專利名稱：Ctgf作為糖尿病腎病的治療靶點的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療糖尿病腎病特定早期癥狀和晚期癥狀的方法和化合物。還提供了 治療與早期和晚期糖尿病腎病有關(guān)的各種生理特征的方法和化合物。
背景技術(shù)：
腎病是腎臟的正常生理學(xué)和功能的任何改變造成的。腎病可由多種急性和慢性病 癥和事件引起，包括物理、化學(xué)或生物損傷、創(chuàng)傷或外傷，疾病，如高血壓、糖尿病、充血性心 力衰竭、狼瘡、鐮狀細胞貧血、各種炎性和自身免疫疾病、HIV相關(guān)腎病等。腎病可導(dǎo)致腎功 能降低、高血壓和腎衰竭，嚴(yán)重降低生活質(zhì)量，有時需要透析，某些情況下需要腎移植。糖尿病腎病是糖尿病的主要長期并發(fā)癥，并且在美國是進行透析和腎移植的主要 指征。(Marks 和 Raskin，1998，Med Clin North Am, 82 :877_907。)25-50% 的 I 型和 2 型 糖尿病患者會發(fā)生糖尿病腎病。因此，糖尿病腎病在西方國家是造成晚期腎病和腎衰竭的 最常見原因。與1型或2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病(和其它腎病)有關(guān)的起作用的風(fēng) 險因子包括高血糖、高血壓、改變的腎小球血流動力學(xué)以及各種生長因子增加或異常的 表達，其中包括轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGFi3)、胰島素樣生長因子(IGF)-I、血管內(nèi)皮生長因 子-a(VEGF-A)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)。(見，例如，F(xiàn)lyvbjerg(2000)Diabetologia 43 1205-23 ；Brosius (2003) Exp Diab Res 4 225-233 ；Gilbert φ, (2003) Diabetes Care 26 :2632-2636 ；和國際公布號 WO 00/13706。)目前的治療策略是用各種方法減緩糖尿病腎病的進展，包括最佳血糖控制(通過 調(diào)節(jié)飲食和/或胰島素治療)和高血壓控制，這些療法的效果不同。例如，血管緊張素轉(zhuǎn)化 酶(ACE)抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑(ARB)都被用來降低高血壓，它們顯示可延遲腎 病和大白蛋白尿的進展或發(fā)展。一些臨床試驗已經(jīng)證實了 ACE抑制劑和ARB對糖尿病患者 的功效。然而，盡管ACE抑制劑顯示可延遲1型糖尿病患者的腎臟衰弱，但這些藥劑對I型 糖尿病患者的腎臟保護效果還不清楚。(Raij (2003) Am JHypertens 16 :46S_49S。)此外，由于控制血糖和血壓的療法通過延遲相關(guān)病理的進展而顯著降低糖尿病腎 病的發(fā)病率和死亡率，這種常規(guī)療法不能充分停止疾病的進展，因此無法提供完全的治療 效果。此外，目前的護理標(biāo)準(zhǔn)是給予ACE抑制劑或ARB，這不是普遍有效的，只是最低限度地延遲而不排除腎移植的需要。其它治療手段集中在將一種或多種生長因子作為治療靶點。已經(jīng)研究了單獨抑制 或與ACE抑制劑或ARB聯(lián)合抑制VEGF或TGFβ的療法。(見，例如，De Vriese等，(2001) J Am Soc Nephrol 12 :993_1000 ;Flyvbjerg 等，(2002)Diabetes 51 :3090_3094 ;Ziyadeh 等， (2000)Proc Natl Acad Sci 97 8015-8020 ；Chen φ, (2003)Biochem BiophysRes Commun 300 16-22 ；和Benigni 等，(2003) J Am Soc Nephrol 14 1816-1824。)然而，這種治療方法 不能改善與糖尿病腎病有關(guān)的腎臟病理的所有方面(例如改變和削弱的腎功能和結(jié)構(gòu))。 例如，抑制作為糖尿病腎病治療靶點的TGF β不能有效減輕db/db小鼠的白蛋白尿，盡管這 種治療對腎小球基質(zhì)擴張有有益效果。(見Ziyadeh等，同上。)此外，盡管給予糖尿病db/ db小鼠抗-VEGF抗體為糖尿病相關(guān)腎臟滲透性升高提供了益處，但觀察到對腎小球系膜擴 張只有極小益處。(見Flyvbjerg等，(2002)，同上。)因此，盡管單獨或聯(lián)合使用這種療法 是有希望的，但與慢性腎病例如糖尿病腎病有關(guān)的早期(例如腎小球過度濾過、腎小球濾 過率升高、微白蛋白尿等)和晚期(例如腎小球濾過率降低、大白蛋白尿、腎小球系膜基質(zhì) 過度擴張等)病理特征均未得到改善。因此，本領(lǐng)域需要能改善早期和晚期癥狀以及與疾 病發(fā)展和進展有關(guān)的病理的治療糖尿病腎病的完全療法。除了上述缺點，目前的糖尿病腎病療法由于缺乏特異性因此適用性/功效有限。 具體說，靶向VEGF-或TGF β的療法可包括這些生長因子的有益活性，如血管生成、腫瘤抑 制及免疫系統(tǒng)的適當(dāng)發(fā)育。例如，由于TGFii與纖維化發(fā)展有關(guān)，它也是免疫發(fā)育和腫瘤抑 制的重要介質(zhì)，提示抑制TGF β可能有有害的潛在不良副作用。因此，本領(lǐng)域需要更具選擇 性的治療糖尿病腎病的方法?？傊?，本領(lǐng)域需要治療腎病尤其是糖尿病腎病的治療方法，該方法在疾病發(fā)展和 進展的各階段(例如早期和晚期糖尿病腎病)都有效。具體地說，需要糖尿病腎病的完全療 法，這種療法可有效治療糖尿病腎病的早期特征和晚期特征，所述特征例如過度濾過(早 期)、腎小球滲透性升高(早期)、腎小球濾過率升高(早期)、微白蛋白尿(早期)、大白蛋 白尿(晚期)和腎小球濾過率降低(晚期)。需要更加完全針對與糖尿病腎病和其它腎病 的發(fā)展和進展有關(guān)的各種不同過程的治療方法。具體地說，需要以與糖尿病腎病有關(guān)的非 纖維化(例如過度濾過)和纖維化(例如腎小球系膜基質(zhì)擴張)過程為目標(biāo)的療法。此外， 需要治療腎病，尤其是糖尿病腎病的能提供結(jié)構(gòu)和功能益處的治療方法。本發(fā)明鑒定了 CTGF在與腎病如糖尿病腎病的發(fā)展和進展有關(guān)的各過程中的作 用，并提供了抑制和預(yù)防這些過程的方法，滿足了這些需要。本發(fā)明還提供了可用來治療和 預(yù)防腎病，尤其是與糖尿病有關(guān)的腎病，更具體說是糖尿病腎病的方法和藥劑，滿足了現(xiàn)有 需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防糖尿病腎病特定早期癥狀和晚期癥狀的方法和化合物，并 提供了治療或預(yù)防與早期和晚期糖尿病腎病有關(guān)的各種生理特征的方法和化合物。具體地說，在下述各方法的優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選的對象是人類對象。一實施方案中，本發(fā)明提供了一種降低糖尿病或早期糖尿病腎病患者或者有患病 風(fēng)險的對象的肌酸酐清除率的方法，所述方法包括予患者治療有效量的CTGF抑制劑，從而降低對象的肌酸酐清除率。人的正常肌酸酐清除率水平約為97-137毫升/分鐘(成年男 性)和88-128毫升/分鐘(成年女性)。因此，尤其考慮了將肌酸酐清除率水平降至這些 水平或大約這些水平的方法。這里還提供了減輕糖尿病或早期糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的腎小 球過度濾過的方法，該方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑，還提供了減輕腎小球 過度灌注的方法。 另一方面，本發(fā)明包括減輕或預(yù)防糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對 象腎臟重量增加的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。本發(fā)明還提供了使糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的腎小球濾 過率正常化的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。所述糖尿病腎病可 以是，例如，早期、晚期、初期或明顯性糖尿病腎病。在早期或初期糖尿病腎病的情況下，正 ?；瘜⒖赡芙档湍I小球濾過率，而在晚期或明顯性糖尿病腎病的情況下，正?；瘜⒖赡苌?高腎小球濾過率。成人的正常GFR約為120毫升/分鐘。當(dāng)對象的GFR高于正常水平時需 要降低GFR，特別考慮了將GFR降至低于約150毫升/分鐘、低于約140毫升/分鐘、低于 約130毫升/分鐘以及約120毫升/分鐘的方法。當(dāng)對象的GFR受損或低于正常水平時， 需要將GFR升至高于約15毫升/分鐘、高于約30毫升/分鐘、高于約60毫升/分鐘、高于 約90毫升/分鐘、約120毫升/分鐘的方法。另一實施方案中，本發(fā)明提供了減輕糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的 對象腎小球肥大的方法，所述糖尿病腎病包括早期、晚期、初期或明顯性糖尿病腎病，所述 方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。這里還提供了減輕糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的蛋白尿的 方法，所述方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。本發(fā)明還包括減輕糖尿病或糖尿 病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的白蛋白尿的方法，所述方法包括給予患者治療有效量 的CTGF抑制劑。還包括減輕糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的微白蛋白 尿的方法，其中所述糖尿病腎病是早期或初期糖尿病腎病，所述方法包括給予患者治療有 效量的CTGF抑制劑，并提供了減輕糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的大 白蛋白尿的方法，其中所述糖尿病腎病是晚期或明顯性糖尿病腎病，所述方法包括給予患 者治療有效量的CTGF抑制劑。成人的正常尿白蛋白排泄率通常約為15-30毫克/天。當(dāng)對象的尿白蛋白排泄率 約為30-300毫克/天時通常被診斷為微白蛋白尿。大白蛋白尿的典型特征為尿白蛋白排 泄率大于約300毫克/天。