專(zhuān)利名稱(chēng)：茜草科類(lèi)型環(huán)肽,以其為活性成分的藥物組合物,其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一類(lèi)茜草科類(lèi)型環(huán)肽，作為NF-K B信號(hào) 通路抑制劑，以其為有效成分的藥物組合物，其制備方法及其在制備抗單純皰疹病毒I型 (HSV-I)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
NF-K B信號(hào)通路廣泛參與多種生物學(xué)效應(yīng)，包括免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、病毒侵染、 細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展等，是高等生物細(xì)胞中最重要的信號(hào)通路之一。核轉(zhuǎn)錄 因子NF-κ B是免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和機(jī)體發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它在細(xì)胞中的定位 與活力受到嚴(yán)格的調(diào)控?；罨腘F-K B參與調(diào)控多種因子的基因表達(dá)，如致炎癥反應(yīng)因 子 NO、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8，趨化因子 MCP-1、RANTES，細(xì)胞黏附分子 ICAM-1、VCAM-I 等。如果這些調(diào)節(jié)發(fā)生異常，就會(huì)導(dǎo)致微生物侵染、自身免疫疾病、發(fā)育異常和腫瘤等病理 現(xiàn)象。NF-K B家族蛋白在體內(nèi)各種類(lèi)型細(xì)胞中普遍存在，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要有5個(gè)成 員，分別為 RelA(P65),RelB, c-Rel,NF- κ Bl (ρ50/ρ105)和 NF-κ Β2 (ρ52/ρ100)。各成員可 形成同型或異型二聚體而存在，最常見(jiàn)的是ρ65/ρ50 二聚體。NF- κ B信號(hào)通路主要包括一 條經(jīng)典信號(hào)通路和兩條非經(jīng)典信號(hào)通路。目前已有許多NF-K B信號(hào)通路抑制劑被發(fā)現(xiàn)，按來(lái)源主要分為天然產(chǎn)物、合成化 合物、SiRNA、多肽以及蛋白(病毒、細(xì)菌、真菌)等。根據(jù)抑制劑在通路中的作用位置和作 用機(jī)制不同可以分為作用于IKK復(fù)合體上游、直接針對(duì)IKK復(fù)合體、IKK與細(xì)胞核之間、細(xì)胞 核內(nèi)等四類(lèi)。此外，NF-kB通路抑制劑已有被FDA批準(zhǔn)上市作為臨床藥物的成功案例，例 如用于治療腫瘤的三氧化二砷(ATO)，Thalidomide，蛋白酶體抑制劑PS341 (bortezomib) 以及治療內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥相關(guān)疾病的TNF-α單克隆抗體Remicade和Humira。但 是，其他作用模式、結(jié)構(gòu)新穎的小分子抑制劑的臨床應(yīng)用報(bào)道還較少，同時(shí)該通路在相關(guān)疾 病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)制有待更加深入闡明。所以發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的NF-K B信 號(hào)通路小分子抑制劑用于治療該通路相關(guān)疾病，或發(fā)現(xiàn)特異性的工具分子或探針?lè)肿尤リU 明該通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機(jī)制，具有十分重要的學(xué)術(shù)意義和很好的應(yīng)用前景。^-itM^M^ (herpes simplex virus, HSV) Μ^'Μ^'ΜΜ^ (herpesviridae) 中α _皰疹病毒亞科的胞膜DNA病毒。臨床上，HSV具有兩個(gè)血清型，分別為HSV-I和HSV-2。 HSV-I主要引起人腰部以上的黏膜和神經(jīng)系統(tǒng)感染，所致疾病有角膜炎、皰疹性腦炎、腦膜 炎、唇皰疹和齦口炎等。HSV-2主要引起腰以下生殖器感染，是生殖器皰疹(GH)的主要病原 體。HSV先天感染和新生兒感染，可引起胎兒先天畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)和新生兒皰疹性疾病。HSV 對(duì)成人感染率高達(dá)60% 90%，其最顯著的生物學(xué)特性是能在原發(fā)感染后在體內(nèi)潛伏，并 持續(xù)存在。高熱、免疫抑制、手術(shù)等因素的刺激可激活潛伏的HSV，引起癥狀性發(fā)作，或無(wú)癥 狀性的病毒播散。HSV還能夠引起細(xì)胞癌變，其單獨(dú)感染，或與人乳頭瘤病毒(HPV)的共感 染是宮頸癌發(fā)生的主要原因之一。
目前尚未有成功的HSV疫苗上市。用于治療HSV感染的藥物以核苷類(lèi)衍生物為 主，主要是通過(guò)與病毒DNA聚合酶正常底物競(jìng)爭(zhēng)從而抑制病毒DNA合成而達(dá)到抗病毒目的， 如阿昔洛偉(ACV)，泛昔洛偉(FCV)，賁昔洛偉(PCV)和更昔洛偉(GCV)等。這些藥物對(duì)治 療HSV具有很好的療效，但因作用機(jī)制單一，隨著使用的頻率和劑量的增加，耐藥性和毒副 作用的問(wèn)題日益突出。藥用植物是開(kāi)發(fā)新藥的重要來(lái)源，從廣泛的天然產(chǎn)物中尋找新的抗 皰疹病毒藥物，尤其是具有不同作用機(jī)制的藥物，具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)有茜草科類(lèi)型環(huán)肽作為NF- κ B信號(hào)通路抑制劑的報(bào)道，此外，茜 草科類(lèi)型環(huán)肽對(duì)單純皰疹病毒I型的活性抑制作用也未見(jiàn)報(bào)道；茜草科類(lèi)型環(huán)肽在茜草科植物中的分離純化較為困難，最重要的原因是茜草屬植 物中富含蒽醌類(lèi)色素，且色素極性范圍廣，從脂溶性色素到水溶性色素都有，很難使此類(lèi)色 素與環(huán)肽類(lèi)成分分開(kāi)?，F(xiàn)有技術(shù)中，從茜草屬植物中分離環(huán)肽類(lèi)成分已公開(kāi)發(fā)表如下方 法(1) 70年代，茜草科寒丁子屬寒丁子花、莖、葉依次用甲醇和乙腈提取，再用甲醇和異丙 醚低溫析出沉淀，之后用制備TLC分離得到環(huán)肽bouvardin和deoxybouvardin (RA-V)。參 JAL Jolad, S.D. et al, Bouvardinand deoxybouvardin, antitumor cyclic hexapeptides from Bouvardiaternifolia(Rubiaceae) ,J. Am. Chem. Soc.，1977，99 (24)，8040-8044。其缺 點(diǎn)是乙腈溶劑作為提取溶劑價(jià)格較貴，不適于工業(yè)生產(chǎn)；低溫沉淀技術(shù)可控性和重現(xiàn)性不 好；僅用制備TLC技術(shù)難以得到微量環(huán)肽。(2) 90年代，茜草科茜草屬小紅參的根莖用甲醇 提取后，甲醇浸膏經(jīng)活性碳、硅膠或烷基化硅膠柱色譜分離純化，得到環(huán)肽RA-V、RA-XII和 RY-II。參見(jiàn)鄒澄等，小紅參的抗癌環(huán)己肽配糖體，云南植物研究，1993，15(4)，399-402。 其缺點(diǎn)是活性碳對(duì)樣品的吸附性強(qiáng)，容易損失樣品，且難以得到微量環(huán)肽。(3)近年來(lái)，茜 草科茜草屬茜草的根用甲醇提取后，甲醇浸膏加水混懸后用氯仿萃取，氯仿部分依次用硅 膠、氧化鋁、氨丙基鍵和硅膠色譜柱層析得到環(huán)肽富集部分。此環(huán)肽富集部分用甲醇重結(jié) 晶，再結(jié)合各種層析材料包括HPLC對(duì)結(jié)晶或母液進(jìn)行分離純化，得到一系列環(huán)肽，包括大 量和微量環(huán)妝。參見(jiàn)Lee, J. E. et al. Structures of cytotoxicbicyclic hexapeptides, RA-XIX, -XX, -XXI, and -XXII, from Rubiacordifolia L. Tetrahedron. ,2008,64, 4117-4125。其缺點(diǎn)在于氧化鋁對(duì)樣品的吸附性強(qiáng)，氨丙基鍵和硅膠材料價(jià)格較貴，實(shí)驗(yàn)室 和工業(yè)上不常用，甲醇重結(jié)晶技術(shù)可控性和重現(xiàn)性不好。