痛的作用。其原理是多肽GsMTx-4和GsMTx-2氨基酸序列僅有11％相同(28％相似)，但同屬機械力敏感離子通道的特異抑制劑，其它幾種毒素氨基酸序列雖然與GsMTx-4同源性更高(比如：GsMTx-4與Hanatoxin的氨基酸序列有近28％相同，37％相似)，但卻是其它不同類型離子通道的阻斷劑。但其限于對Loop 2中一個或多個氨基酸被刪除、置換、或添加后仍具有鎮(zhèn)痛作用的多肽，如下結(jié)構(gòu)式所示：

對于環(huán)3(Loop 3)中一個或多個氨基酸被刪除、置換、或添加后是否仍具有鎮(zhèn)痛作用，目前尚未可知。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于上述和/或現(xiàn)有生物醫(yī)藥技術領域中對鎮(zhèn)痛作用藥物開發(fā)存在的問題，提出了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明其中一個目的是提供一組具有鎮(zhèn)痛作用的短肽。

為解決上述技術問題，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了如下技術方案：一組具有鎮(zhèn)痛作用的肽，其具有如(1)或(2)所示的氨基酸序列：(1)如序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；(2)如序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或，它們藥學上可以接受的鹽。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：在首端和末端半胱氨酸存在的基礎上，如序列表SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，一個或多個氨基酸被刪除、置換、或添加后仍具有鎮(zhèn)痛作用的多肽或，它們藥學上可以接受的鹽。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：如序列表SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的具有鎮(zhèn)痛作用的氨基酸序列或它們藥學上可以接受的鹽，其中，首端和末端的兩個半胱氨酸形成環(huán)。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：其通過化學合成或通過重組技術獲得。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：其與蛋白融合。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：其與聚合物偶聯(lián)。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：所述肽與載體連接。

本發(fā)明另外一個目的是提供一種具有鎮(zhèn)痛作用的藥物組合物。

為解決上述技術問題，根據(jù)本發(fā)明的另外一個方面，本發(fā)明提供了如下技術方案：一種藥物組合物，其特征在于，包括，(1)有效量的作為活性成分的所述的肽；(2)選擇性的藥學上可接受的載體。

作為本發(fā)明所述藥物組合物的一種優(yōu)選方案，其中：所述藥學上可接受的載體選自：溶劑、稀釋劑、懸浮劑、乳化劑、抗氧化劑、藥學防腐劑、著色劑、香味劑、介質(zhì)、油性基底、賦形劑中的一種或幾種。

本發(fā)明還有一個目的是提供一組具有鎮(zhèn)痛作用的肽或它們藥學上可以接受的鹽或藥物組合物在鎮(zhèn)痛方面的應用。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)GsMTx-4的部分多肽片段有不遜于全長的抑制疼痛的作用，并通過對大鼠疼痛模型的行為學檢測，確定了在GsMTx-4多肽中起鎮(zhèn)痛作用的藥效團(結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明由此對GsMTx-4的Loop 3中一個或多個氨基酸的刪除、置換、或添加后形成多肽，然后對所述多肽篩選出具有鎮(zhèn)痛作用的多肽。通過多肽對大鼠傷害性疼痛模型的檢測結(jié)果，發(fā)明人證實得到了具有鎮(zhèn)痛作用的多肽短鏈系列，完成本發(fā)明。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中：

圖1是利用足底局部注射給藥方式，SEQ ID No.1和嗎啡對大鼠痛覺過敏的鎮(zhèn)痛效應示意圖。為使數(shù)據(jù)可信度高，我們用普通生理鹽水(Saline)作為負性對照、嗎啡(Morphine)作為陽性對照。

圖2是利用腹腔注射給藥方式，SEQ ID No.1和嗎啡對大鼠痛覺過敏的鎮(zhèn)痛效應示意圖。

圖3是短鏈多肽SEQ ID No.1與全長GsMTx-4通過足底(A)、腹腔(B)注射方式鎮(zhèn)痛效應對比。

圖4是SEQ ID No.2分別通過足底(A)或腹腔(B)注射給藥方式時對大鼠鎮(zhèn)痛作用示意圖，圖中分別是用普通生理鹽水(Saline)以相同劑量通過足底(A)或腹腔(B)注射給藥方式時作為多肽鎮(zhèn)痛效果的負性對照。