因此，本發(fā)明特別提供了降低對象的尿白蛋白排泄率的方法，所 述方法包括給予尿白蛋白排泄率升高(例如尿白蛋白排泄率高于正常水平)的對象有效量 的CTGF抑制劑。這里特別考慮了將尿白蛋白排泄率降至低于約300毫克/天、低于約200 毫克/天、低于約100毫克/天、低于約50毫克/天，及最優(yōu)選低于約30毫克/天的實施 方案。在某些方面，本發(fā)明提供了降低糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象 的BUN水平的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。成人的正常BUN水 平為7-20毫克/分升。因此，提供了使BUN水平降至低于20毫克/分升的方法。本發(fā)明 還提供了降低糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的菊糖清除率的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。在特定方面，所述糖尿病腎病是晚期糖尿病 腎病或明顯性糖尿病腎病。再在另一實施方案中，本發(fā)明提供了在有糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險的對象中預(yù)防這種并 發(fā)癥、降低其風(fēng)險或延遲其發(fā)作的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制 齊U。在不同實施方案中，所述糖尿病并發(fā)癥包括至少一種選自以下的并發(fā)癥肌酸酐清除率 升高、腎小球濾過率升高或降低、腎小球基底膜增厚、腎小球過度濾過、腎小球過度灌注、腎 小球肥大、尿白蛋白排泄率升高、微白蛋白尿、大白蛋白尿、BUN水平升高、菊糖清除率升高、 腎臟重量增加和腎功能受損。本發(fā)明還包括治療初期糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的初期糖尿病腎 病的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑，并包括治療早期糖尿病腎病 患者或者有患病風(fēng)險的對象的初期糖尿病腎病的方法，所述方法包括給予患者治療有效量 的CTGF抑制劑。這里還考慮了治療明顯性糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的明顯 性糖尿病腎病的方法，所述 方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。本發(fā)明考慮了將本發(fā)明的方法與其它療法聯(lián)用。一實施方案中，所述方法與其它 療法聯(lián)用，例如，以進一步增加對某些病理事件的治療效果，等等。例如，在治療時程期間或 在疾病進展和緩解后兩種處理可同時或連續(xù)給予。另一實施方案中，所述方法與另一種具 有類似或不同作用模式的治療方法聯(lián)合使用，例如，ACE抑制劑、ARB、抑制素、高級糖基化終 產(chǎn)物(AGE)抑制劑等。因此，在一具體實施方案中，本發(fā)明提供了治療糖尿病腎病患者或者 有患病風(fēng)險的對象的糖尿病腎病的方法，所述方法包括與抑制量的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制 劑聯(lián)合給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。本發(fā)明還提供了治療糖尿病腎病患者或者有 患病風(fēng)險的對象的糖尿病腎病的方法，所述方法包括與抑制量的血管緊張素受體阻斷劑聯(lián) 合給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。一實施方案中，提供了治療對象的進行性腎衰竭的方法，所述方法包括給予患者 治療有效量的CTGF抑制劑。另一實施方案中，本發(fā)明提供了降低對象的微白蛋白尿風(fēng)險或 延遲微白蛋白尿發(fā)展的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。另一實施 方案中，還提供了降低對象的大白蛋白尿風(fēng)險或延遲大白蛋白尿發(fā)展的方法，所述方法包 括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。—特定方面，本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)，即CTGF在這里被鑒定為包括糖尿病腎病并發(fā) 癥和玻璃體視網(wǎng)膜病在內(nèi)的早期進行性疾病的關(guān)鍵因子。因此，一方面，本發(fā)明涉及治療或 預(yù)防進行性疾病患者或者有患病風(fēng)險的對象的這種疾病早期癥狀的方法，所述方法包括給 予患者治療有效量的CTGF抑制劑。另一方面，所述進行性疾病與CTGF之外的生長因子有 關(guān)，在一具體方面，所述其它生長因子是VEGF。一方面，所述進行性疾病是腎病，在一特定方 面，所述進行性疾病與糖尿病或糖尿病并發(fā)癥有關(guān)，或者是糖尿病腎病。本發(fā)明還包括改善腎功能受損患者或者有患病風(fēng)險的對象的腎功能的方法，所述 方法包括給予患者治療有效量的CTGF抑制劑。如上所述，本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)，即抗-CTGF療法可有效治療或預(yù)防早期和晚期 糖尿病腎病的各種生理特征。因此，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防與至少一種選自以下的特征 有關(guān)的腎病的方法肌酸酐清除率升高；腎小球濾過增加或腎小球過度濾過；蛋白尿；尿白 蛋白排泄增加；腎小球體積增大；腎小球肥大；腎臟重量增加；腎小球基底膜增厚；腎小球濾過率降低；BUN水平升高；和菊糖清除率升高。各種情況下，所述方法包括給予有此需要 的對象有效量的CTGF抑制劑。這些方法都包括給予對象CTGF抑制劑以預(yù)防上述任一并發(fā) 癥的進展或發(fā)展。本發(fā)明還包括CTGF抑制劑在制造用于以下用途的藥物中的應(yīng)用降低肌酸酐清 除率；減輕腎小球過度濾過；減輕腎小球過度灌注；減輕腎小球肥大；降低腎小球基底膜厚 度；降低尿白蛋白排泄率；減輕蛋白尿(proteinuria)；減輕白蛋白尿(albuminuria)；減 輕微白蛋白尿；減輕大白蛋白尿(macroalbuminuia)；降低BUN水平；使腎小球濾過率正常 化；降低菊糖清除率；減輕或預(yù)防腎臟重量增加；預(yù)防糖尿病并發(fā)癥、降低其風(fēng)險或延遲其 發(fā)作；治療或預(yù)防初期糖尿病腎病進展；治療或預(yù)防早期糖尿病腎病進展；治療或預(yù)防明 顯性糖尿病腎病進展；治療或預(yù)防進行性腎衰竭；治療或預(yù)防對象的進行性疾病早期癥狀 發(fā)展；和改善糖尿病或糖尿病腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象的腎功能。在不同實施方案 中，所述試劑選自抗體、小分子抑制劑、反義核酸和siRNA。在上述方法的優(yōu)選實施方案中，所述對象是人類對象。在任何上述方法中，特別考慮了抑制CTGF的試劑是多肽、多核苷酸或小分子；例 如，結(jié)合CTGF的抗體、反義分子、siRNA、小分子化合物等。具體地說，本發(fā)明考慮可通過任 何本領(lǐng)域熟知的方法實現(xiàn)抑制CTGF以調(diào)節(jié)CTGF的表達和活性。盡管本發(fā)明包括抑制CTGF 編碼基因表達、抑制CTGF產(chǎn)生或抑制CTGF活性的任何方法，但優(yōu)選使用抗-CTGF試劑，例 如抗CTGF的人單克隆抗體。例如，可用小分子化合物來抑制CTGF的表達、產(chǎn)生或活性。由 于CTGF表達受環(huán)狀核苷酸抑制，這種化合物可包括，例如，環(huán)狀核苷酸類似物或磷酸二酯 酶(PDE)抑制劑。(見，例如，Duncan 等，(1999)FASEB J13 :1774_1786。)此外，包括小干 擾核糖核酸(siRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶和反義序列在內(nèi)的多核苷酸可用于本發(fā)明的 方法以抑制CTGF的表達和/或產(chǎn)生。(見，例如，Kondo等，(2000)Biochem Biophys Res Commun 278:119-124。)這種技術(shù)是相關(guān)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的。用于本發(fā)明方法的抗 體的例子描述在，例如，國際公布號WO 2004/108764中，該申請被全文納入本文作為參考。


圖1顯示，給予抗-CTGF抗體降低了糖尿病db/db小鼠的腎臟重量增加。圖2顯示，給予抗-CTGF抗體降低了糖尿病db/db小鼠的肌酸酐清除率。圖3顯示，給予抗-CTGF抗體降低了糖尿病db/db小鼠的尿白蛋白分泌。圖4顯示了人玻璃體內(nèi)CTGF和VEGF水平間的相關(guān)性。圖5顯示，給予抗-CTGF抗體降低了糖尿病db/db小鼠的尿體積。圖6顯示，給予抗-CTGF抗體減小了糖尿病db/db小鼠的腎基底膜增厚。圖7顯示，給予抗-CTGF抗體降低了糖尿病腎病大鼠模型的蛋白尿。圖8顯示，給予抗-CTGF抗體降低了糖尿病腎病大鼠模型的BUN水平。圖9顯示，給予抗-CTGF抗體改善了糖尿病腎病大鼠模型的腎小球濾過率。
具體實施例方式應(yīng)理解，本發(fā)明不限于這里描述的具體方法、方案、細胞系、測定和試劑，這些是可 以變化的。還應(yīng)理解，這里所用的術(shù)語是用來描述本發(fā)明的具體實施方案的，而不是要以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由附加的權(quán)利要求限定。