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一類(lèi)茜草科類(lèi)型環(huán)肽 化合物；提供制備該類(lèi)化合物的方法，該提取分離方法可控性和重現(xiàn)性好，樣品損失少，成 本較低，操作方便，可分離得到微量環(huán)肽，溶劑可以反復(fù)回收利用，也適用于工業(yè)生產(chǎn)；本發(fā) 明的目的還在于提供以茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物為有效成分的藥物組合物；該類(lèi)化合物作為 新型NF-K B信號(hào)通路抑制劑，以及在制備抗單純皰疹病毒I型的藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物，由1個(gè)D- α -丙氨酸，1個(gè)L- α -丙氨酸，3個(gè)取代的N-甲 基-L- α -酪氨酸和1個(gè)其它種類(lèi)的L- α -氨基酸經(jīng)肽鍵縮合而成，且6個(gè)氨基酸縮合成為 十八元環(huán)，其中2個(gè)鄰位的酪氨酸之間的苯環(huán)經(jīng)氧橋連接形成一個(gè)十四元環(huán)。本發(fā)明的環(huán)肽，優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物RA-V(I)、RA-I (2)、RA-XXIV(3)、 制備本發(fā)明上述茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物的方法，取茜草屬植物的根莖，經(jīng)干燥、粉 碎后，用甲醇回流充分提取；將甲醇浸膏加水混懸后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃??； 乙酸乙酯部分和正丁醇部分反復(fù)用硅膠、Sephadex LH-20, RP-18，硅膠H，HPLC各種層析柱 分離純化，再結(jié)合環(huán)肽的TLC檢測(cè)方法即得到茜草科類(lèi)型環(huán)肽。制備如下結(jié)構(gòu)式所示茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物RA-V(I)、RA-I (2)、RA-XXIV(3)、 RA-XII (4)、rubiyunnanin D (5)、rubiyunnanin C (6)、rubiyunnaninE (7)、rubiyunnanin F(8) ,rubiyunnanin G(9)和 rubiyunnanin H(IO)和 RY-II(Il)的方法，取小紅參的根蓮， 經(jīng)干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次，時(shí)間為每次1-4小時(shí)，提取液經(jīng)減壓濃縮得甲醇浸 膏。將甲醇浸膏加水混懸后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等體積各萃取三次，回收 溶劑得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分。將乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析，用100 0， 95 5,9 1,8 2,0 100的氯仿/甲醇梯度洗脫，薄層層析，結(jié)合環(huán)肽TLC檢測(cè)方法 合并其中的95 5、9 1和8 1含有環(huán)肽的部分。以下的每一步驟都須結(jié)合環(huán)肽TLC 檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行分離純化。合并后的浸膏再次經(jīng)硅膠柱層析，用70 1-8 2的氯仿/甲 醇梯度洗脫，根據(jù)環(huán)肽點(diǎn)的不同合并為六個(gè)組分Fr. l-Fr.6。Fr. 1組分經(jīng)硅膠柱層析，用 7:3-0: 1石油醚/丙酮為洗脫劑分離得到五個(gè)亞組分Fr. I-I-Fr. 1-5。其中Fr. 1_4經(jīng) Sephadex LH-20層析，1 1的氯仿/甲醇為洗脫劑，所富集的含有環(huán)肽的部分再經(jīng)硅膠H 反復(fù)層析，用6 4的石油醚/丙酮洗脫分離得到化合物RA-V(I)。Fr. 2組分經(jīng)硅膠柱層析， 95 5-9 1的氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到七個(gè)亞組分Fr. 2_l_Fr. 2_7。Fr. 2_4部分用 反相RP-18硅膠拌樣，經(jīng)RP-18柱層析，用20 80-90 10的甲醇/水梯度洗脫，得到六個(gè) 亞組分Fr. 2-4-1-Fr. 2_4_6。組分Fr. 2-4-2經(jīng)S印hadex LH-20層析，1 1的氯仿/甲醇 為洗脫劑，富集的環(huán)肽部分再次經(jīng)RP-18柱層析，30 70-50 50的甲醇/水梯度洗脫得到化合物RA-I (2)。組分Fr. 2-4-5同樣經(jīng)S印hadex LH-20層析，1 1的氯仿/甲醇為洗脫 劑，富集的環(huán)肽部分經(jīng)反相RP-18柱層析，20 80-40 60的甲醇/水梯度洗脫，含有環(huán)肽 部分再經(jīng)硅膠H反復(fù)層析，用20 1-10 1氯仿/甲醇洗脫分離得到化合物rubiyurmanin C(6)。Fr. 3組分經(jīng)硅膠柱層析，70 1-9 1的氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到五個(gè)亞組分 Fr. 3-1-Fr. 3-5 ；Fr. 3-3組分再次經(jīng)硅膠柱層析，1:1-0:1石油醚/丙酮梯度洗脫，含有 環(huán)肽部分經(jīng)S印hadex LH-20再富集，1 1氯仿/甲醇為洗脫劑，所富集的環(huán)肽部分經(jīng)硅膠 H反復(fù)純化，20 1氯仿/甲醇為洗脫劑，分離得到化合物RA-XXIV (3)。Fr. 4組分經(jīng)硅膠柱 層析，20 1-8 2乙酸乙酯/甲醇進(jìn)行梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組分Fr. 4-1-Fr. 4-4。 亞組分Fr. 4-3直接經(jīng)S印hadex LH-20進(jìn)行環(huán)肽富集，1 1氯仿/甲醇為洗脫劑。再經(jīng)硅 膠柱層析，95 5-0 1氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到七個(gè)亞組分Fr.4-3-l-Fr.4-3-7。 其中Fr. 4-3-5用反相RP-18硅膠拌樣，經(jīng)RP-18柱層析，40 60-60 40的甲醇/水梯 度洗脫，得到化合物RA-XII (4)。Fr. 4-3-7部分經(jīng)0DSHPLC半制備柱純化，33%乙腈和4%0 三氟乙酸為洗脫劑，得到化合物rubiyunnaninD(5)和rubiyunnanin E (7)。Fr. 5組分經(jīng)硅 膠柱層析，95 5-0 1氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組分Fr.5-l-Fr.5-4。亞 組分Fr. 5-3再經(jīng)硅膠柱層析，20 1-0 1乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組 分 Fr. 5-3-I-Fr. 5-3-4 亞組分 Fr. 5-3-2 和亞組分 Fr. 5-3-4 分別經(jīng) S印hadex LH-20 進(jìn) 行環(huán)肽富集，1 1氯仿/甲醇為洗脫劑。所得含有環(huán)肽部分再分別經(jīng)反相RP-18柱層析， 20 80-50 50的甲醇/水梯度洗脫進(jìn)行富集。亞組分Fr. 5-3-2所富集環(huán)肽部分經(jīng)ODS HPLC半制備柱分離純化，23%乙腈和4%。三氟乙酸為洗脫劑，得到化合物RY-II (11)。亞組 分Fr. 5-3-4所富集環(huán)肽部分經(jīng)ODS HPLC半制備柱分離純化，40%乙腈和4%。三氟乙酸為洗 脫劑，得到化合物rubiyunnanin G(9)和rubiyunnanin H(IO)。Fr. 6組分經(jīng)硅膠柱層析， 9 1 0. 1-8 2 0.2氯仿/甲醇/水梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組分Fr. 6-1-Fr. 6-4。 亞組分Fr. 6-3再經(jīng)硅膠柱層析，20 1-8 2乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，合并得到含有環(huán) 肽的部分Fr. 6-3-2。Fr. 6-3-2經(jīng)反相RP-18柱層析，10 90-40 60的甲醇/水梯度洗 脫得到六個(gè)亞組分 Fr. 6-3-2-1-Fr. 6-3-2-6。Fr. 6-3-2-1 經(jīng) S印hadex LH-20 層析，1 1 氯仿/甲醇為洗脫劑富集環(huán)肽，再經(jīng)ODS HPLC半制備柱純化，28%乙腈和4%。三氟乙酸為洗 脫劑，得到化合物rubiyunnanin F (8)。