圖5是在沒有建立疼痛模型時，SEQ ID No.1(A)和SEQ ID No.2(B)對正常大鼠疼痛閾值沒有影響的示意圖，其中，嗎啡作為對正常大鼠疼痛閾值具有影響的陽性對照。

圖6是對比實施例的鎮(zhèn)痛作用示意圖，圖中，對比例的多肽P13573并沒有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。

在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。

其次，此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。

根據(jù)一般約定書寫本文提及的所有的肽序列，其中N端氨基酸在左邊，而C端氨基酸在右邊。在兩個氨基酸殘基之間的短線指示肽鍵。

為了描述本發(fā)明的方便，使用各種氨基酸殘基的常規(guī)和非常規(guī)縮寫。這些縮寫是本領域技術人員熟悉的，但是為了清楚在下面列出：

Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；

Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；

Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝組氨酸；Ile＝I＝異亮氨酸；

Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝賴氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；

Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝絲氨酸；

Thr＝T＝蘇氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y(jié)＝酪氨酸；

Val＝V＝纈氨酸；Cys＝C＝半胱氨酸。

本公開內(nèi)容的特征是用于治療疼痛(例如急性疼痛、慢性疼痛、癌癥痛等所有疼痛類型)的新型肽。這些肽可以降低疼痛敏感性，因此具有鎮(zhèn)痛作用。該肽可產(chǎn)生長效鎮(zhèn)痛和/或抗傷害感受作用。

疼痛和傷害感受

疼痛是一種綜合感覺、情緒和認知的現(xiàn)象，對于遭受疼痛的患者，不一定存在身體上的病理變化?？蓮母拍钌蠈⑻弁匆暈橛扇齻€層次水平構(gòu)成：感覺-分辨組成(例如部位、強度、性質(zhì))、動機-情緒組成(例如抑郁、焦慮)和認知-評價組成(例如關于疼痛起因和意義的認知)。疼痛的感知的支持基礎在于感覺神經(jīng)元(傷害性感受器)系統(tǒng)和具體響應潛在有害的組織損害性刺激的神經(jīng)傳入途徑。所述傳入途徑的活動受非傷害感受病理生理(例如神經(jīng)系統(tǒng)處理異常)或心理因素的影響。

傷害感受性疼痛機制：在臨床上，如果可以推知疼痛與隨組織損傷引發(fā)過程而來的傷害性感受器刺激和隨后的感覺神經(jīng)纖維活化有關，則疼痛可稱為“傷害感受”。傷害感受性疼痛包括受有害刺激而正常激活傷害感受系統(tǒng)。傷害感受由四個過程組成：轉(zhuǎn)導、傳遞、感知和調(diào)節(jié)。

傷害感受過程始于響應有害刺激時在外周傷害性感受器上的轉(zhuǎn)導(去極化)。傳遞是由此將這些刺激沿初級傳入傷害感受軸突行進到脊髓然后再行進到高級中心的過程。只有當沖動到達腦部時，才能通過腦力識別為疼痛。這就是感知。

最終的疼痛感知取決于所述傳入系統(tǒng)的活動及其在多個神經(jīng)系統(tǒng)水平上的調(diào)節(jié)。疼痛調(diào)節(jié)取決于內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)能系統(tǒng)(opioidergic system)和其它疼痛調(diào)節(jié)系統(tǒng)的活動。在阿片樣物質(zhì)能系統(tǒng)中，通過內(nèi)源性阿片樣化合物與阿片樣物質(zhì)受體(主要為μ、δ和κ阿片樣物質(zhì)受體)結(jié)合介導痛覺缺失。內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)分布廣，并與已知調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)、響應應激和疼痛的系統(tǒng)密切相關。在這個復雜的系統(tǒng)中，5-羥色胺和去甲腎上腺素等其它神經(jīng)遞質(zhì)也在內(nèi)源疼痛調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，但本發(fā)明涉及多肽可能是直接通過抑制某些特殊力敏感離子通道的活性，從而阻止動作電位在神經(jīng)中的產(chǎn)生或進一步傳遞到達鎮(zhèn)痛的作用，這也是為什么我們的肽不需要通過血腦屏障即可發(fā)揮藥效的作用機制。