必需注意，在文中和附加的權(quán)利要求中，除非文中另有明確說明，單數(shù)形式“一 個”、“一種”和“這種”包括其復(fù)數(shù)。因此，例如，提及“一個片段”時包括多個這種片段，提 及一個“抗體”時是指一個或多個抗體以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的它的等價物，等等。除非另有定義，這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù) 人員的常規(guī)理解具有相同含義。盡管與這里所述方法和材料類似或等價的任何方法和材料 都可用來實踐或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述的是優(yōu)選的方法、裝置和材料。為描述和公開可與 本發(fā)明結(jié)合使用的出版物中報道的方法、試劑和工具，這里引用的所有出版物被全文納入 本文作為參考。這里提到的所有出版物夠不能解釋為承認本發(fā)明沒有資格早于在先發(fā)明的 公開。除非另有說明，本發(fā)明的實踐將采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)的化學(xué)、生化、分子生物 學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)方法。這種技術(shù)在文獻中有詳細地解釋。見，例如， Gennaro,A. R.編，1990，《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington' s PharmaceuticalSciences)，第 18 版，Mack Publishing Co. ；Colowick, S.等編，《酶學(xué)方法》(Methodsln Enzymology), Academic Press, Inc.；《實驗免疫學(xué)手冊》(Handbook of Experimental Immunology),第 I-IV 卷(D.M.Weir 和 C. C. Blackwell 編，1986，Blackwell ScientificPublications)； Maniatis, T.等編，1989，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning :A Laboratory Manual),第二版，第 I-III 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Ausubel, F. Μ.等 編，1999，《精編分子生物學(xué)實驗指南》(Short Protocols in MolecularBiology)，第四版， John Wiley & Sons ;Ream等編，1998，《分子生物學(xué)技術(shù)實驗精要》(Molecular Biology Techniques :An Intensive Laboratory Course), AcademicPress)；《PCR (生物技術(shù)叢書 導(dǎo)論)》(PCR (Introduction to Biotechniques Series))，第二版，Newton 禾口 Graham 編， 1997, Springer Verlag0本發(fā)明部分涉及以下發(fā)現(xiàn)，即結(jié)締組織生長因子(CTGF)在腎病特定早期癥狀中 發(fā)揮關(guān)鍵作用，所述早期癥狀包括，例如，腎小球過度濾過、腎小球滲透性升高、腎小球濾過 率升高、微白蛋白尿等。已知CTGF與腎病特定晚期癥狀如腎小球硬化癥和腎小管間質(zhì)性纖 維化有關(guān)，但未被鑒定為影響各種早期腎臟病理學(xué)特征的關(guān)鍵靶點。特別考慮了治療或預(yù) 防包括例如糖尿病腎病在內(nèi)的腎病的方法以及治療或預(yù)防相關(guān)病理學(xué)的方法。本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來減輕或緩解對象的與腎病如糖尿病腎病有關(guān)的多 種不同病理過程相關(guān)的并發(fā)癥的方法和組合物。一些實施方案中，所述對象是動物，更優(yōu)選 哺乳動物，最優(yōu)選人。本發(fā)明還提供了用于所述方法的組合物。這種組合物可包括小分子化合物；肽 和蛋白質(zhì)，包括抗體或其功能活性片段；以及多核苷酸，包括小干擾核糖核酸(siRNA)、微 小 RNA(miRNA)、核酶和反義序列。(見，例如，Zeng(2003)Proc Natl Acad Sci USAlOO 9779-9784 ；和 Kurreck(2003)Eur J Biochem 270:1628-1644。)本發(fā)明部分基于在治療腎病如糖尿病腎病的多個特定方面時發(fā)現(xiàn)了抑制CTGF的 出乎意料的益處。本發(fā)明提供了能證明抑制CTGF減輕了以前與CTGF無關(guān)的腎病各病理方 面的數(shù)據(jù)。在某些方面，本發(fā)明提供的證據(jù)表明，抑制CTGF為治療或預(yù)防糖尿病腎病特定 生理方面提供了治療方法，所述特定生理方面與VEGF的生物學(xué)活性和病理活性有關(guān)，如腎小球過度濾過和過度灌注。糖尿病腎病糖尿病是全世界發(fā)病率和死亡率的主要原因，大約40%的糖尿病患者發(fā)展成糖尿病腎病，需要腎透析或腎移植。糖尿病是末期腎病的首要原因，因此，任何糖尿病患者都有 發(fā)展成糖尿病腎病的風(fēng)險。糖尿病腎病的進程以可以預(yù)測的事件模式為特征。通常，糖尿病腎病發(fā)展的時程 如下。腎小球過度濾過和腎肥大在糖尿病發(fā)病后的第一年發(fā)生，表現(xiàn)為腎小球濾過率升高 (例如，人類的正常腎小球濾過率為約120毫升/分鐘至約150毫升/分鐘)。在糖尿病的 前5年中能觀察到腎小球肥大、腎小球基底膜增厚和腎小球系膜體積擴張等病理變化。腎 小球濾過率逐漸恢復(fù)正常。糖尿病5-10年后，個體開始在尿液中排出小量白蛋白(微白蛋 白尿)。微白蛋白尿(出現(xiàn)微白蛋白尿的糖尿病個體下文稱為初期糖尿病腎病患者)是進 展成明顯性糖尿病腎病(部分以大白蛋白尿或明顯性蛋白尿為特征)的重要指標(biāo)。在疾病 早期看到的基底膜增厚和腎小球體積擴張可累積在晚期糖尿病腎病中，導(dǎo)致毛細血管腔閉 塞，最終導(dǎo)致腎小球硬化。一旦出現(xiàn)明顯性糖尿病腎病，腎小球濾過率就會穩(wěn)定下降，大約 一半的患者在7-10年內(nèi)發(fā)展到晚期腎病。臨床上已經(jīng)良好描述了人類糖尿病腎病的發(fā)展和進展階段。I期糖尿病腎病與腎 臟(即腎小球(glormerular))濾過增加(即過度濾過，由于流過腎臟和腎小球的血液增加 導(dǎo)致)、腎小球濾過率升高、腎小球肥大和腎腫大有關(guān)。II期糖尿病腎病是與繼續(xù)過度濾過 和腎肥大有關(guān)的臨床沉默階段。發(fā)生腎小球基底膜增厚和腎小球系膜擴張。III期糖尿病 腎病(也稱為初期糖尿病腎病)與微白蛋白尿和微蛋白尿(micro proteinuria)有關(guān)。微 白蛋白尿被定義為在24小時收集的尿液中有30-300毫克/天尿白蛋白、20-200微克/分 鐘尿白蛋白，或者點收集(spot collection)中有30-300微克/毫克肌酸酐。腎臟逐漸喪 失過濾廢物的能力，同時肌酸酐和尿素氮的血液水平升高。腎小球基底膜增厚和腎小球系 膜擴張隨著病情加重繼續(xù)發(fā)生。IV期糖尿病腎病(也稱為明顯性糖尿病腎病)與大白蛋白 尿(即臨床白蛋白尿)和血液中肌酸酐和血尿素氮(BUN)水平繼續(xù)升高有關(guān)。大白蛋白尿 被定義為在24小時收集的尿液中有大于300毫克/天尿白蛋白、大于200微克/分鐘尿白 蛋白，或者點收集中有大于300微克/毫克肌酸酐。一旦出現(xiàn)明顯性糖尿病腎病，腎小球濾 過率在數(shù)年內(nèi)逐漸降低。V期糖尿病腎病隨末期腎病和腎衰竭發(fā)生。過度濾過和過度灌注早期糖尿病腎病與腎功能受損有關(guān)，其部分特征為腎小球過度濾過和過度灌注。 腎小球過度濾過是與高血糖和糖尿病有關(guān)的腎小球腎單位流失。隨著功能性腎單位物質(zhì)的 流失，剩余的功能性腎單位肥大并承擔(dān)增加的工作量，從而使腎功能的總體喪失最小化。其 結(jié)果是發(fā)生腎小球過度濾過和過度灌注。腎小球過度濾過和過度灌注反映為腎小球濾過率升高。腎小球濾過率是腎臟每分 鐘產(chǎn)生的濾液的體積測量。人類對象的腎小球濾過率測量是健康和疾病狀態(tài)下最佳的腎功 能全面指標(biāo)。(Smith,《腎臟禾口尿路疾病》(Diseases of the kidney and urinarytract), 摘自《健康和疾病時的結(jié)構(gòu)和功能》(Structure and Function in Health andDisease)， 紐約；牛津大學(xué)出版社，1951 :836-887。)腎小球濾過率可用各種方法確定，如測量過濾標(biāo) 記物如聚糖、碘酞酸鹽或碘海醇的尿清除率。更常用的方法是，可通過確定肌酸酐(一種由肌肉產(chǎn)生并釋放到血液中的蛋白質(zhì))清除率來估算腎小球濾過率。肌酸酐清除率(通常表 示為毫升/分鐘)可通過比較給定時間(例如12或24小時)內(nèi)尿液中收集的肌酸酐水平 和血液中的肌酸酐水平來確定。成年男性的典型肌酸酐清除率約為97-137毫升/分鐘，成 年女性約為88-128毫升/分鐘。臨床實踐中，最常見是從血清肌酸酐濃度估算肌酸酐清除率。肌酸酐清除率與尿 肌酸酐排泄成正比，與血清肌酸酐濃度成反比。本領(lǐng)域已經(jīng)建立并標(biāo)準(zhǔn)化了許多估算肌酸 酐清除率的公式，因此可采用血清肌酸酐濃度、年齡、性別和體重等參數(shù)估算腎小球濾過 率。(見，例如，Cockcroft 和 Gault (1976) ^phron 16 :31_41 ;Levey 等，(1999) Annals of Internal Medicine 130 :462_470 ;Rule 等，(2004)Ann Intern Med 141:929_937。)本發(fā)明的方法和化合物可降低糖尿病動物模型的肌酸酐清除率。(見，例如，實施 例1。)因此，本發(fā)明提供了用來降低肌酸酐清除率增加或升高或者肌酸酐清除率升高超過 正常水平的對象的肌酸酐清除率的方法和化合物。本發(fā)明證實，抑制CTGF(例如，通過給予 CTGF抗體)降低了與腎病尤其是糖尿病腎病有關(guān)的肌酸酐清除率。升高的肌酸酐清除率與 腎小球過度濾過、過度灌注、肥大和腎小球濾過率升高有關(guān)，它是腎病例如糖尿病腎病發(fā)展 早期腎功能改變或受損的指示。一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來降低肌酸酐清除率 的方法和化合物。另一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來降低腎小球肌酸酐滲透性以及 恢復(fù)腎小球選擇性和功能的方法和化合物。另一方面，提供了通過抑制CTGF來治療或預(yù)防 與高血糖或糖尿病有關(guān)的腎小球肥大、過度濾過和過度灌注的方法和化合物。再在另一方 面，提供了通過抑制CTGF來治療或預(yù)防與腎病尤其是糖尿病腎病有關(guān)的腎小球肥大、過度 濾過和過度灌注的方法和化合物。一方面，所述腎病是早期糖尿病腎病。另一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來降低腎小球濾過率升高對象的腎小球 濾過率的方法和化合物。一方面，本發(fā)明提供了通過給予腎小球濾過率受損或升高的對象 或者有這種風(fēng)險的對象CTGF抑制劑來降低腎小球濾過率的方法和化合物。一方面，所述腎 小球濾過受損和腎小球濾過率升高與早期腎病有關(guān)。