以本發(fā)明的上述茜草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成分的NF-K B信 號(hào)通路抑制劑。用于治療單純皰疹病毒I型的藥物組合物，其中含有治療有效量的本發(fā)明的上述 菌草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供了含有治療有效量的上述結(jié)構(gòu)式所示的茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物 RA-V(I)、RA-I (2)、RA-XXIV (3)、RA-XII (4)、rubiyunnanin D (5)、rubiyunnaninC (6)、 rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(IO)禾口 RY-II (11)或其藥理學(xué)上容許的鹽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明同時(shí)提供了本發(fā)明的茜草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽在制備 NF-κ B信號(hào)通路抑制劑中的應(yīng)用；以及茜草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽在制備治 療單純皰疹病毒I型相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)云南特有種茜草科茜草屬植物小紅參進(jìn)行系統(tǒng)的環(huán)肽化學(xué)成分研究， 利用多種分離純化手段，包括正反相硅膠柱層析，Sephadex LH-20凝膠層析，HPLC半制備 等，從中獲得了一系列茜草科類(lèi)型環(huán)肽。之后，對(duì)所有環(huán)肽類(lèi)成分在LPS和IFN-γ誘導(dǎo) 的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW 264. 7模型上檢測(cè)NO生成抑制活性、用熒光素酶報(bào)告基因方 法檢測(cè)NF-K B通路抑制活性，以及在基于重組報(bào)告病毒HSV/Blue的體外評(píng)價(jià)模型上檢 測(cè)抗 HSV-I 活性。發(fā)現(xiàn)其中 RA-V(I)、RA-I (2)、RA-XXIV(3)、RA-XII (4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、 rubiyunnanin H(IO)和RY-II (11)為新型NF-κ B信號(hào)通路抑制劑；而且還具有很好的體 外抑制單純皰疹病毒I型的活性，可用于制備抗單純皰疹病毒I型的藥物。本發(fā)明的所述茜草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽，可以列舉例如與鹽酸、硝 酸、硫酸、磷酸、氫溴酸等無(wú)機(jī)酸，或者馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、甲磺酸、 對(duì)-苯甲磺酸、己二酸、棕櫚酸、單寧酸等有機(jī)酸，鋰，鈉、鉀等堿金屬，鈣、鎂等堿土金屬，賴(lài)氨酸等堿性氨基酸成的鹽。本發(fā)明所述的治療單純皰疹病毒I型相關(guān)疾病的藥物組合物，由茜草科類(lèi)型環(huán)肽 化合物與藥學(xué)上可接受的載體制備的藥物劑型包括片劑、膠囊、口服液、針劑、注射用凍干 劑或粉針劑等。由于茜草科類(lèi)型環(huán)肽可從小紅參以及同屬植物中提取分離，而片劑、膠囊、 口服液、針劑、注射用凍干劑或粉針劑等藥物劑型的制備也是本領(lǐng)域的常規(guī)知識(shí)。因此。由 茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物與相應(yīng)載體制備的各種藥物劑型也能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)。上文中所述的藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、 賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；黏合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯 烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面 活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂黏土 ；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂、 以及聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明化合物可以以組合物的形式通過(guò)口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式 施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、 膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其他液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥 時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照 藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所 需的劑型。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0. 99. 5%的活性成分，最優(yōu)選含有 重量比為0. 5% 95%的活性成分。本發(fā)明化合物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類(lèi)型 和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以是0. 01 10mg/kg體重，優(yōu)選0. 1 5mg/kg體重?？梢?一次或多次施用。本發(fā)明茜草科類(lèi)型環(huán)肽提取方法的優(yōu)益性在于，首先提取分離思路具有新穎性， 成功利用色譜層析技術(shù)將蒽醌色素和茜草科類(lèi)型環(huán)肽分離。概括地說(shuō)，利用Sephadex LH-20的分子篩原理，可分開(kāi)一部分與環(huán)肽分子量相差很大的蒽醌類(lèi)成分，再利用反相 RP-18色譜柱的吸附層析原理，成功分離得到含色素較少的環(huán)肽部分，再結(jié)合各種層析材料 包括HPLC分離純化即得環(huán)肽純品。其次，僅利用實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)上常規(guī)的層析材料，包括正 反相硅膠、Sephadex LH-20和HPLC等，不必運(yùn)用特殊層析材料如氨丙基鍵和硅膠，也避免 運(yùn)用吸附性較強(qiáng)的活性碳和氧化鋁等層析材料；沒(méi)有使用可控性和重現(xiàn)性較差的沉淀析出 或重結(jié)晶法，在實(shí)際操作中，發(fā)現(xiàn)因樣品成分復(fù)雜，色素重，很難得到沉淀或結(jié)晶進(jìn)行進(jìn)一 步分離；最后，環(huán)肽的分離過(guò)程中必須結(jié)合環(huán)肽的TLC檢測(cè)方法(參見(jiàn)周俊，譚寧華，科 學(xué)通報(bào)，2000，45 (10) ,1047-1051)。