鎮(zhèn)痛肽

本公開內(nèi)容提供具有鎮(zhèn)痛性質(zhì)并可用于治療疼痛(例如急性疼痛、慢性疼痛或癌痛等)的肽。該肽可具有抗傷害感受作用。

本文所述的肽可在生物系統(tǒng)中制備或經(jīng)化學合成。

為了在生物系統(tǒng)中產(chǎn)生肽，可通過重組DNA技術制備肽。例如，可將含有本文所述肽的編碼核酸序列的表達載體導入生物系統(tǒng)(例如細菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動物表達系統(tǒng))中，并應用標準技術進行表達。然后應用標準純化技術(例如應用基于肽的物理或化學性質(zhì)的分離技術或者親和純化技術)，從生物系統(tǒng)(例如細胞或培養(yǎng)基)中將肽純化出來。這類技術為本領域所知。參見例如Current Protocols inMolecular Biology第3版，John Wiley和Sons，Inc，New York，NY。

肽可用化學方法合成，例如采用液相合成或固相合成。這類技術是本領域的標準技術，參見例如Atherton，E.，Sheppard，R.C.SolidPhase peptide synthesis：Apractical approach.IRL Press，Oxford，England，1989；Stewart J.M.，Young，J.D.Solid phase peptide synthesis，第2版，Pierce Chemical Company，Rockford，1984；Carpino，L.A.19921-Hydroxy-7-azabenzotriazole.An efficient Peptide Coupling Additive(1-羥基-7-氮雜苯并三唑：一種有效的肽偶聯(lián)添加劑).J.Am.Chem.Soc.115，4397-4398。通過將一個氨基酸的羧基端或C端與另一個的氨基端或N端偶聯(lián)來合成肽。

液相合成法：液相肽合成法是經(jīng)典的肽合成方法。它可用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)肽。

固相合成法：固相肽合成法(SPPS)是目前普遍公認的在實驗室以合成方式制備肽和蛋白質(zhì)的方法。SPPS允許例如難以在細菌中表達的天然肽的合成、摻入非天然氨基酸、肽/蛋白質(zhì)主鏈修飾和含有D-氨基酸的D-蛋白質(zhì)和D-肽的合成?？砂凑绽绫疚乃龇椒ㄒ允止みM行合成，或者采用自動合成儀進行合成。

本發(fā)明的其中一個目的在于提供一組具有鎮(zhèn)痛作用的肽(如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2)。而該組肽的制備方法是通過合成、純化、洗脫，使得最終合成肽的樣品純度>99％，并采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)測定其分子量。

當然，本領域技術人員能夠了解到，在首端和末端半胱氨酸存在的基礎上，SEQ ID No.1或SEQ ID No.2任一肽中，一個或多個氨基酸被刪除、置換、或添加后仍具有鎮(zhèn)痛作用的多肽或，它們藥學上可以接受的鹽，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的肽其通過化學合成或通過重組技術獲得，其不但可以與蛋白融合也可以與聚合物偶聯(lián)，還可以與載體連接。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該組肽具有特殊的結(jié)構(gòu)，SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的任一具有鎮(zhèn)痛作用的氨基酸序列或它們藥學上可以接受的鹽，其中，首端和末端的兩個半胱氨酸形成環(huán)。如下述結(jié)構(gòu)：

實施例(本發(fā)明涉及所有實驗均并采取雙盲測試方法)

1.實驗動物、儀器和試劑

成年Sprague-Dawley雄性大鼠(8周以上)，體重180g-220g，購買于山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

角叉菜膠(Carrageenan，簡寫為Carr)為美國sigma公司產(chǎn)品，分別配制1％角叉菜膠(0.1g角叉菜膠溶于10ml 0.9％生理鹽水溶液中，分裝至10個EP管)和2％角叉菜膠(0.2g角叉菜膠溶于10ml 0.9％生理鹽水溶液中，分裝至10個EP管)，于-20℃保存，使用前半小時取出放置冰上。

GsMTx-4從美國alomone labs購買，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所有多肽均用高溫滅菌后的去離子水(DD water)配制成5mM或10mM的母液，并分裝在EP管后于-80℃保存，使用時用生理鹽水稀釋至實驗所需的濃度。

38500-PAM壓力應用測量系統(tǒng)(Μgo Basile Biological Research Apparatμs，Comerio–Varese，Italy)由兩部分組成，一部分為手持單元，另一部分為綜合電子單元。手持單元為力傳感器，該力傳感器是根據(jù)Randall-Selitto測痛儀而設計，綜合電子單元可自動記錄施加在大鼠左側(cè)后足足底最大的機械縮足反射閾值。