某些實施方案中，本發(fā)明提供了通過給予患者或者有患病風(fēng)險的對象CTGF抑制 劑來治療與肌酸酐清除率升高有關(guān)或以此為特征的腎病的方法和化合物，從而治療或預(yù)防 這種疾病。其它實施方案中，本發(fā)明提供了通過給予患者或者有患病風(fēng)險的對象CTGF抑制 劑來治療與腎小球濾過增加或腎小球過度濾過有關(guān)或以此為特征的腎病的方法和化合物， 從而治療或預(yù)防這種疾病。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法和化合物可提高晚期糖尿病腎病動物模型的腎小球濾過率。 (見實施例3。)因此，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來提高或正?；I小球濾過率低于正常 值的腎小球濾過率降低或受損對象的腎小球濾過率的方法和化合物。一方面，本發(fā)明提供 了通過給予腎小球濾過率受損或降低的對象或這有這種風(fēng)險的對象CTGF抑制劑來提高或 正?；I小球濾過率的方法和化合物。另一方面，所述腎小球濾過率受損和腎小球濾過率 降低與晚期腎病或明顯性糖尿病腎病有關(guān)。一方面，本發(fā)明提供了通過給予患者或者有患病風(fēng)險的對象CTGF抑制劑來治療 或預(yù)防與腎小球濾過率受損和腎小球濾過率降低有關(guān)的腎病的方法和化合物，從而預(yù)防或 預(yù)防這種疾病。另一方面，所述腎小球濾過率受損和腎小球濾過率降低與晚期腎病有關(guān)?？紤]到本發(fā)明的方法可用于具有任何臨床上接受的腎病或腎臟病測量指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的對象或者有發(fā)展成這種腎臟病風(fēng)險的對象以改善腎功能、正常化腎小球濾過率、減輕腎 小球過度濾過和過度灌注或者降低肌酸酐清除率。某些實施方案中，所述對象患有糖尿病 腎病。在不同實施方案中，所述對象患有I期腎病、II期腎病、III期腎病、IV期腎病或V 期腎病。 本發(fā)明的方法被用于預(yù)防、減輕或延遲有出現(xiàn)早期腎病相關(guān)腎臟并發(fā)癥風(fēng)險的對 象這種并發(fā)癥的發(fā)作，或用來制造藥物，該藥物用于具有與這里所述早期腎病有關(guān)的任何 疾病或特征的對象，優(yōu)選人類對象。一方面，所述對象患有糖尿病。糖尿病可用本領(lǐng)域熟練 技術(shù)人員接受和采用的任何測量來定義。但人類對象的血糖水平超過200毫克/分升(用 空腹血糖試驗、口服葡萄糖耐量試驗或隨機血糖試驗確定)時被診斷為糖尿病。因此，在某 些方面，血糖水平高于約200毫克/分升的人類對象是可以用本發(fā)明提供的方法或藥物用 途治療的合適對象?？梢杂帽景l(fā)明的方法治療的其它合適對象有腎小球濾過率受損。一實施方案中， 人類對象的腎小球濾過率高于正常腎小球濾過率，例如，高于約120毫升/分鐘。因此，腎 小球濾過率高于約120毫升/分鐘、高于約130毫升/分鐘、高于約140毫升/分鐘或高于 約150毫升/分鐘的人類對象是可以用本發(fā)明提供的方法或藥物用途治療的合適對象。在 不同實施方案中，還考慮降低腎小球濾過率升高的對象(例如，腎小球過度濾過和過度灌 注的對象)腎小球濾過率的方法可用來降低人類對象的腎小球濾過率到低于約150毫升/ 分鐘、低于約140毫升/分鐘、低于約130毫升/分鐘的水平或者到約120毫升/分鐘的水 平。本發(fā)明的方法和化合物可降低糖尿病動物模型與糖尿病或早期糖尿病腎病有關(guān) 的腎臟重量增加。(見實施例1。)因此，本發(fā)明考慮了治療或預(yù)防與腎臟重量增加有關(guān)的 腎病的方法，該方法包括給予患者或者有患病風(fēng)險的對象CTGF抑制劑，從而治療或預(yù)防這 種疾病。本發(fā)明還考慮了治療或預(yù)防與腎小球體積增加有關(guān)的腎病的方法，該方法包括給 予患者或者疑似患者CTGF抑制劑，從而治療或預(yù)防這種疾病。本發(fā)明的方法和化合物也用于預(yù)防、減輕或延遲有出現(xiàn)晚期腎病相關(guān)腎臟并發(fā)癥 風(fēng)險的對象這種并發(fā)癥的發(fā)作，或用來制造藥物，該藥物用于具有與這里所述晚期腎病有 關(guān)的任何疾病或癥狀的對象，優(yōu)選人類對象。一方面，所述人類對象的腎小球濾過率低于正 常腎小球濾過率，例如，低于約120毫升/分鐘。因此，腎小球濾過率低于約120毫升/分 鐘、低于約90毫升/分鐘、低于約60毫升/分鐘、低于約30毫升/分鐘或低于約15毫升 /分鐘的人類對象被認為是用本發(fā)明提供的方法或藥物用途治療的合適對象。在不同實施方案中，還考慮升高腎小球濾過率降低或受損的人類對象(例如，明 顯性糖尿病腎病患者)腎小球濾過率的方法可用來升高腎小球濾過率到高于約15毫升/ 分鐘、高于約30毫升/分鐘、高于約60毫升/分鐘、高于約90毫升/分鐘的水平以及到約 120毫升/分鐘的水平。某些實施方案中，所述腎病與1型或2型糖尿病有關(guān)。其它實施方案中，所述腎病 是糖尿病腎病。微白蛋白尿包括糖尿病腎病在內(nèi)的腎病的早期臨床證據(jù)是尿液中白蛋白水平異常降低，這種 癥狀被稱為微白蛋白尿。有微白蛋白尿的個體被認為患有初期腎病，或者，如果與糖尿病有關(guān)則患有初期糖尿病腎病。有微白蛋白尿的糖尿病個體發(fā)展成明顯性糖尿病腎病的風(fēng)險比正常白蛋白尿(normoalbuminuria)個體高 42% (Bruno 等，2003，Diabetes Care 26: 2150-2155)。因此，糖尿病個體出現(xiàn)和發(fā)展微白蛋白尿與發(fā)展成明顯性糖尿病腎病(即大 白蛋白尿)以及最終的末期腎病和腎衰竭的風(fēng)險大大提高有關(guān)。(見，例如，Mogensen和 Christensen (1984) N Engl J Med 311 :89_93 ；Mogensen 等，(1983) Diabetes 32 [增刊 2] 64-78 ;Viberti 等(1982)Lancet 1:1430-1432。)微白蛋白尿可用各種方法確定，其中包括(1)在隨機尿液點收集中測量白蛋白 肌酸酐比例；(2) 24小時尿液收集測量肌酸酐，同時測量肌酸酐清除率；和(3)定時(例如， 4小時或一夜)收集。人類的正常尿白蛋白排泄率小于30微克/毫克肌酸酐(點收集)， 小于30毫克/24小時(24小時收集)，或者小于20微克/分鐘(定時收集)。微白蛋白尿 患者的尿白蛋白排泄率為30-299微克/毫克肌酸酐(點收集)，30-299毫克/24小時(24 小時收集)，或者20-199微克/分鐘(定時收集)。大白蛋白尿(例如，臨床白蛋白尿)患 者的尿白蛋白排泄率大于或等于300微克/毫克肌酸酐(點收集)，大于或等于300毫克 /24小時(24小時收集)，或者大于或等于200微克/分鐘(定時收集)。本發(fā)明第一時間證實，抑制CTGF(例如，通過給予CTGF抗體)可降低與腎病尤其 是糖尿病腎病有關(guān)的尿白蛋白排泄率。(見，例如，實施例1。)尿白蛋白排泄率升高與腎小 球的白蛋白滲透性和選擇性的變化有關(guān)，并且是早期或發(fā)展中腎病腎功能改變或受損的指 示。一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF降低尿白蛋白排泄率的方法。另一方面，本發(fā)明 提供了通過抑制CTGF降低腎小球白蛋白滲透性和恢復(fù)腎小球選擇性的方法。再在另一方 面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF減輕微白蛋白尿的方法。因此，通過降低微白蛋白尿和尿 白蛋白排泄率，本發(fā)明的方法提供了治療早期腎病和初期腎病的方法。如上所述，在早期腎病中，微白蛋白尿(即初期腎病)的發(fā)生和發(fā)展與糖尿病患者 發(fā)生大白蛋白尿、明顯性腎病、末期腎病和腎衰竭的風(fēng)險增加有關(guān)。因此，本發(fā)明的方法和 組合物也可用于預(yù)防、減輕或延遲有出現(xiàn)晚期腎病相關(guān)腎臟并發(fā)癥風(fēng)險的對象這些并發(fā)癥 的發(fā)作，所述并發(fā)癥包括大白蛋白尿、明顯性腎病、末期腎病和腎衰竭。本發(fā)明證實，抑制CTGF(例如，通過給予CTGF抗體)可降低與腎病有關(guān)的蛋白尿、 BUN水平和肌酸酐清除率。蛋白尿、BUN水平和肌酸酐清除率升高是腎功能改變或受損以及 腎病發(fā)展的指示。一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來減輕蛋白尿的方法和化合物。另 一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF降低BUN水平的方法和化合物。另一方面，提供了通 過抑制CTGF降低肌酸酐清除率的方法和化合物。本發(fā)明證實，抑制CTGF(例如，通過給予CTGF抗體)能改善腎功能。當(dāng)糖尿病腎 病進行到晚期腎病時，例如通過菊糖清除率降低測得的腎小球濾過率下降是腎功能改變或 受損的指示。本發(fā)明還證實，抑制CTGF(例如，通過給予CTGF抗體)改善了與晚期腎病有 關(guān)的腎小球濾過率受損或降低。(見實施例3。) 一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF提高 腎小球濾過率的方法和化合物。另一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF降低菊糖清除率的 方法和化合物。再在另一方面，提供了通過抑制CTGF治療或預(yù)防腎功能受損，尤其是與糖 尿病腎病等腎病有關(guān)的腎功能受損的方法和化合物。另一方面，所述腎病與腎小球濾過率 降低、大白蛋白尿或明顯性腎病有關(guān)。晚期糖尿病腎病與腎臟的各種病理和形態(tài)變化有關(guān)。這種變化包括與基質(zhì)產(chǎn)生增加和腎小球系膜胞外基質(zhì)累積有關(guān)的腎小球系膜擴張；腎小球系膜細胞細胞擴大；晚期糖 尿病腎病中與腎小球硬化癥有關(guān)的腎小球基底膜增厚；以及腎小管間質(zhì)性纖維化的發(fā)展。 (Gilbert等，(1999)Kidney Int 56:1627-1673。)腎小球硬化癥和腎小管間質(zhì)性纖維化是 伴有腎機能不全從而導(dǎo)致腎小球濾過率降低并可能導(dǎo)致末期腎病和腎衰竭的晚期糖尿病 腎病的結(jié)構(gòu)性晚期腎病標(biāo)志。在本發(fā)明之前，CTGF與腎臟病理的晚期特征有關(guān)，尤其是產(chǎn)生過量胞外基質(zhì)、腎小球系膜基質(zhì)過分擴張和發(fā)生腎小球硬化癥(glomeruloscleorsis)和腎小管間質(zhì)性纖維 化。(見，例如，國際公布號WO 00/13706。)認為VEGF等其它因子引起與早期腎病有關(guān)的 過程、病理和各種特征，例如過度濾過和腎小球滲透性增加。相反，本發(fā)明提供的數(shù)據(jù)證明， 在腎病的早期和晚期癥狀的發(fā)展和進展中發(fā)揮重要作用，因此是完全且有效治療糖尿病腎 病的理想靶點。