總之，本發(fā)明提取分離方法可控性和重現(xiàn)性好，樣品損 失少，成本較低，操作方便，可分離得到微量環(huán)肽，溶劑可以反復(fù)回收利用，也適用于工業(yè)生 產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明的茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物的制備方法流程圖；圖2為本發(fā)明的茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物抗HSV-I活性實(shí)驗(yàn)；圖3為本發(fā)明的茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物對(duì)vero細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但并不以 此來(lái)限定本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的改進(jìn)都屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物RA-V(I) ,RA-I (2) ,RA-XXIV (3) ,RA-XII (4) ,rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnaninF(8)、rubiyunnanin G(9)、 rubiyunnanin H(IO)和RY-II(Il)的制備方法及其結(jié)構(gòu)鑒定取小紅參的根莖100kg，經(jīng)干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次(100LX3次)，時(shí) 間為3h、3h、2h，提取液經(jīng)減壓濃縮得甲醇浸膏21kg。將甲醇浸膏加水混懸后，依次用乙 酸乙酯和正丁醇充分萃取，等體積各萃取三次(30LX3次)，回收溶劑得到乙酸乙酯部分 6. 4kg、正丁醇部分8kg和水部分5kg。將乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/甲醇梯度 洗脫(100 0,95 5,9 1,8 2,0 100)，薄層層析，結(jié)合環(huán)肽TLC檢測(cè)方法合并其 中的95 5,9 1和8 1含有環(huán)肽的部分。以下的每一步驟都須結(jié)合環(huán)肽TLC檢測(cè) 方法來(lái)進(jìn)行分離純化。合并后的浸膏再次經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/甲醇(70 1-8 2) 梯度洗脫，根據(jù)環(huán)肽點(diǎn)的不同合并為六個(gè)組分(Fr. I-Fr. 6)。Fr. 1 (139g)組分經(jīng)硅膠柱 層析，石油醚/丙酮(7 3-0 1)為洗脫劑分離得到五個(gè)亞組分(Fr. l-1-Fr. 1-5)。其 中Fr. l-4(30g)經(jīng)S印hadex LH-20層析，氯仿/甲醇(1 1)為洗脫劑，所富集的含有 環(huán)肽的部分再經(jīng)硅膠H反復(fù)層析，用石油醚/丙酮(6 4)洗脫分離得到RA-V(I) (4g)。 Fr. 2 (257g)組分經(jīng)硅膠柱層析，氯仿/甲醇(95 5-9 1)進(jìn)行梯度洗脫，合并得到七 個(gè)亞組分(Fr. 2-I-Fr. 2-7)。Fr. 2_4(104g)部分用反相RP-18硅膠拌樣，經(jīng)RP-18柱層 析，20 80-90 10的甲醇/水梯度洗脫，得到六個(gè)亞組分(Fr. 2-4-1-Fr. 2-4-6)。組 分Fr.2-4-2(18g)經(jīng)S印hadexLH-20層析，氯仿/甲醇(1 1)為洗脫劑，富集的環(huán)肽部 分再次經(jīng)RP-18柱層析，30 70-50 50的甲醇/水梯度洗脫得到RA-I (2) (145mg)。組 分Fr. 2-4-5 (IOg)同樣經(jīng)S印hadex LH-20層析，氯仿/甲醇(1 1)為洗脫劑，富集的環(huán) 肽部分經(jīng)反相RP-18柱層析，20 80-40 60的甲醇/水梯度洗脫，含有環(huán)肽部分再經(jīng)硅 膠H反復(fù)層析，用氯仿/甲醇(20 1-10 1)洗脫分離得到rubiyunnanin C (6) (34mg)。 Fr. 3 (94g)組分經(jīng)硅膠柱層析，氯仿/甲醇(70 1-9 1)進(jìn)行梯度洗脫，合并得到五個(gè)亞 組分(Fr. 3-1-Fr. 3-5)。Fr. 3-3(12g)再次經(jīng)硅膠柱層析，石油醚/丙酮(1 1-0 1)梯 度洗脫，含有環(huán)肽部分經(jīng)S印hadex LH-20再富集，氯仿/甲醇(1 1)為洗脫劑。所富集的 環(huán)肽部分經(jīng)硅膠H反復(fù)純化，氯仿/甲醇(20 1)為洗脫劑，分離得到RA-XXIV(3) (290mg)。 Fr. 4 (365g)組分經(jīng)硅膠柱層析，乙酸乙酯/甲醇(20 1_8 2)進(jìn)行梯度洗脫，合并得到 四個(gè)亞組分(Fr. 4-I-Fr. 4-4)。亞組分Fr. 4-3 (50g)直接經(jīng)S印hadex LH-20進(jìn)行環(huán)肽富 集，氯仿/甲醇(1 1)為洗脫劑。再經(jīng)硅膠柱層析，氯仿/甲醇(95 5-0 1)進(jìn)行梯 度洗脫，合并得到七個(gè)亞組分(Fr. 4-3-1-Fr. 4-3-7)。其中Fr. 4-3-5 (2lg)用反相RP-18 硅膠拌樣，經(jīng)RP-18柱層析，40 60-60 40的甲醇/水梯度洗脫，得到RA-XII (4) (6g)。 Fr. 4-3-7 (46mg)部分經(jīng)ODS HPLC半制備柱純化，33 %乙腈和4%。三氟乙酸為洗脫劑，得到 rubiyunnanin D (5) (9mg)和 rubiyunnanin E (7) (29mg)。Fr. 5 (87g)組分經(jīng)硅膠柱層析，氯 仿/甲醇(95 5-0 1)進(jìn)行梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組分(Fr. 5-1-Fr. 5-4)。亞組分Fr. 5-3 (35g)再經(jīng)硅膠柱層析，乙酸乙酯/甲醇(20 1-0 1)進(jìn)行梯度洗脫，合并得到四 個(gè)亞組分(Fr. 5-3-1-Fr. 5-3-4)。亞組分 Fr. 5-3-2 (4. 5g)和亞組分 Fr. 5_3_4(6g)分別經(jīng) Sephadex LH-20進(jìn)行環(huán)肽富集，氯仿/甲醇(1 1)為洗脫劑。所得含有環(huán)肽部分再分別經(jīng) 反相RP-18柱層析，20 80-50 50的甲醇/水梯度洗脫進(jìn)行富集。亞組分Fr. 5_3_2所 富集環(huán)肽部分經(jīng)ODS HPLC半制備柱分離純化，23%乙腈和4%。三氟乙酸為洗脫劑，得到化 合物RY-II (11) (57mg)。亞組分Fr. 5-3-4所富集環(huán)肽部分經(jīng)ODS HPLC半制備柱分離純化， 40% 乙腈和 4%。三氟乙酸為洗脫劑，得到 rubiyunnanin G(9) (6mg)和 rubiyunnanin H(IO) (8mg)。Fr. 6 (151g)組分經(jīng)硅膠柱層析，氯仿/甲醇/水(9 1 0. 1-8 2 0. 2)進(jìn) 行梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組分(Fr. 6-1-Fr. 6-4)。亞組分Fr. 6_3 (27g)再經(jīng)硅膠柱層 析，乙酸乙酯/甲醇(20 1-8 2)進(jìn)行梯度洗脫，合并得到含有環(huán)肽的部分Fr. 6-3-2。 Fr. 6-3-2經(jīng)反相RP-18柱層析，10 90-40 60的甲醇/水梯度洗脫得到六個(gè)亞組分 (Fr. 6-3-2-1-Fr. 6-3-2-6)。Fr. 6-3-2-1 經(jīng) S印hadex LH-20 層析，氯仿 / 甲醇(1 1)為 洗脫劑富集環(huán)肽，再經(jīng)ODS HPLC半制備柱純化，28%乙腈和4%。三氟乙酸為洗脫劑，得到 rubiyunnanin F(8)(22mg)?；?合 物 rubiyunnanin D (5)、rubiyunnanin C (6)、rubiyunnanin E (7)、 rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)禾口 rubiyunnanin H(IO)的結(jié)構(gòu)式如下所不 rubiyunnanin D(5)、i rubiyunnaninF(8)、rubiyunnanin G(9)和 rubiyunnanin H(IO)的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)為rubiyunnanin D (5)白色無(wú)定型粉末；[a -149.7 (c 0.57，MeOH)； UV (MeOH) Amax (log ε )203(4· 69) ,276(3. 70) nm ；IR(KBr) vmax3421, 2938,1659，1516，1448， 1203，1138，838，722CHT1 ；for 1H and 13C NMR 數(shù)據(jù)，見(jiàn)^ 2 ；positive FABMS m/z 801 (10) [M+H]+ ；positive HRESIMS m/z 823. 3259 [M+Na]+，cacld for C41H48N6O11Na, 823. 3278。rubiyunnanin C(6)白色晶體；mp 253-254 "C ； [α -221.0 (c 0. 11, CHCl3:MeOH = 1:1)； UV (MeOH) Amax (log ε ) 203 (4. 80) , 277 (3. 