2.炎性痛模型的制備：我們采取兩種不同的炎性痛模型制備方法，分別用于足底和腹腔藥物注射的鎮(zhèn)痛效果進行檢測：

2-1：6μl 1％角叉菜膠炎性痛模型：按照文獻(Alessandri-Haber N，et al.Neurosci.Vol 29(19)，pp 6217-6288，2009)；介紹的方法制備角叉菜膠炎性痛模型。該法用于足底注射給藥方式藥物鎮(zhèn)痛效果的檢測。簡單地說：從大鼠左后足2、3趾之間進針，注射1％角叉菜膠，注射量為6μl，該注射濃度可誘導產(chǎn)生痛覺過敏，即：在注射后半小時內(nèi)大鼠足底即出現(xiàn)腫脹和痛覺閾值的降低。機械縮足反射閾值在50gf以下者作為角叉菜膠炎性痛造模成功大鼠。炎性閾值在50gf以上的炎性模型大鼠給予剔除。

2-2：50μl 2％角叉菜膠炎性痛模型：按照文獻(Seung Pyo Park，et al.2008.Pain.137:208-217)介紹的方法制備2％角叉菜膠炎性痛模型。該法用于腹腔注射給藥方式藥物鎮(zhèn)痛效果的檢測。簡單地說：從大鼠左后足2、3趾之間進針，注射2％角叉菜膠50μl，該注射濃度可誘導產(chǎn)生痛覺過敏，即：在注射后半小時內(nèi)大鼠足底即出現(xiàn)較嚴重的腫脹和痛覺閾值的降低。機械縮足反射閾值降低在50gf以下的作為角叉菜膠炎性痛造模合格大鼠。炎性閾值在50gf以上的炎性模型大鼠給予剔除。

3.實驗分組和動物處理

所有實驗大鼠從山東濟南朋悅動物有限公司購入的6周齡SD大鼠。實驗大鼠適應性飼養(yǎng)2～4周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～26℃，濕度30％～50％，適應性飼養(yǎng)后每次選擇體重180～220g的大鼠10～12只，測量大鼠左側(cè)后足機械縮足閾值，取每只大鼠測量5次的均值作為該大鼠炎性造模前基礎值(Baseline，縮寫為BL)，剔除基礎值差異大或?qū)C械刺激無反應的大鼠；然后按照文獻介紹的方法于大鼠左側(cè)后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(用于足底注射加藥方式)或50μl 2％角叉菜膠(用于腹腔注射加藥方式)，1小時后檢測大鼠左側(cè)后足機械性縮足閾值，剔除造模失敗(炎性閾值在50gf以上)的大鼠，將造模成功的大鼠平均分為藥物組和生理鹽水組兩組。以上操作中凡是有出現(xiàn)造模不成功、大鼠被剔除的情況，再加做實驗以確保每組用于統(tǒng)計數(shù)據(jù)的大鼠至少為5～8只。