本發(fā)明提供了治療和預(yù)防早期及晚期糖尿病腎病各種臨床和病理方法的方法。具 體地說，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療或預(yù)防腎小球過度濾過和腎小球系膜基質(zhì)擴 張。因此，本發(fā)明考慮了治療腎病各個方面，包括諸如腎臟和腎小球肥大及過度濾過(測量 為肌酸酐清除率升高、尿白蛋白排泄率升高、腎小球濾過率升高等)等早期糖尿病腎病特 征以及晚期糖尿病腎病特征(腎小球濾過率降低、腎小球系膜基質(zhì)擴張、基底膜增厚等)的 方法。本發(fā)明提供了用于治療以結(jié)締組織生長因子(CTGF)作為介導(dǎo)因子的疾病或癥狀 的方法和組合物。文獻中已經(jīng)描述了一些CTGF相關(guān)疾??；然而在本發(fā)明之前都認為CTGF 主要與纖維增殖性癥狀，尤其是那些與TGFii有關(guān)的癥狀有關(guān)。盡管已經(jīng)提到許多涉及纖 維增殖過程的疾病以及用針對提供或防止CTGF活性的療法來治療這些疾病，本發(fā)明擴大 了這種理解，因此CTGF定向的療法用來治療與糖尿病腎病和腎病有關(guān)的各種非纖維增殖 性癥狀和并發(fā)癥。通過測量例如腎小球濾過率、尿白蛋白排泄率、白蛋白尿和/或蛋白尿可知，本發(fā) 明的方法，例如，抑制CTGF，有效降低了腎臟的過度濾過并使腎功能正?；蚧謴?fù)。因此，本發(fā) 明的方法和組合物可用來治療有糖尿病腎病風(fēng)險的患者，包括例如早期糖尿病腎病和初期 糖尿病腎病。這種對象包括診斷有高血糖、高血壓和/或糖尿病的個體。此外，本發(fā)明的方 法可用來治療被診斷有腎小球硬化癥、腎小球腎炎或糖尿病腎病等腎病的患者。本發(fā)明的方法，例如，抑制CTGF，減輕了腎小球系膜基質(zhì)擴張和腎小球基底膜增 厚。因此，本發(fā)明的方法可用來治療有糖尿病腎病危險的患者以預(yù)防白蛋白尿、腎小球濾過 率降低等。這種對象包括診斷有高血糖、高血壓和/或糖尿病的個體。此外，本發(fā)明的方法 可用來治療有明顯性糖尿病腎病或者其它腎病如腎小球硬化癥、腎小球腎炎等的患者。因此，一方面，本發(fā)明考慮了通過抑制CTGF來治療或預(yù)防與早期腎病或晚期腎病 有關(guān)的過程的方法。這些病理狀況包括，例如，過度濾過、白蛋白尿、蛋白尿、腎小球肥大和 腎小球系膜體積擴張。特別考慮了用本發(fā)明的方法來治療或預(yù)防以前與VEGF和TGF3有 關(guān)的早期和晚期腎病的方面。如上所述，該方法可用來治療有糖尿病腎病或相關(guān)病理風(fēng)險 的患者以及治療患有腎小球硬化癥(glomeruloscerosis)、腎小球腎炎、糖尿病腎病等腎病 的患者。本發(fā)明考慮將本發(fā)明的方法與其它療法聯(lián)用。一實施方案中，所述方法與另一種療法聯(lián)用，例如，以進一步增強對某些病理事件的治療效果。例如，可在治療時程內(nèi)或在疾 病進展和緩解后同時或相繼給予這兩種治療。另一實施方案中，所述方法與另一種具有 類似或不同作用模式的治療方法聯(lián)用，例如ACE抑制劑、ARB、抑制素、高級糖基化終產(chǎn)物 (AGE)抑制劑等。目前治療糖尿病腎病的治療方案是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，例如有 ACE抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑、抑制素、高級糖基化終產(chǎn)物抑制劑、肝細胞生長因子 基因治療、吡哆胺、依那普利(Enapril)、PPAR拮抗劑、磺酰脲類、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、 C0X-2抑制劑、吡非尼酮、舒洛地希、高劑量硫胺素和苯磷硫胺、鈣通道阻斷劑等。特別考慮 到與本發(fā)明的方法聯(lián)用的任何這些治療劑的用途。本發(fā)明首次提供了已經(jīng)證實的對兩種不同腎病相關(guān)病理方面(例如糖尿病腎病 的早期特征和晚期特征)的療效。盡管抗-CTGF療法在這里舉例是采用抗CTGF的人單克 隆抗體，但本發(fā)明包括任何抑制CTGF編碼基因表達、抑制CTGF產(chǎn)生或抑制CTGF活性的方 法。例如，可用小分子化合物來抑制CTGF表達、產(chǎn)生或活性。用環(huán)狀核苷酸抑制CTGF表 達時，這種化合物可包括，例如，環(huán)狀核苷酸類似物或磷酸二酯酶(PDE)抑制劑。(見，例 如，Duncan等，(1999)FASEB J 13 :1774_1786。)此外，包括小干擾核糖核酸(siRNA)、微小 RNA (miRNA)、核酶和反義序列在內(nèi)的多核苷酸可用于本發(fā)明的方法以抑制CTGF表達和/或 產(chǎn)生。(見，例如，Kondo 等，(2000)BiochemBiophys Res Commun 278 :119_124 ；和 Shimo 等，同上。)這種技術(shù)是相關(guān)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明提供了示例性證據(jù)證明，這里所述的在糖尿病動物模型中使用抗-CTGF 單克隆抗體方法能改善肌酸酐清除率和腎小球肥大、降低腎臟重量、抑制TGFii誘導(dǎo)的和 CTGF介導(dǎo)的腎小球纖維化和腎小球系膜擴張。因此，本發(fā)明的方法改善了糖尿病腎病的兩 種病理，即即腎小球系膜擴張和腎小球濾過。在某些方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來治療TGFii相關(guān)疾病的方法和組合 物。另一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來治療VEGF相關(guān)疾病的方法和組合物。再在另 一方面，本發(fā)明提供了通過抑制CTGF來治療TGFii和VEGF相關(guān)疾病的方法和組合物。本 發(fā)明的方法和組合物還可用來治療與其它生長因子如IGF-1、內(nèi)皮縮血管肽等有關(guān)的疾病。一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防與肌酸酐清除率升高有關(guān)的腎病的方法，該方 法包括給予患者或者有患病風(fēng)險的對象抑制CTGF的試劑(例如，抑制或降低CTGF表達或 CTGF活性)，從而治療或預(yù)防這種腎病。另一方面，本發(fā)明提供了通過給予患者或者有患病 風(fēng)險的對象CTGF抑制劑來治療或預(yù)防與腎小球濾過增加和過度濾過有關(guān)的腎病的方法， 從而治療或預(yù)防這種疾病。另一方面，本發(fā)明提供了通過給予患者或者有患病風(fēng)險的對象 CTGF抑制劑來治療或預(yù)防與基底膜增厚有關(guān)的腎病的方法，從而治療或預(yù)防這種疾病。另 一方面，本發(fā)明提供了通過給予患者或者有患病風(fēng)險的對象CTGF抑制劑來治療或預(yù)防與 尿體積增加有關(guān)的腎病的方法，從而治療或預(yù)防這種疾病。還提供了通過給予患者或者有 患病風(fēng)險的對象CTGF抑制劑來治療與尿白蛋白排泄率升高有關(guān)的腎病的方法，從而治療 或預(yù)防這種腎病。一方面，本發(fā)明提供了降低需要這種治療的對象的肌酸酐清除率的方法，所述方 法包括給予患者CTGF抑制劑。還提供了在需要這種治療的對象中降低尿白蛋白排泄率、降 低腎小球濾過和過度濾過、減輕腎小球體積擴張或減輕腎臟重量增加的方法，所述方法包 括給予患者CTGF抑制劑。一實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防與腎病有關(guān)的蛋白尿的方法，該方法包括給予腎病患者或者有患病風(fēng)險的對象CTGF抑制劑。再一實施方案中，所 述蛋白尿是白蛋白尿。在各實施方案中，所述白蛋白尿是微白蛋白尿或大白蛋白尿。另一 實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防腎臟基底膜增厚的方法，該方法包括給予腎臟基底 膜增厚的患者或者有患病風(fēng)險的對象CTGF抑制劑。再在另一實施方案中，本發(fā)明提供了通 過給予尿體積增加的患者或者有患病風(fēng)險的對象CTGF抑制劑來減輕或預(yù)防尿體積增加的 方法。本發(fā)明的方法包括給予需要治療的對象治療有效量的抑制CTGF的試劑(例如，降 低CTGF表達或活性)。某些實施方案中，所述試劑是CTGF抗體。在優(yōu)選的實施方案中，所 述抗體是CTGF的單克隆抗體。在另一優(yōu)選實施方案中，所述抗體是人或人源化CTGF抗體。 另一實施方案中，所述試劑是小分子。另一實施方案中，所述試劑是反義寡核苷酸。
已經(jīng)鑒定了抑制CTGF的各種試劑。美國專利No. 5，408，040 ；國際公布號 W099/07407 ；國際公布號WO 99/33878 ；和國際公布號WO 00/35936中描述了結(jié)合CTGF的 抗體。用于本發(fā)明方法的一種示例性抗體描述于國際公布號WO 2004/108764，該文獻全文 納入本文作為參考?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的任何方法施用這種抗體或其片段。 例如，抗體通常是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射的。抑制CTGF表達和/或活性的小分子也已經(jīng)描述過；例如，國際公布號W096/38172 將cAMP調(diào)節(jié)物如霍亂毒素和8Br-cAMP作為CTGF表達抑制劑。因此，諸如前列腺素和/或 前列環(huán)素類似物如伊洛前列素(見，例如，國際公布號W000/02450 ；Ricupero等，(1999)Am J Physiol 277 :L1165_1171 ；也可參見Ertl 等，(1992) Am Rev Respir Dis 145 :A19)以及 潛在的磷酸二酯酶IV抑制劑(見，例如，Kohyama等，(2002)Am J Respir Cell Mol Biol 26:694-701)等化合物可用來調(diào)節(jié)CTGF表達。同時，絲氨酸/蘇氨酸促分裂原活化的蛋白 激酶的抑制劑尤其是P38、依賴于細胞周期蛋白的激酶如CDK2以及糖元合酶激酶(GSK)-3 也可降低 CTGF 的表達。(見，例如，Matsuoka 等，(2002)Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 283 :L103_L112 ；Yosimichi 等，(2001)Eur J Biochem 268 :6058_6065 ；國際公布 號TO01/38532 ；和國際公布號W003/092584。)這些試劑可用來降低CTGF表達從而改善或 預(yù)防關(guān)節(jié)病中CTGF誘導(dǎo)的病理過程。