78) nm ； IR (KBr) vmax3414, 2937，1737，1660，1514，1445，1209，1096，838，803CHT1 ;for 1H and 13C NMR 數(shù)據(jù)，見(jiàn)表 2; positive FABMS m/z 829(100)[M+H]+；positiveHRFABMS m/z 828.3713[M]+, cacld for. 3694。rubiyunnanin E (7)白色無(wú)定型粉末；[a -124.5 (c 0.58，MeOH)； UV(MeOH) Amax(log ε )204(4· 81) ,280(3. 87)nm ;IR(KBr)vmax3426,2938,1664，1515，1446， 1204,1134,839,801,722cm_1 ；for 1H and 13C NMR 數(shù)據(jù)，見(jiàn)表 2 positive FABMS m/ ζ 831 (50) [Μ+Η]+ ；positive HRESIMS m/z 853. 3391 [M+Na]+，cacld for C42H50N6O12Na, 853.3384。rubiyunnanin F (8)白色無(wú)定型粉末；[α ]2D5 -182. 5 (c 0. 37, MeOH)； UV(MeOH) Amax(log ε )203(4· 87) ,276(3. 80)nm ;IR(KBr)vmax3423,2932,1663，1512，1447， 1414,1248,1208,1075,839,803cm_1 ；for 1H and 13C NMR數(shù)據(jù)，見(jiàn)表3 ；positive FABMS m/z 976(92) [M+H]+ ；positive HRESIMS m/z976. 4334[M+H]+, cacld for C48H62N7O15,976. 4303。rubiyunnanin G(9)白色無(wú)定型粉末；[α -127.3 (c 0. 11，MeOH)； UV(MeOH) Amax(log ε )203(4· 57) ,277(3. 53)nm ;IR(KBr)vmax3440,2936,1658，1640，1517， 1449,1207,838,810cm_1 ；for 1H and 13C NMR 數(shù)據(jù)，見(jiàn)表 3 ;positive FABMS m/z 905(24) [M+H]+ ；positive HRESIMS m/z 927. 3734 [M+Na]+，cacld for C45H56N6O14Na, 927. 3752。rubiyunnanin H(IO)白色無(wú)定型粉末；[α f -244. 0 (c 0. 12，MeOH)； UV(MeOH) Amax(log ε )203(4· 81) ,276(3. 83)nm ;IR(KBr)vmax3424,2933,1657，1640，1512， 1248,1075cm-1 ；for 1H and 13C NMR 數(shù)據(jù)，見(jiàn)表 3 ;positiveFABMS m/z 935(95) [M+H]+ ； positive HRESIMS m/z 957. 3882 [M+Na]cacldfor C46H58N6O15Na, 957. 3857。表 1 rubiyunnanin D (5) ^rubiyunnanin C (6)禾口rubiyunnanin E (7)的1H NMR禾口 13CNMR 數(shù)據(jù)(C5D5N, δ in ppm, J in Hz) aData were measured at 125MHz. bData were measured at 500MHz.表 2 rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)禾口 rubiyunnanin H(IO)的1H NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)(CD3OD, δ in ppm, J in Hz)8910VSc3V^ca V0c "D-Ala1H4.49 (m)49.0 d4.45 (m)48.8 d4.48 (m)48.9 dP1.26 (d, 6.5)21.4 q1.23 (d，7.0)21.0q1.27 (overlap)20.8 qC=O173.7 s173.4 s173.8 sAA2α4.80 (m)49.5 d4.74 (m)45.6 d4.73 (m)45.5 dβ γ1.96 (m) 2.24 (m)27.41 31.9t1.29 (d, 7.0)16.4 q1.27 (overlap)16.6 qC=O173.7 s174.6 s174.4 sCONH2177.3 sTyr3a3.87 (overlap)68.8 d3.84 (dd, 11.0,5.0)68.8 d3.84 (m)68.6 dβα3.29 (m)34.013.18 (dd, 13.5,5.0)33.7t3.20 (m)33.7tPb y132.3 s3.25 (dd, 13.5,11.0)129.6 s131.6 sδ *27.11 (d, 8.5)131.5d6.98 (d, 8.5)131.4d7.07 (d, 8.8)131.5 dε *26.87 (d, 8.5)115.1 d6.73 (d, 8.5)116.8 d6.85 (d, 8.8)115.0dζ160.1 s158.4 s160.0 sC=O170.9 s171.1 s171.0 sNMe2.94 (3Η，s)40.5 q2.92 (s)40.3 q2.88 (s)40.3 qOMe (H) 3.75 (3H, s)55.7 q-3.75 (s)55.7 dAla4α4.73 (m)47.8 d4.74 (m)47.7 d4.73 (m)47.8 dβ1.10 (d，6.5)18.9 q1.08 (d, 6.5)18.8 q1.12 (d, 6.4)18.8qC=O173.0 s173.0 s172.6 siyr5α5.43 (dd, 11.5,2.5)55.6 d5.46 (dd, 11.5,3.0)55.7 d5.35(dd, 11.6, 3.2)56.0 dPa2.65 (br. d, 11.5)37.412.68 (dd, 11.5,3.0)37.412.69 (dd, 11.6,3.2)37.5 tPb 13.60 (m)136.9 s3.59 (m)137.0 s3.56 (m)136.9 sδα7.20 (dd, 8.5, 2.0)134.1 d7.21 (dd, 8.5,2.0)134.1 d7.14 (dd, 8.8, 2.0)134.8 dSb7.46 (br. d, 8.5)132.0 d7.47 (dd, 8.5,2.0)131.8d7.43 (dd, 8.4,2.0)131.1 dsa6.79 (dd, 8.5,2.0)125.2 d6.81 (dd, 8.5,2.5)125.1 d6.68 (dd, 8.8,2.4)124.9 dEb ζ7.28 (dd, 8.5, 2.0)127.4 d 159.7 s7.28 (dd, 8.5,2.5)127.2 d 159.8 s7.38 (dd, 8.4,2.4)127.6 d 160.5 sC=O171.4 s171.3 s171.8 sNMe3.06 (s)31.1 q3.06 (s)31.1 q3.05 (s)31.1 qTyr6α4.68 (dd, 12.0,3.5)58.7 d4.70 (dd, 11.5.4.0)58.6 d4.48 (overlap)64.4 dPa3.13 (m)36.513.08 (overlap)36.614.66 (d, 8.8)74.3 dPb T3.00 (dd, 18.0，12.0)131.6 s3.02 (m)132.3 s135.8 sδα6.65 (br. d，8.0)122.7 d6.66 (br. d, 8.5)122.6 d6.82 (dd, 8.4,2.0)124.3 d5b4.59 (br. s)115.8 d4.62 (d, 1.5)115.8d5.03 (d，2.0)117.4 dsa7.08 (d, 8.0)118.6 d7.09 (d, 8.5)118.7d7.11 (d, 8.4)118.2 d8b154.6 s154.6 s154.5 sζ145.4 s145.4 s147.3 sC=O172.1 s172.3 s170.9 sNMe2.59 (s)30.2 q2.61 (s)30.1 q2.31 (3H, s)32.0 qGlcΓ4.98 (d, 7.5)102.8 d4.98 (d, 7.5)102.8 d5.01 (d, 7.6)102.6 dT3.60 (m)74.9 d3.55 (m)74.9 d3.56 (m)74.8 d3'3.51 (m)77.9 d3.49 (m)77.9 d3.48 (m)77.8 d4'3.44 (overlap)71.4 d3.42 (overlap)71.3 d3.42 (overlap)71.3 d5，3.44 (overlap)78.2 d3.42 (overlap)78.2 d3.42 (overlap)78.2 d6'3.70 (dd, 12.0，4.5)62.513.70 (m)62.513.69 (dd，12.0,4.8)62.513.87 (overlap)3.88 (d, 12.0)3.87 (m)