4.GsMTx-4及其短肽在炎性誘發(fā)痛覺過敏中的作用——機械縮足反射閾值的測定

4.1足底注射嗎啡、GsMTx-4及短肽抑制炎性痛覺過敏的測定

用38500-PAM壓力應用測量系統(tǒng)測定大鼠的左后足機械性縮足閾值來評價GsMTx-4及其短肽在大鼠機械性痛覺過敏中的作用。所有大鼠行為學測試之前需對大鼠進行縮足訓練，直到每只大鼠都會縮足后開始記錄大鼠基礎縮足閾值。將當天需測的10～12只大鼠放入同一鼠籠中，在各只大鼠的尾巴上從1～10(或12)進行編號，而后讓大鼠在測量房間適應30min，待大鼠安靜后開始測試。根據(jù)Randall-Selitto測痛儀設計的力傳感器安裝在38500-PAM壓力應用測量系統(tǒng)的一個手持裝置單元中。測量系統(tǒng)設置最小的力值為0.45gf，最大的力值為450gf。操作人員運用38500-PAM壓力應用測量系統(tǒng)依次按編號數(shù)字大小依次測量每只大鼠左側(cè)后足機械縮足閾值。具體方法為先將手持單元中的錐形尖端放在大鼠左側(cè)后足足底中間部位，接著以恒定力率(30gf/s)給大鼠左側(cè)后足施加一個力，所施加力的最大時間為15s，15s時間內(nèi)當受試大鼠后足回縮時，操作員停止施力，此時電子單元將自動記錄施加在大鼠左側(cè)后足足底最大的機械性縮足閾值，若受試大鼠15s后左側(cè)后足仍未出現(xiàn)縮足反射，系統(tǒng)會自動報警，操作者即停止測量，10min后重復測量。若某只大鼠多次15s后左側(cè)后足未出現(xiàn)縮足反射，剔除此大鼠。依次按照大鼠尾巴編號數(shù)字大小依次測量，重復測量5次(每次刺激間隔時間為10min)，取5次實驗的平均值，。測量完畢后足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠，建立大鼠炎性疼痛模型。注射角叉菜膠1小時后檢測大鼠左側(cè)后足機械性縮足閾值，剔除閾值大小異常的大鼠(造模失敗)。將炎性閾值較高與閾值較低的大鼠混合平均分為2組：藥物組和生理鹽水組，每組5～6只，使得兩組大鼠炎性閾值分布相似。藥物組在大鼠左側(cè)后足足底皮內(nèi)注射1.2μg/5μl GsMTx-4(用前稀釋到合適濃度)或其中一種短肽，或5mg/kg嗎啡，或大鼠左側(cè)后足足底皮下相同位置注射5μl等體積的生理鹽水，注藥后分別于1h、3h、5h、7h及24h檢測各組大鼠左側(cè)后足機械縮足反射閾值，每只大鼠均重復測試5次(每次測試間隔時間為10min)，取5次縮足反射閾值的平均值為該大鼠實際縮足反射閾值(單位為：g)。

注：以上操作中凡是出現(xiàn)造模不成功、大鼠被剔除的情況，再加做實驗以確保每組用于實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)的大鼠至少為5～8只。

4.2腹腔注射GsMTx-4及其短肽抑制炎性痛覺過敏的測定

腹腔注射GsMTx-4及其短肽抑制炎性痛覺過敏的方法步驟與足底注射相似，但有幾點不同：

(1)該測量系統(tǒng)設置最小的力值為0.75gf，最大的力值為750gf

(2)考慮到腹腔注射嗎啡可能導致機械性縮足閾值大幅度上升，將所施加力的最大時間調(diào)為25s

(3)藥物組腹腔注射270μg/kg GsMTx-4或其中一種短肽或10mg/kg嗎啡，生理鹽水組的腹腔注射量為等質(zhì)量的無菌生理鹽水。

基于上述實驗，圖1為SEQ ID No.1和嗎啡通過足底皮下注射給藥方式(注射體積均為6μl)對大鼠痛覺過敏抑制效果的示意圖。其中，A圖所示為事先在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(Carr)誘導大鼠炎性模型后，在大鼠足底腫脹部位注射5μl的生理鹽水1h，3h，5h，7h后，大鼠機械縮足閾值與炎性閾值無明顯差異；而與造模前機械縮足反射閾值相比，等體積量(5μl)的SEQ ID No.1(B)或嗎啡(C)都明顯降低了大鼠機械縮足反射閾值。比如大鼠足底腫脹部位皮下注射等體積的短肽SEQ ID No.1(注射量為1.2μg/5μl)1h，3h，5h，7h后，大鼠機械縮足閾值均有增高，且在注藥后3h達到最高。注意嗎啡在給藥1h后藥效達最大值，但大鼠機械縮足閾值的增高大大超過了大鼠基線(Base Line，簡寫為BL)時的機械縮足閾值。我們認為超過基線部分可能與嗎啡的成癮性、賴受性和其毒性均相關。