這種化合物可按照本領(lǐng)域已知方法來配制和施用。反義技術(shù)，包括針對CTGF表達的小干擾核糖核酸(SiRNA)、微小RNA(miRNA)、核 酶和反義序列也可用來治療關(guān)節(jié)病。(見，例如，Zeng(2003)Proc Natl Acad Sci USAlOO 9779-9784 ；和 Kurreck (2003) Eur J Biochem 270 1628-1644。)靴向 CTGF 表達的反 義構(gòu)建物已經(jīng)描述過并被用來降低各種細胞類型中CTGF的表達。(見，例如，國際公布 號WO 96/38172 ；國際公布號WO 00/27868 ；國際公布號WO 00/35936 ；國際公布號WO 03/053340 ;Kothapalli 等，(1997)Cell Growth Differ 8(1) :61_68 ;Shimo 等，(1998) J Biochem(Tokyo) 124(1) 130-140 ；和 Uchio 等，(2004) Wound Repair Regenl2 :60_66。)這 種反義構(gòu)建物可用來降低CTGF的表達從而緩解或預(yù)防關(guān)節(jié)疾病中CTGF誘導(dǎo)的病理過程。 可用合適的載體和表達調(diào)節(jié)物來設(shè)計這種構(gòu)建物以細胞_或組織_特異性表達和組成型或 誘導(dǎo)型表達。可用本領(lǐng)域已經(jīng)建立的方法來制造和施用這種遺傳構(gòu)建物。藥物制劑和給藥途徑如該領(lǐng)域所熟知，本發(fā)明的組合物可直接傳遞或從含賦形劑的藥物組合物形成傳 遞。本發(fā)明的治療方法可包括給予患有糖尿病腎病，尤其是與例如腎小球過度濾過和腎小球過度灌注(hyperperfusion)、微白蛋白尿、初期糖尿病腎病、大白蛋白尿、明顯性腎病等有關(guān)疾病的對象或者有患病風(fēng)險的對象治療有效量的本發(fā)明化合物。在一優(yōu)選實施方案 中，所述對象是哺乳動物，在最優(yōu)選的實施方案中，所述對象是人。化合物或藥物的有效量，如劑量，不難用常規(guī)試驗確定，可作為有效和方便的給藥 途徑和適當(dāng)?shù)闹苿?。該領(lǐng)域已有各種制劑和藥物輸遞系統(tǒng)(見，例如，Germaro編，(2000) 《雷明頓藥物科學(xué)》，同上；和Hardman，Limbird以及Gilman編，(2001)，《治療的藥理學(xué)基 石出》(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，同)。合適的給藥途徑可包括，例如，口服、直腸、局部、鼻、肺、眼、腸道和腸胃道外給藥。 主要的腸胃道外給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下給藥。第二種給藥途徑包括腹膜內(nèi)、動 脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、心內(nèi)、腦池內(nèi)、皮內(nèi)、病灶內(nèi)、眼內(nèi)、胸膜內(nèi)、鞘內(nèi)、子宮內(nèi)和心室內(nèi)給藥。應(yīng)優(yōu) 選要治療的指征與藥物的物理、化學(xué)和生物學(xué)性能一起，規(guī)定制劑類型和所用的給藥途徑， 以及是否局部或全身輸遞。本發(fā)明化合物的藥物劑型可以即釋、控釋、緩釋或靶向藥物輸遞系統(tǒng)提供。常用 的劑型包括例如，溶液、懸浮液、(微)乳劑、軟膏、凝膠和貼片、脂質(zhì)體、片劑、糖衣丸、軟或 硬膠囊、栓劑、卵狀小體、植入物、無定形或結(jié)晶形粉末、氣溶膠和凍干制劑。取決于使用的 給藥途徑，可能需要特殊裝置來施加或給予藥物，例如，注射器和針頭、吸入器、泵、注射筆、 涂藥器或?qū)Ｓ闷?。藥物劑型常包含藥物、賦形劑和容器/密封系統(tǒng)。可在本發(fā)明的化合物 中加入一種或多種稱為無活性成分的賦形劑，以改善或有利于制造、穩(wěn)定性、藥物的給藥和 安全性，可提供一種實現(xiàn)藥物所需釋放方式的工具。因此，加入該藥物中的賦形劑的類型 取決于多種因素，例如藥物的理化性能、給藥途徑和制造方法。藥學(xué)上可接受的賦形劑該 領(lǐng)域已具有，包括各種藥典中所列出的那些(見，例如，美國藥典(USP)、日本藥典(JP)、歐 洲藥典(EP)和英國藥典(BP)；美國食品藥品管理局網(wǎng)頁(www. fda. gov)，《惰性成分指南》 (Inactivelngredient Guide) 1996，禾口《藥物添力口劑手冊》(Handbook ofPharmaceutical Additives), Ash 編；Synapse Information Resources Inc.,2002。)可用該領(lǐng)域熟知的任何方法制備本發(fā)明化合物的藥物劑型，如常規(guī)的混合法、過 篩、溶解、融化、制粒、糖衣丸制備、制片、懸浮、擠壓、噴霧干燥、研磨、乳化、(納米/微米)包 裹、截留或凍干加工。如上所述本發(fā)明的組合物可包含一種或多種生理上可接受的無活性 成分，以有利于將活性分子加工成制劑用于藥物用途。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所需的給藥途徑。對于靜脈注射，例如，該組合物可配制成水 溶液，如果需要，可采用生理相容性緩沖劑，包括例如，磷酸、組氨酸或檸檬酸來調(diào)節(jié)制劑的 PH，和采用張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉或葡萄糖。對于經(jīng)粘膜或鼻內(nèi)給藥，優(yōu)選半固體、液體制劑 或貼片，可含滲透增強劑，這類滲透增強劑是該領(lǐng)域通常知道的。對于口服給藥，可將該化 合物配制成液體或固體劑型，和即釋或控釋/緩釋制劑。適合對象口服的劑型包括片劑、丸 藥、糖丸、硬和軟殼膠囊、液體、凝膠、糖漿、糖漿、懸浮液和乳劑。該化合物也可配制在直腸 組合物中，如栓劑或保留灌腸劑中，如含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂或其它甘油?？刹捎觅x形劑獲得固體口服劑型，所述賦形劑包括填充劑、崩解劑、粘合劑(干或 濕的)、溶解阻滯劑、潤滑劑、助流劑、防粘劑、陽離子交換樹脂、潤濕劑、抗氧化劑、防腐劑、 著色劑和芳香劑。這些賦形劑可以是合成或天然來源的。這類賦形劑的例子包括纖維素衍 生物、檸檬酸、磷酸二鈣、明膠、碳酸鎂、月桂酸硫酸鎂/鈉、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸鹽、二氧化硅、苯甲酸鈉、山梨醇、淀粉、硬脂酸及其鹽、糖(即葡萄糖、蔗糖、乳糖 等)、滑石粉、西黃蓍膠漿、植物油(氫化的)和蠟。乙醇和水可作為制粒助劑。在某些情況 下，需要用例如掩蔽氣味的膜、抗胃酸膜、或釋放延緩膜來包裹片劑。常常聯(lián)用天然和合成 的聚合物與著色劑、糖、有機溶劑和水來包裹片劑，產(chǎn)生糖丸。當(dāng)膠囊優(yōu)選與片劑時，藥粉、 懸浮液或溶液可以相容的硬或軟殼膠囊來輸遞。在一實施方案中，可局部，例如通過皮膚貼片、半固體或液體制劑，如凝膠、(微) 乳劑、軟膏、溶液、(納米/微米)懸浮液、或泡沫給予本發(fā)明的化合物?？刹捎美?，滲透 促進劑；適當(dāng)選擇和組合親脂性、親水性和兩性賦形劑，包括水、有機溶劑、蠟、油、合成和天 然的聚合物、表面活性劑、乳化劑，通過調(diào)節(jié)PH、采用絡(luò)合劑，來調(diào)節(jié)藥物對皮膚和其下組織 的滲透?？刹捎闷渌夹g(shù)，如離子電滲療法，來調(diào)節(jié)本發(fā)明化合物對皮膚的滲透。優(yōu)選經(jīng)皮 或局部給藥，例如在需要最低限度全身接觸的情況下局部輸遞藥物。對于吸入給藥或鼻內(nèi)給藥，本發(fā)明的化合物可以溶液、懸液、乳劑或加壓包裝的半 固體氣溶膠形式或通常采用推進劑的噴霧器，如甲烷和乙烷、二氧化碳或任何其它合適的 氣體產(chǎn)生的商化碳方便地傳送。對于局部氣溶膠，可采用丁烷、異丁烷和戊烷類碳氫化合 物。就加壓氣溶膠而言，可通過提供一輸遞確定量氣溶膠的閥門來確定適當(dāng)?shù)膭┝繂挝?。?配制用于吸入器或吹入器中的膠囊和例如明膠盒。這些膠囊或盒通常含有化合物的混合粉 末和適合的粉末基質(zhì)，如乳糖和淀粉。通常以單位劑型，如在安瓿、注射器、注射筆或多劑量容器(常含有防腐劑)中，提 供配制的用于胃腸道外注射的無菌組合物。此組合物可采取懸液、溶液或油性乳劑或水性 載體形式，可含有配制試劑，如緩沖劑、滲透劑、粘性增強劑、表面活性劑、懸浮和分散劑、抗 氧化劑、生物相容性聚合物、螯合劑和防腐劑。取決于注射部位，載體可含水、合成的油或植 物油、和/或有機共溶劑。某些情況下，如凍干產(chǎn)品或濃縮產(chǎn)品時，可在給藥之前重建或稀 釋胃腸道外給藥制劑?？商峁┍景l(fā)明化合物控釋或緩釋的長效制劑，可包含納米/微米粒 或納米/微米級或非微化晶體的可注射懸浮液。聚合物，除該領(lǐng)域熟知的那些外，如聚(乳 酸)聚(羥乙酸)，或其共聚物或用作控釋/緩釋基質(zhì)?？梢灾踩胛锖托枰懈畹谋眯问教?供其它長效輸遞系統(tǒng)。本領(lǐng)域熟知適合靜脈注射本發(fā)明分子的載體，包括能形成離子化化合物的含堿如 氫氧化鈉的、作為滲透劑的蔗糖或氯化鈉的水基溶液，例如，含磷酸或組氨酸的緩沖液?？?加入共溶劑，如聚乙二醇。這些水基系統(tǒng)能有效溶解本發(fā)明的化合物，在全身給藥時產(chǎn)生低 毒性。溶液系統(tǒng)的組分比例可相當(dāng)不同而不破壞溶解性和毒性特征。另外，組分的同一性 可以改變。例如，可采用低毒的表面活性劑，如聚山梨酯或波洛沙姆，可加入聚乙二醇或其 它共溶劑、生物相容性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，其它糖和多元醇來代替葡萄糖。對于目前治療方法所用的組合物，起初可用本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)估計治療有效 劑量。動物研究所用的最初劑量可根據(jù)細胞培養(yǎng)試驗確定的有效濃度而定。適合人用的劑 量范圍可用動物研究和細胞培養(yǎng)所獲得的數(shù)據(jù)確定。本發(fā)明的化合物、藥劑或藥物的治療有效量或劑量，指該化合物或藥物可導(dǎo)致對 象的癥狀緩解或生存延長的量或劑量。這類分子的毒性和治療效果可通過在細胞培養(yǎng)或試 驗動物中進行標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序來確定，例如，通過測定LD50(導(dǎo)致50%群體死亡的劑量)和 ED50(50%群體治療有效的劑量)來確定。毒性和療效的劑量比值是治療指數(shù)，可用LD50/ED50比值表示。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的制劑。