100MHz. Data were measured at 500MHz. cData wereaData were measured at measured at 400MHz.實(shí)施例2:本發(fā)明茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物RA-V (1)、RA-I (2)、RA-XXIV (3)、RA-XII (4)rubiyunnanin D (5)、rubiyunnanin C (6)、rubiyunnanin E (7)、rubiyunnaninF (8)、 rubiyunnanin G(9) ,rubiyunnanin H(IO)和 RY-II(Il)在 LPS 和 IFN-γ 誘導(dǎo)的小鼠腹腔 巨噬細(xì)胞系RAW 264. 7模型上能夠明顯抑制NO生成。實(shí)驗(yàn)原理、方法和結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)原理編碼一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,N0S)的基因是NF_kB 信號(hào)通路的直接靶基因之一，當(dāng)細(xì)胞遭受微生物內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)等刺激時(shí)會(huì)激活NF-k B 信號(hào)通路，從而生成大量的誘導(dǎo)型N0S，一氧化氮合酶通過(guò)催化其底物L(fēng)-精氨酸，生成NO和 L-瓜氨酸，NO在水溶液中以亞硝酸離子的形式存在。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LPS和IFN- γ刺激RAW 264. 7細(xì)胞，然后應(yīng)用Griess試劑測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中N02_水平以反映誘導(dǎo)型NOS的總 體酶活。實(shí)驗(yàn)方法⑴接種細(xì)胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液將RAW 264. 7細(xì)胞配成單 個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔2X IO5個(gè)細(xì)胞接種到96孔板。(2)化合物處理細(xì)胞貼壁后，加入LPS 和IFN- γ誘導(dǎo)一氧化氮生成，同時(shí)加入待測(cè)化合物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。(3)顯色吸 取細(xì)胞上清液并加入Griess試劑顯色，570nm檢測(cè)吸光度。同批細(xì)胞應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞 存活量。(4)記錄結(jié)果，以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞NO生成量和存活率為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，應(yīng)用 Reed and Muench法計(jì)算化合物的IC5tl值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3茜草科類(lèi)型環(huán)肽1-11對(duì)NO生成的半數(shù)抑制濃度
17 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1-11均具有抑制NO生成的活性，其中RA-V(I)，RA-I (2) 和RA-XII (4)的活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照蛋白酶體抑制劑MG-132，RA-V(1)活性最強(qiáng)，IC5tl值達(dá)到 50nM。
實(shí)施例3 本發(fā)明茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物RA-V (1)、RA-I⑵、RA-XXIV (3)、RA-XII (4)、 rubiyunnanin D (5)、rubiyunnanin C (6)、rubiyunnanin E (7)、rubiyunnanin F (8)、 rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(IO)和 RY-II(Il)用熒光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè) NF- κ B通路抑制活性，進(jìn)一步確證環(huán)肽分子確實(shí)作用于NF- κ B通路。實(shí)驗(yàn)原理、方法和結(jié) 果如下實(shí)驗(yàn)原理NF-K B核轉(zhuǎn)錄因子有著保守的DNA結(jié)合序列，通過(guò)與其結(jié)合，調(diào)控下游 基因的表達(dá)。pNF-κ B-Luc報(bào)告質(zhì)粒(Clontech)載有螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因，該基因的 表達(dá)由合成的啟動(dòng)子所調(diào)控，其中包含基本的啟動(dòng)子元件(TATA box)，以及NF-κ B轉(zhuǎn)錄因 子的DNA結(jié)合序列，所以螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)受NF-K B信號(hào)通路調(diào)控。通過(guò) 考察化合物對(duì)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)變化可以反應(yīng)出化合物對(duì)NF-κ B信號(hào)通路的調(diào)控作 用。實(shí)驗(yàn)方法(1)接種pNF- κ B-Luc穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞用含10%胎牛血清的 HG-DMEM培養(yǎng)液將HEK293細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 X IO4個(gè)細(xì)胞接種到96孔板。
(2)化合物處理細(xì)胞培養(yǎng)24h后，先加入待測(cè)化合物溶液(化合物從25μ g/mL到0. 1 μ g/ mL，3倍稀釋)，培養(yǎng)lh，然后加入lOng/mL TNF- α誘導(dǎo)NF- κ B信號(hào)通路激活，繼續(xù)培養(yǎng)2h。
(3)熒光素酶活性檢測(cè)熒光素酶活性檢測(cè)采用Promega公司的單底物熒光素酶檢測(cè)試劑 盒(Promega，E2510)，加入50 μ L單底物熒光素酶底物，避光孵育30min，在Envision多標(biāo) 記微孔板檢測(cè)儀(Perkin-Elmer Life Sciences, Inc.，Boston, MA, USA)上讀值分析。同 批細(xì)胞應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活量。(4)記錄結(jié)果，以單獨(dú)TNF- α處理組為100%，對(duì)原始 讀值均一化處理，以濃度為橫坐標(biāo)，熒光素酶信號(hào)相對(duì)值為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，計(jì)算化合物的 IC50 值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物1-11對(duì)NF- κ B信號(hào)通路的抑制作用 ND :no detected ( > 25 μ g/mL)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1-11均具有NF-κ B信號(hào)通路的抑制活性，其中RA-V(I)活 性最強(qiáng)，IC5tl為30nM，其活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照合成化合物PS341數(shù)量級(jí)相當(dāng)，大大強(qiáng)于目前發(fā) 現(xiàn)的大多數(shù)NF- κ B信號(hào)通路天然抑制劑。所以茜草科類(lèi)型環(huán)肽為一類(lèi)結(jié)構(gòu)新穎的NF- κ B 信號(hào)通路天然抑制劑。實(shí)施例4 本發(fā)明茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物RA-V (1)、RA-I (2)、RA-XXIV (3)、RA-XII (4)、 rubiyunnanin D (5)、rubiyunnanin C (6)、rubiyunnanin E (7)、rubiyunnanin F (8)、 rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(IO)和 RY-II (11)都有一定的抗單純皰疹病毒 I 型 的活性，其中化合物RA-V(I)和RA-XII(4)具有較好的抗單純皰疹病毒I型的活性?？箚?純皰疹病毒I型實(shí)驗(yàn)原理、方法和結(jié)果如下