圖2是SEQ ID No.1和嗎啡通過腹腔注射給藥方式(注射體積為50μl)對大鼠痛覺過敏抑制作用的對比示意圖。我們得到了和前面圖1(足底注射)相似的對痛覺過敏抑制作用，但SEQ ID No.1具有比從足底皮內(nèi)注射給藥的方式時更強的抑制作用，即：與由角叉菜膠(Carr：注射量為50μl 2％)誘導的炎性疼痛閾值相比，短肽SEQ ID No.1(注射量為50μl，270μg/Kg)注射1h，3h，5h，7h后，大鼠機械縮足閾值均有顯著增高，且在3h后達到最大抑制效果(B)，，而生理鹽水沒有作用(A)。此外，嗎啡(注射量為10mg/Kg)在注射1h后對大鼠痛覺過敏抑制作用達到最高，雖然比SEQ ID No.1(注射量為270μg/Kg)的鎮(zhèn)痛強(見C)，但是同足底注射給藥方式結(jié)果類似：嗎啡的鎮(zhèn)痛作用對大鼠機械縮足閾值的提高已經(jīng)大大超過了大鼠基線閾值(Base Line，簡寫為BL)，我們認為這部分與嗎啡的毒性相關。此外，3h時嗎啡的鎮(zhèn)痛作用已經(jīng)迅速下降到基線指(BL)。由于本發(fā)明提出的即使具有鎮(zhèn)痛作用的短鏈多肽對正常大鼠痛覺均沒有影響(見圖5)，因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的多肽有可能發(fā)展成為治療痛覺過敏的更好的鎮(zhèn)痛藥物或混合劑。

圖3是SEQ ID No.1與全長GsMTx-4鎮(zhèn)痛作用的對比示意圖。SEQ ID No.1和GsMTx-4通過足底注射方式給藥時，鎮(zhèn)痛作用在3h后稍弱(圖中A)，但當兩者通過腹腔注射方式給藥時，3h后SEQ ID No.1與全長GsMTx-4的鎮(zhèn)痛效果沒有明顯差異(圖中B)。

圖4是SEQ ID No.2分別通過足底(A)、腹腔(B)給藥方式的鎮(zhèn)痛作用示意圖。圖4中最上端兩圖是注射等體積的生理鹽水時的負性對照。其中，A圖表示與大鼠左后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(Carr)后大鼠機械縮足反射閾值相比，足底皮下注射SEQ ID No.2(注射量為1.2μg/5μl)1h，3h，5h，7h后，大鼠機械縮足閾值增高，且在注藥后3h達到最高。B圖示意在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射50μl 2％角叉菜膠(Carr)后1h，腹腔注射SEQ ID No.2(注射量為270μg/Kg)1h，3h，5h，7h后大鼠機械縮足閾值均有增高，注藥3h時抑制作用最強，很明顯腹腔注射給藥的鎮(zhèn)痛作用強于足底局部給藥。

圖5圖示SEQ ID No.1和SEQ ID No.2對正常大鼠的機械縮足閾值沒有影響。A，B圖分別圖示在正常大鼠左后足足底皮下直接注射SEQ ID No 1(A)或SEQ ID No.2(B)(注射量均為1.2μg/5μl，該劑量為全長GsMTx-4和SEQ ID No.1通過足底注射方式給藥時抑制大鼠痛覺過敏的最大劑量)1h，3h，5h后，均不影響正常大鼠的機械縮足反射閾值。C圖示在正常大鼠左后足足底皮下直接注射嗎啡(注射量為5mg/kg，該劑量通常為嗎啡用藥量的最小劑量)1h后，嗎啡進一步強烈抑制正常大鼠的機械縮足反射閾值一倍以上，這個超出基礎閾值(BL)的部分為嗎啡發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時，具有的成癮性和賴受性有關。該組實驗從反面再次證明本發(fā)明涉及的多肽對正常大鼠疼痛閾值沒有影響，因而沒有副(毒性)作用的特性。

本發(fā)明所需的具有鎮(zhèn)痛作用的肽需要進行篩選，參見圖6，圖6是對比實施例的鎮(zhèn)痛作用示意圖，圖中，對比例的多肽P13573(WACNPNAAACA)并沒有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

本發(fā)明的化合物可以以藥用鹽的形式提供。優(yōu)選的鹽的實例是與藥用有機酸以及聚合酸形成的那些和與無機酸形成的鹽，所述有機酸如乙酸、乳酸、馬來酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、水楊酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸或雙羥萘酸，所述聚合酸如鞣酸或羧甲基纖維素，所述無機酸如氫鹵酸(例如，鹽酸、硫酸或磷酸等)。可以使用本領域技術人員已知的獲得藥用鹽的任何方法。

本公開內(nèi)容的肽可以配制成例如給予受治療者以治療疼痛的藥物組合物。肽可以單獨給予，或者可在同一組合物中或作為單獨的組合物，與其它疼痛療法聯(lián)合給予。