有效量或治療有效量是研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床人員所尋找的組織、系統(tǒng)、 動物或人誘發(fā)生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的所述化合物或藥物組合物的量，例如，能降低肌酸酐清 除率、腎小球過度濾過和過度灌注、尿白蛋白排泄或微白蛋白尿，或治療早期或晚期糖尿病 腎病，等等。優(yōu)選的劑量應(yīng)在包括ED50并有小或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。 劑量可在此范 圍內(nèi)根據(jù)所用的劑型和/或給藥途徑而變化。應(yīng)按照本領(lǐng)域已知方法根據(jù)對象狀況的特征 選擇精確的制劑、給藥途徑、劑量和劑量間隔?？蓚€別調(diào)整劑量和間隔以提供能充分獲得所需效果，如調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、減少血 糖水平等，即最低有效濃度(MEC)。各化合物的MEC不同但可從例如體外數(shù)據(jù)和動物試驗估 計。需要獲得MEC的劑量取決于個體的特征和給藥途徑。就局部給藥或選擇性攝入而言， 藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無關(guān)?？筛鶕?jù)多種因素，包括待治療對象的性別、年齡和體重、疾病的嚴(yán)重程度、給藥方 式和醫(yī)生的判斷確定給予的制劑或組合物的量。如果需要，本發(fā)明的組合物可以裝在含一個或多個單位劑型(含有活性成分)的 填裝或分散裝置中。例如，這種填裝或裝置可包括金屬或塑料箔，如起泡填裝物或玻璃和橡 皮塞如小瓶中。該填裝或分散裝置可裝有給藥說明書。也可制備用相容性藥學(xué)載體配制的 含本發(fā)明化合物的組合物，置于適當(dāng)?shù)娜萜髦校N上治療某種標(biāo)明疾病的標(biāo)簽。通過閱讀本文內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難實施本發(fā)明的這些和其它實施方 案。實施例參見以下實施例純粹是說明本發(fā)明的實施例將進一步了解本發(fā)明。提供這些實施 例只是為了說明本發(fā)明的權(quán)利要求。本發(fā)明不限于目的是說明本發(fā)明一個方面的示范性實 施例所述的范圍。功能上相等的任何方法都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得按照 以上描述和附圖可對本發(fā)明作出本文所述以外的各種修改。這類修改是在附加的權(quán)利要求 書的范圍內(nèi)。實施例1 治療糖尿病腎病的早期特征用本發(fā)明的方法來證實對早期糖尿病腎病某些方面動物模型的廣譜功效，如下進 行。從Harlan，Indianapolis IN獲得缺失瘦蛋白受體(Ob-R ；由db基因編碼)功能突變的 8周齡小鼠。這些db/db小鼠作為2型糖尿病肥胖動物模型，尤其是以糖尿病腎病的早期方 面為特征的2型糖尿病腎病肥胖模型，所述早期方面包括，例如，腎臟過度濾過和蛋白尿并 伴有輕微間質(zhì)纖維化。通過輕微間質(zhì)纖維化可以證明這是早期糖尿病腎病而不是晚期糖尿 病腎病動物模型。純合db/db (糖尿病)在8周齡時有高血糖。純合db/db (糖尿病)和雜 合db/+(非糖尿病)動物用抗-CTGF單克隆抗體(a CTGF)(按國際公布號WO 2004/108764 的描述制備或用ATCC鑒定的于2004年5月20日保藏的登錄號為ΡΤΑ-6006的細胞系制備) 或?qū)φ杖薎gG(ClgG)處理(腹膜內(nèi)注射)。對所有動物注射300微克抗體，然后注射100微 克，每周3次，共60天。在處理期開始時和期間周期性地收集血樣并測量體重。同時記錄 食物消耗。下表1顯示了第0天和第60天ClgG處理的db/+小鼠、α CTGF處理的db/+小鼠、clgG處理的糖尿病db/db小鼠和α CTGF處理的db/db小鼠的平均體重(BW)、血糖水平 (BG)和食物消耗(FC)。所有數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。每組小鼠的數(shù)目(η)為9_15。出 現(xiàn)多囊腎的非糖尿病(db/+)動物被排除在分析之外。如表1所示，糖尿病(db/db)動物和 非糖尿病(db/+)動物的體重、血糖水平和食物消耗有顯著差別。用抗-CTGF抗體或clgG 處理對糖尿病(db/db)或非糖尿病(db/+)動物的總體重增加、血糖水平或食物消耗沒有顯 著影響。表1 數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。*相比db/+小鼠P <0.01。抑制糖尿病腎病的早期特征的進展在上述抗-CTGF抗體處理期之后獲得腎功能和腎病的各種測量，包括腎臟重量、 肌酸酐清除率、尿白蛋白排泄率和尿體積。下表2顯示了 clgG處理的db/+小鼠、α CTGF處 理的db/+小鼠、clgG處理的db/db小鼠和α CTGF處理的db/db小鼠第60天的平均腎臟 重量(KW)、肌酸酐清除率(CrCl)和24小時尿白蛋白排泄率(UAE)。所有數(shù)據(jù)表示為平均 值士SEM。每組小鼠的數(shù)目(η)為9-15。如上所述，出現(xiàn)多囊腎的非糖尿病(db/+)動物被 排除在分析之外。表2 數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。**相比曲/+小鼠？<0.01。*相比db/+小鼠P < 0. 01和相比clgG處理的db/db小鼠P < 0. 05。八相比clgG處理的db/db小鼠P < 0. 01?！跸啾萪b/+小鼠和clgG處理的db/db小鼠ρ < 0. 01。如表2所示，如腎臟擴張(即腎臟重量增加)(圖1)、肌酸酐清除率升高(圖2)和 尿白蛋白排泄率升高(圖3，*相比抗-CTGF處理的db/+小鼠P <0.01)所指出的，db/db 小鼠的腎臟顯示功能亢進。用抗-CTGF抗體處理的糖尿病動物相比用clgG處理的糖尿病 動物顯示出腎臟重量增加較少。clgG處理的db/db動物的肌酸酐清除率約為在db/+動物中觀察到的值的兩倍，說 明糖尿病動物有腎功能受損、肥大和過度濾過。相比在非糖尿病db/+動物中觀察到的尿白 蛋白排泄率，糖尿病db/db動物的尿白蛋白排泄率也提高了。用抗-CTGF抗體處理的db/db 動物的肌酸酐清除率和尿白蛋白排泄率水平顯著低于在cTgG處理的db/db動物中觀察到 的值。具體地說，抗-CTGF處理的糖尿病小鼠的肌酸酐清除率水平比在clgG處理的糖尿病 小鼠中觀察到的值低82%。抗-CTGF處理的糖尿病小鼠的尿白蛋白排泄率水平比在clgG 處理的糖尿病小鼠中觀察到的值低69%。這些結(jié)果證實，抗-CTGF抗體處理的小鼠的腎功 能有驚人改善。用本發(fā)明的方法處理非糖尿病動物顯示對腎臟重量或功能無不良作用。這 些數(shù)據(jù)顯示，給予糖尿病動物抗-CTGF抗體能降低腎臟重量增加、肌酸酐清除率和尿白蛋 白排泄率。此外，相比非糖尿病(db/+)小鼠，糖尿病(db/db)小鼠顯示出增加的尿體積。如 上所述給予抗-CTGF抗體降低了糖尿病(db/db)小鼠的尿體積。(見圖5，*相比抗-CTGF 處理的db/+小鼠P <0.01。)該數(shù)據(jù)指出，給予糖尿病動物抗-CTGF抗體降低了尿體積。 這些結(jié)果還指出，抑制CTGF能降低與糖尿病腎病有關(guān)的尿體積增加，因此提供了改善腎功 能的方法。分析腎小球體積(例如，腎小球體積擴張的減少)和基底膜增厚的變化還證實 了抑制CTGF對于治療和預(yù)防糖尿病腎病發(fā)展和進展的作用。如圖6所示Γ沒有不同于 抗-CTGF處理的db/+)，用抗-CTGF抗體處理糖尿病(db/db)動物降低了基底膜增厚?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示，用抗-CTGF抗體處理糖尿病(db/db)動物減輕了腎肥大 (由降低了抗-CTGF處理的糖尿病動物的腎臟重量可以證實)并恢復(fù)了腎功能(由降低了 抗-CTGF處理的糖尿病動物的肌酸酐清除率和尿排泄率可以證實)。這些結(jié)果還指出，抑制 CTGF能夠降低腎小球滲透性和過度濾過，同時減輕腎小球系膜擴張和基底膜增厚。因此，抑 制CTGF能夠治療糖尿病腎病的早期特征。實施例2 =CTGF參與進行性玻璃體視網(wǎng)膜病的早期特征之前已經(jīng)建立了 CTGF和包括視網(wǎng)膜病癥在內(nèi)的眼病的關(guān)系。(見，例如，國際公布 號TO 03/049773。)這里檢測了 CTGF和VEGF的眼濃度與新血管形成和纖維化程度之間的 關(guān)系以確定，如果有的話，玻璃體CTGF和VEGF表達之間的關(guān)系。提示CTGF和早期和晚期眼病癥狀有關(guān)。從準(zhǔn)備進行睫狀環(huán)玻璃體切割術(shù)的增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)、增生型 糖尿病性視網(wǎng)膜病變(PDR)、黃斑皺褶或黃斑裂孔患者獲得未稀釋的玻璃體樣品(0. 5-1毫 升)。玻璃體液樣品收集在無菌管中，立即用干冰冷凍，并于-80°C儲存到測定CTGF和VEGF。與所有視網(wǎng)膜病癥有關(guān)的新血管形成如下分級0級，無新血管形成；1級，靜態(tài)新 血管形成，只存在未灌注的膠質(zhì)管(gliotic vessel)；和2級，動態(tài)新血管形成，有灌注的 視網(wǎng)膜前毛細管。(見 Aiello 等，(1994)N Engl J Med 331 :1480_1487。)通過ELISA測量玻璃體樣品內(nèi)CTGF和VEGF的水平。簡言之，將玻璃體樣品在 14，OOOrpm離心15分鐘，并于4°C收集上清。用人CTGF的兩種單克隆抗體通過夾心ELISA 測量CTGF水平，每種單抗特異性識別CTGF N-末端部分的不同區(qū)域，如上所述。將捕獲的 抗-CTGF單克隆抗體(10微克/毫升)加入涂布緩沖液(50mM硼酸鈉，pH 9.6)，在41用 其涂布微量滴定板過夜。平板用100微升以磷酸緩沖鹽水緩沖的BSA在室溫封閉2小 時，然后用洗滌緩沖液(含有0.05% Tween 20的磷酸緩沖鹽水)洗滌。玻璃體樣品用分 析緩沖液(50mM TRIS, pH 7. 7,0. 1% BSA, 4mM MgCl2,400mM ZnCl2,0. 05% NaN3, 50 毫克 / 升肝素鈉和0.1% Triton X-100)稀釋5倍。在每個孔中加入50微升稀釋的玻璃體樣品 以及50微升生物素化的單克隆抗人CTGF檢測抗體(稀釋于分析緩沖液)。平板在37°C培 育2小時，用洗滌緩沖液洗滌，并與100微升/孔鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的堿性磷酸酶(1 微克/毫升，稀釋于分析緩沖液)(Jackson Immunoresearch Laboratories)在室溫培育1 小時。這次培育之后用洗滌緩沖液洗滌平板并在每個孔中加入100微升稀釋于二乙醇胺緩 沖液(1M 二乙醇胺，0. 5mM MgCl2, 0. 02% NaN3, pH 9. 8)的底物溶液(1毫克/毫升，對硝基 苯磷酸，SigmaChemical Co.)。在Bio-Rad微板閱讀器上讀取405納米的吸光度。用純化 的重組人CTGF作為標(biāo)準(zhǔn)。用市售的夾心ELISA按照制造商(R&D Systems)的說明測定 VEGF-165的玻璃體水平。觀察到CTGF水平和新血管形成程度明顯正相關(guān)(ρ = 0. 0153)。如下表3所示，新 血管形成程度最高(2級)的患者的CTGF水平明顯高于新血管形成程度較低(0級或1級) 的患者。圖4顯示玻璃體內(nèi)CTGF和VEGF水平正相關(guān)(r = 0. 544，ρ = 0. 001)。顯然，這 些結(jié)果首次證實，從疾病相同階段的同一樣品測得的CTGF和VEGF水平之間直接相關(guān)。表3 上述實驗結(jié)果顯示，CTGF存在于人玻璃體內(nèi)且其濃度與新血管形成的存在和程度 顯著且強烈地相關(guān)，同時CTGF的玻璃體水平與VEGF的玻璃體水平強烈相關(guān)。雖然已知CTGF 與眼纖維化和視網(wǎng)膜病其它晚期方面的發(fā)展和進展有關(guān)，將該結(jié)果和文中實施例1和實施 例3的結(jié)果結(jié)合可以看出，CTGF和VEGF是包括糖尿病腎病和各種玻璃體視網(wǎng)膜病在內(nèi)的