實(shí)驗(yàn)原理所使用的抗HSV-I活性評(píng)價(jià)系統(tǒng)是一種基于重組報(bào)告病毒HSV/Blue的 體外評(píng)價(jià)系統(tǒng)。重組病毒HSV/Blue感染后細(xì)胞內(nèi)的病毒數(shù)量與報(bào)告基因IacZ表達(dá)的數(shù)量 在一定范圍內(nèi)成正比，因此在其線(xiàn)性范圍內(nèi)檢測(cè)IacZ表達(dá)產(chǎn)物β-Gal的活性則可間接檢 測(cè)到病毒的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)比較處理組和病毒對(duì)照組的報(bào)告基因活性，從而評(píng)價(jià)樣品的 抗HSV-I活性。實(shí)驗(yàn)方法(1)樣品的細(xì)胞毒性檢測(cè)Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)形成單層后，加入不同 濃度的樣品液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，更換含10% Alamarblue的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4h后檢測(cè)其 530/590nm處的熒光值，檢測(cè)樣品對(duì)Vero細(xì)胞的毒性，并計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒濃度(CC5tl)。(2)樣品抗HSV-I病毒作用檢測(cè)Vero細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)形成單層后，0. 5M的病毒液和不超過(guò)20%細(xì) 胞毒性的梯度濃度樣品溶液同時(shí)加到Vero細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，檢測(cè)報(bào)告基因IacZ的 表達(dá)產(chǎn)物β-Gal，確定樣品對(duì)HSV-I的抑制作用，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC5Q)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表5茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物1-11的抗HSV-I活性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1-11都具有一定的抗HSV-I活性。其中RA-V抗HSV-I活 性顯著，選擇指數(shù)(Si)達(dá)22. 9。實(shí)施例5 實(shí)施例1所得化合物1-11，加入4%的硫酸乙醇溶液，PH = 4，過(guò)濾，干燥，制成硫 酸鹽化合物1-11。實(shí)施例6 實(shí)施例1所得化合物1-11，加入4%的鹽酸溶液，PH = 4，過(guò)濾，干燥，制成鹽酸鹽 化合物1-11。實(shí)施例7 實(shí)施例1所得化合物1-11，加入4%的酒石酸溶液，PH = 4，過(guò)濾，干燥，制成酒石 酸鹽化合物1-11。實(shí)施例8 實(shí)施例1所得化合物1-11，加入4%的檸檬酸溶液，PH = 4，過(guò)濾，干燥，制成檸檬 酸鹽化合物1-11。實(shí)施例9 片劑實(shí)施例1所得化合物1-11或?qū)嵤├?-8所得的鹽10mg，乳糖180mg，淀粉
2055mg，硬脂酸鎂5mg。制備方法將化合物或其鹽、乳糖和淀粉混和，用水均勻濕潤(rùn)、把濕潤(rùn)后的混合 物過(guò)篩并干燥，再過(guò)篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為 10mg。實(shí)施例10 安瓿劑實(shí)施例1所得化合物1-11或?qū)嵤├?-8所得的鹽2mg，氯化鈉10mg。制備方法將化合物或其鹽和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過(guò)濾所得溶液，在 無(wú)菌條件下裝入安瓿瓶中。實(shí)施例11 注射用凍干劑實(shí)施例1所得化合物1-11或?qū)嵤├?-8所得的鹽10mg，碳酸氫鈉 2mg，甘露醇 252mg。制備方法將碳酸氫鈉、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除熱原， 過(guò)濾除去活性碳，在濾液中加入化合物或其鹽，超聲處理使溶解，用IN鹽酸調(diào)節(jié)PH為 5. 0-7. 0，微孔濾膜濾過(guò)，加注射用水，分裝，冷凍干燥，上塞，軋蓋，即得。實(shí)施例12 膠囊劑實(shí)施例1所得化合物1-11或?qū)嵤├?-8所得的鹽10mg，乳糖187mg，硬脂 酸鎂3mg。制備方法將化合物或其鹽與助溶劑混和，過(guò)篩，均勻混合，把得到的混合物裝入 硬明膠膠囊，每個(gè)膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。
權(quán)利要求
茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物，由1個(gè)D α 丙氨酸，1個(gè)L α 丙氨酸，3個(gè)取代的N 甲基 L α 酪氨酸和1個(gè)其它種類(lèi)的L α 氨基酸經(jīng)肽鍵縮合而成，且6個(gè)氨基酸縮合成為十八元環(huán)，其中2個(gè)鄰位的酪氨酸之間的苯環(huán)經(jīng)氧橋連接形成一個(gè)十四元環(huán)。
2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)肽，為具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物rubiyurmaninD(5)、E (7)、rubiyunnanin F (8)、rubiyunnaninG(9)、RiR2 R3 R4 R55CH2CH2COOH HHH H6ch2ch2cooch3ch3 η η η7CH2CH2COOH CH3 OH H H8CH2CH2CONH2 CH3 H H 々-D-Glc9CH3HHH y -D-Glc10CH3CH3 H OH β-D-Gk。
3.制備權(quán)利要求1所述茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物的方法，取茜草屬植物的根莖，經(jīng)干燥、 粉碎后，用甲醇回流充分提取；將甲醇浸膏加水混懸后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃 取；乙酸乙酯部分和正丁醇部分反復(fù)用硅膠、S印hadeXLH-20、RP-18、硅膠H、HPLC各種層析 柱分離純化，再結(jié)合環(huán)肽的TLC檢測(cè)方法即得到茜草科類(lèi)型環(huán)肽。
4.制備如下結(jié)構(gòu)式所示茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物RA-V(I)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、 RA-XII (4)、rubiyunnanin D (5)、rubiyunnanin C (6)、rubiyunnaninE (7)、rubiyunnanin F(8), rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(IO)和 RY-II(Il)的方法，取小紅參的根莖， 經(jīng)干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次，時(shí)間為每次1-4小時(shí)，提取液經(jīng)減壓濃縮得甲醇浸 膏；將甲醇浸膏加水混懸后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等體積各萃取三次，回收 溶劑得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；將乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析，用100 0， 95 5,9 1,8 2,0 100的氯仿/甲醇梯度洗脫，薄層層析，結(jié)合環(huán)肽TLC檢測(cè)方法 合并其中的95 5、9 1和8 