藥物組合物通常包括藥學上可接受的載體。本文所用的“藥學上可接受的載體”包括任何及所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。組合物可包括藥學上可接受的鹽，例如酸加成鹽或堿加成鹽。

藥物制劑技術是普遍接受的技術，更多詳情參見例如Gennaro，The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams&Wilkins(2000)(ISBN：0683306472)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN：0683305727)；以及Kibbe，Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association，第3版(2000)(ISBN：091733096X)。

在一個實施方案中，所述肽與賦形劑材料(例如鹽水、氯化鈉、磷酸氫二鈉七水合物、磷酸二氫鈉)和穩(wěn)定劑一起配制。還可在例如緩沖溶液中按合適的濃度提供。

藥物組合物可呈各種形式。這些包括例如液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液劑(例如注射和輸注溶液劑)、分散劑或混懸劑、片劑、丸劑、散劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式可取決于既定的給藥方式和治療應用。

可通過胃腸外方式(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射)給予組合物。本文所用術語“胃腸外給藥”和“經(jīng)胃腸外給予”是指腸內(nèi)和局部給藥以外的給藥方式，通常經(jīng)注射給藥，包括而不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外及胸骨內(nèi)注射和輸注。

可經(jīng)腸內(nèi)途徑給予組合物，例如通過消化道，例如經(jīng)口服給藥。例如，可以片劑、膠囊劑、囊片劑、丸劑、散劑、滴劑、混懸劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑或其它口服劑型給予組合物。

腸內(nèi)途徑包括經(jīng)胃飼管、十二指腸飼管或胃造口或直腸給予，例如以栓劑或灌腸劑形式的組合物。

組合物可局部給藥，例如在疼痛部位。局部給藥包括例如表皮、鼻內(nèi)、吸入和陰道給藥。可將組合物給予皮膚(例如燒傷、皰或破口)、唇、牙齦、牙、口腔、眼、耳、甲床或咽喉等，例如疼痛部位。局部給藥的組合物可為乳膏劑、凝膠劑、洗劑或軟膏劑等。

藥物組合物可包括“治療有效量”的本文所述的肽。該有效量可根據(jù)所給藥物(例如肽)的效果確定，或者如果使用一種以上藥物時，則根據(jù)聯(lián)用效果確定。治療有效量的藥物還可根據(jù)以下因素而變化：例如受治療者的疼痛類型、疾病狀況、年齡、性別和體重以及藥物在受治療者體內(nèi)引起所需反應(例如改善疼痛)的能力。治療有效量也是其中組合物的治療有益作用超過任何毒性或有害作用的量。

基于本發(fā)明，將來有可能獲得一種新型的、用于鎮(zhèn)痛的多肽藥物，或含有該多肽的有效鎮(zhèn)痛混合物。本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：

1.原生蜘蛛毒素GsMTx-4多肽在水中形成四個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，合成時要求多肽必須折疊成保持該原生多肽的空間結(jié)構(gòu)才具有相應藥效，因此合成工序繁瑣成本高。本發(fā)明找到了原生多肽中起鎮(zhèn)痛作用的藥效團，因此降低了多肽的合成成本，使在工業(yè)上大批量生產(chǎn)變得高效而廉價。

2.目前已知的多肽均是通過血腦屏障才能發(fā)揮其藥效功能，但由于多肽本身的特點它們又不能直接通過血腦屏障，因此這已是目前多肽開發(fā)為藥物的瓶頸。由于本發(fā)明的多肽可以直接通過局部注射或腹腔注射方式發(fā)揮陣痛作用，因此，我們的發(fā)明使藥物的轉(zhuǎn)化進一步成為可能。

3.由于本發(fā)明縮減了多肽長度，降低了免疫原性，更易于人體吸收。在臨床應用中更能充分發(fā)揮藥效。由于該多肽對正常大屬的疼痛閾值沒有影響，和嗎啡等藥物相比無成癮性、無賴藥性和無毒性。因此本發(fā)明可能被開發(fā)為臨床上廣泛應用的鎮(zhèn)痛藥物。

應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。

SEQUENCE LISTING

<110> 徐州醫(yī)科大學

<120> 一組具有鎮(zhèn)痛作用的肽及其藥物組合物和應用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Cys Ala Arg Pro Lys Leu Lys Cys

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Arg Pro Lys Leu Lys Cys

1 5