1含有環(huán)肽的部分；以下的每一步驟都須結(jié)合環(huán)肽TLC 檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行分離純化；合并后的浸膏再次經(jīng)硅膠柱層析，用70 1-8 2的氯仿/甲 醇梯度洗脫，根據(jù)環(huán)肽點(diǎn)的不同合并為六個(gè)組分Fr. I-Fr. 6 ；Fr. 1組分經(jīng)硅膠柱層析，用 7:3-0: 1石油醚/丙酮為洗脫劑分離得到五個(gè)亞組分Fr. I-I-Fr. 1-5 ；其中Fr. 1-4經(jīng) S印hadexLH-20層析，1 1的氯仿/甲醇為洗脫劑，所富集的含有環(huán)肽的部分再經(jīng)硅膠H反 復(fù)層析，用6 4的石油醚/丙酮洗脫分離得到化合物RA-V(I) ；Fr. 2組分經(jīng)硅膠柱層析， 95 5-9 1的氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到七個(gè)亞組分Fr.2-l-Fr.2-7;Fr.2-4部分用 反相RP-18硅膠拌樣，經(jīng)RP-18柱層析，用20 80-90 10的甲醇/水梯度洗脫，得到六個(gè) 亞組分 Fr. 2-4-I-Fr. 2-4-6 ；組分 Fr. 2-4-2 經(jīng) Sephadex LH-20 層析，1 1 的氯仿 / 甲醇為 洗脫劑，富集的環(huán)肽部分再次經(jīng)RP-18柱層析，30 70-50 50的甲醇/水梯度洗脫得到化 合物RA-I (2)；組分Fr. 2-4-5同樣經(jīng)S印hadex LH-20層析，1 1的氯仿/甲醇為洗脫劑，富集的環(huán)肽部分經(jīng)反相RP-18柱層析，20 80-40 60的甲醇/水梯度洗脫，含有環(huán)肽部 分再經(jīng)硅膠H反復(fù)層析，用20 1-10 1氯仿/甲醇洗脫分離得到化合物rubiyurmanin C (6) ；Fr. 3組分經(jīng)硅膠柱層析，70 1-9 1的氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到五個(gè)亞組分 Fr. 3-1-Fr. 3-5 ；Fr. 3-3組分再次經(jīng)硅膠柱層析，1:1-0:1石油醚/丙酮梯度洗脫，含有 環(huán)肽部分經(jīng)Si^phadex LH-20再富集，1 1氯仿/甲醇為洗脫劑，所富集的環(huán)肽部分經(jīng)硅膠 H反復(fù)純化，20 1氯仿/甲醇為洗脫劑，分離得到化合物RA-XXIV (3) ；Fr. 4組分經(jīng)硅膠柱 層析，20 1-8 2乙酸乙酯/甲醇進(jìn)行梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組分Fr. 4-1-Fr. 4-4; 亞組分Fr. 4-3直接經(jīng)S印hadex LH-20進(jìn)行環(huán)肽富集，1 1氯仿/甲醇為洗脫劑；再經(jīng)硅 膠柱層析，95 5-0 1氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到七個(gè)亞組分Fr.4-3-l-Fr.4-3-7; 其中Fr. 4-3-5用反相RP-18硅膠拌樣，經(jīng)RP-18柱層析，40 60-60 40的甲醇/水梯 度洗脫，得到化合物RA-XII (4) ；Fr. 4-3-7部分經(jīng)0DSHPLC半制備柱純化，33%乙腈和4%0 三氟乙酸為洗脫劑，得到化合物rubiyunnaninD(5)和rubiyunnanin E (7) ；Fr. 5組分經(jīng)硅 膠柱層析，95 5-0 1氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組分Fr. 5-1-Fr. 5-4;亞組 分Fr. 5-3再經(jīng)硅膠柱層析，20 1-8 2乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組 分 Fr. 5-3-I-Fr. 5-3-4 ；亞組分 Fr. 5-3-2 和亞組分 Fr. 5-3-4 分別經(jīng) S印hadex LH-20 進(jìn) 行環(huán)肽富集，1 1氯仿/甲醇為洗脫劑；所得含有環(huán)肽部分再分別經(jīng)反相RP-18柱層析， 20 80-50 50的甲醇/水梯度洗脫進(jìn)行富集；亞組分Fr. 5-3-2所富集環(huán)肽部分經(jīng)ODS HPLC半制備柱分離純化，23%乙腈和4%。三氟乙酸為洗脫劑，得到化合物RY-II (11)；亞組 分Fr. 5-3-4所富集環(huán)肽部分經(jīng)ODS HPLC半制備柱分離純化，40%乙腈和4%。三氟乙酸為 洗脫劑，得到化合物rubiyunnanin G(9)和rubiyunnanin H(IO) ；Fr. 6組分經(jīng)硅膠柱層析， 9 1 0. 1-8 2 0.2氯仿/甲醇/水梯度洗脫，合并得到四個(gè)亞組分Fr. 6-1-Fr. 6-4; 亞組分Fr. 6-3再經(jīng)硅膠柱層析，20 1-8 2乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，合并得到含有環(huán) 肽的部分Fr. 6-3-2 ;Fr. 6-3-2經(jīng)反相RP-18柱層析，10 90-40 60的甲醇/水梯度洗脫 得到六個(gè)亞組分 Fr. 6-3-2-1-Fr. 6-3-2-6 ；Fr. 6-3-2-1 經(jīng) S印hadex LH-20 層析，1 1 氯 仿/甲醇為洗脫劑富集環(huán)肽，再經(jīng)ODS HPLC半制備柱純化，28%乙腈和4%。三氟乙酸為洗脫 劑，得到化合物rubiyunnanin F (8)，
5.以權(quán)利要求1中的茜草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成分的NF-KB 號(hào)通路抑制劑。
6.用于治療單純皰疹病毒I型的藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1的茜 草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽和藥學(xué)上可接受的載體。
7.藥物組合物，其中含有治療有效量的如下結(jié)構(gòu)式所示的茜草科類(lèi)型環(huán)肽化合物 RA-V (1)、RA-I (2)、RA-XXIV (3)、RA-XII (4)、rubiyunnanin D (5)、rubiyunnanin C (6)、 rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(IO)禾口RY-II (11)或其藥理學(xué)上容許的鹽和藥學(xué)上可接受的載體，
8.權(quán)利要求1所述茜草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成分在制備N(xiāo)F-KB 信號(hào)通路抑制劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述茜草科類(lèi)型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽在制備治療單純皰疹病毒I型相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供茜草科類(lèi)型環(huán)肽，以其為活性成分的藥物組合物，其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的茜草科類(lèi)型環(huán)肽，由1個(gè)D-α-丙氨酸，1個(gè)L-α-丙氨酸，3個(gè)取代的N-甲基-L-α-酪氨酸和一個(gè)其它種類(lèi)的L-α-氨基酸經(jīng)肽鍵縮合而成，且6個(gè)氨基酸縮合成為十八元環(huán)，其中2個(gè)鄰位的酪氨酸之間的苯環(huán)經(jīng)氧橋連接形成一個(gè)十四元環(huán)。優(yōu)選結(jié)構(gòu)式為(1-11)的茜草科類(lèi)型環(huán)肽，為NF-κB信號(hào)通路的抑制劑。提供此類(lèi)化合物的制備方法及在制備抗單純皰疹病毒I型(HSV-1)藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K7/64GK101921319SQ20101023274
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月21日
發(fā)明者周宇波, 彭延敏, 彭濤, 曾廣智, 朱欽昌, 李佳, 李艷, 蘇佳, 范君婷, 譚寧華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所;中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所;中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院