21進行性疾病早期發(fā)展的關(guān)鍵因子。因此，本發(fā)明提供了治療PVR、PDR等視網(wǎng)膜病早期(例 如，新血管形成)和晚期(例如，纖維化)階段的方法。實施例3 治療糖尿病腎病的晚期特征 在晚期糖尿病腎病動物模型中檢測了抗-CTGF療法的效果。如上所述，采用對單 側(cè)腎缺血再灌注高度易感的糖尿病大鼠作為動物模型，單側(cè)腎缺血再灌注會迅速導(dǎo)致進行 性腎病和末期腎衰竭，同時伴有纖維化發(fā)展、腎萎縮和腎小球濾過率嚴(yán)重受損。(見，例如， Melin等，(1997)Kidney Int 52 :985_991。)在這種糖尿病動物模型中，缺血嚴(yán)重損害了糖 尿病大鼠的腎功能。在這種動物模型中，對腎功能以及高血糖和缺血病理學(xué)的腎臟效應(yīng)類 似于在人晚期糖尿病腎病和末期腎病(ESRD)中觀察到的效應(yīng)。通過靜脈注射一次鏈脲菌素(STZ) (50毫克/千克)在雄性Sprague Dawley大鼠 內(nèi)誘發(fā)糖尿病。夾住左腎動脈30分鐘在一個腎中造成單側(cè)腎缺血再灌注(IR)，從而防止 血液流到左腎。腎缺血再灌注前1天(即糖尿病發(fā)展2周后)開始用抗-CTGF單克隆抗體 (腹膜注射5毫克/千克)治療，治療每周3次，持續(xù)10周。給予未接受抗-CTGF抗體的對 照動物PBS (腹膜注射5毫升/千克)。從尾靜脈獲得血樣。在第0、4、8和10周由Quality Clinical Labs, Inc. (Mountain View, CA)分析血液臨床化學(xué)。在第5和9周確定24小時 總尿蛋白。將各大鼠放在代謝籠中并收集24小時尿樣。測量尿液體積并用BCA蛋白質(zhì)測 定試劑盒(Pierce Chemical Co.)分析尿蛋白。腎小球濾過率(GFR)是腎功能的最廣泛測量。菊糖清除率是腎小球濾過率的測 量。在這些實施方案中，通過測量尿體積和菊糖清除率確定了個體腎臟的腎小球濾過率 (例如，腎功能)。通過輸尿管收集尿液并從股動脈收集血液。通過重量分析估算尿體積。 用蒽酮法確定菊糖濃度。用以下公式確定GFR的指示-菊糖清除率(Uitft XUmJ/S^^。 在試驗結(jié)束時切除腎臟進行生化和組織病理學(xué)評價。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-SEM。采用單向方差分析(ANOVA)和Student-Newman-Keuls 法(SIGMASTAT)比較各時間點時實驗組的數(shù)據(jù)。當(dāng)只比較兩組時采用t-檢驗(兩樣品假 設(shè)等同方差分析工具，Microsoft Excel)。P < 0. 05的值被認為是顯著的。從血糖水平上升可知，給予單次劑量STZ的動物患上糖尿病。血糖水平從對照(非 STZ處理的)動物的低于200毫克/分升上升到STZ處理的動物大于600毫克/分升的水 平，說明這些動物患有糖尿病。非糖尿病(即非STZ處理的)動物的腎IR未使血糖水平上 升超過對照動物的水平(數(shù)據(jù)未顯示)。在單側(cè)腎IR后的10周內(nèi)，STZ處理的動物的血糖 水平仍舊升高。(數(shù)據(jù)未顯示。)晚期蛋白尿早期糖尿病腎病的微白蛋白尿特征進展成大白蛋白尿和晚期蛋白尿。在糖尿病 動物中觀察到24小時總尿蛋白顯著升高(即晚期蛋白尿)，說明腎小球過度濾過增加和腎 衰竭發(fā)展。如圖7所示，非糖尿病動物(偽處理(sham)+PBS ;IR+PBS)的總尿蛋白約為100 毫克/24小時。(在圖7中，在相應(yīng)的周，*表示高于非糖尿病(P < 0.001)，#表示低于 DM+IR+PBS(p<0. 05)。)然而，有腎IR的糖尿病動物的總尿蛋白水平超過350毫克/24小 時。與未處理的糖尿病動物相比，給予有腎IR的糖尿病動物抗-CTGF抗體導(dǎo)致第5和9周 的24小時總尿蛋白分別顯著降至約225毫克/24小時和250毫克/24小時。(見圖7。) 該數(shù)據(jù)顯示，給予CTGF抗體降低了糖尿病動物的蛋白尿。這些結(jié)果說明，抑制CTGF是降低腎臟過度濾過的一種治療方法。這些結(jié)果首次證實，抗-CTGF療法可用來預(yù)防晚期蛋白尿
的發(fā)展和進展。 血尿素氮(BUN) BUN水平升高是與晚期糖尿病腎病有關(guān)的腎功能受損的指示。在這些糖尿病動物中觀察到BUN水平顯著升高。在研究的第0、4和10周對照非糖尿病動物(偽處理+PBS ； IR+PBS)的BUN水平低于20毫克/分升。在有腎IR的糖尿病動物中，BUN水平從第0周的 約22毫克/分升升高到40毫克/分升以上。(見圖8，在第4周，*表示高于偽處理+PBS 和IR+PBS (ρ <0.01), #表示低于DM+IR+PBS (ρ < 0. 01)。)與在未給予抗-CTGF抗體的糖 尿病動物中觀察到的值相比，給予有腎IR的糖尿病動物抗-CTGF單克隆抗體導(dǎo)致第4周和 第10周的BUN水平分別下降到約30毫克/分升和35毫克/分升。(見圖8。)這些結(jié)果 首次顯示，抗-CTGF療法能用于降低糖尿病(對象)的BUN水平，提示抑制CTGF提供了一 種改善腎功能的治療方法。腎小球濾過率確定上述各種不同試驗條件下個體腎臟的腎小球濾過率。在對照動物(即非糖尿 病，非-IR)中，GFR大于0.3毫升/分鐘/腎臟/100克。有腎IR的非糖尿病動物的GFR約 為0. 28毫升/分鐘/腎臟/100克。無腎IR的糖尿病動物的GFR約為0. 17毫升/分鐘/ 腎臟/100克。(數(shù)據(jù)未顯示。)糖尿病動物缺血腎臟的腎小球濾過率在第10周急劇降至約0. 01毫升/分鐘/腎 臟/100克。(見圖9。)給予抗-CTGF抗體使受腎IR影響的糖尿病動物個體腎臟的腎小球 濾過率顯著提高至高于0. 035毫升/分鐘/腎臟/100克的水平。該數(shù)據(jù)顯示，給予CTGF 抗體使患有晚期腎病是糖尿病動物的腎小球濾過率升高。這些結(jié)果首次證實，抗-CTGF療 法可有效提高晚期糖尿病腎病的腎小球濾過率，因此提供了一種改善晚期腎病(對象)的 腎功能的治療方法。除了本文所示和描述的以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得可根據(jù)上述描寫對本發(fā)明作各 種修改。這些修改都在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有參考文獻的內(nèi)容納入本文作參考。
權(quán)利要求
結(jié)締組織生長因子(CTGF)抑制劑在制備用于治療患有糖尿病的對象中的蛋白尿用的藥劑中的用途，其中，所述抑制劑是抗CTGF抗體、抗CTGF反義核酸或?qū)TGF特異的siRNA、miRNA或核酶。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥物用于降低該對象的蛋白尿。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述對象患有糖尿病腎病。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述抗CTGF抗體從2004年5月20日保藏的ATCC 保藏號為PTA-6006的細胞系獲得。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述對象是人。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述抑制劑或藥物降低所述對象肌酸酐清除率。
7.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述抑制劑或藥物減少所述對象中的腎 小球過度濾過、腎小球過度灌注、腎小球肥大和/或腎小球濾過率。
8.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述抑制劑或藥物減少該對象的尿白蛋 白排泄或白蛋白尿。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述白蛋白尿是微白蛋白尿和大白蛋白尿。
10.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述抑制劑或藥物降低該對象中的血 尿素氮(BUN)水平。
11.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述抑制劑或藥物降低該對象中的菊糖清除率。
12.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述抑制劑或藥物改善該對象的腎功 能或減輕或預(yù)防該對象的腎臟重量增加。
13.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述抑制劑或藥物與抑制量的血管緊 張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管緊張素受體阻斷劑聯(lián)合給予。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療糖尿病腎病的特定早期癥狀和晚期癥狀的方法和化合物。還提供了治療與早期和晚期糖尿病腎病有關(guān)的各種生理特征的方法和化合物。
文檔編號C07K16/22GK101884789SQ20101023125
公開日2010年11月17日 申請日期2005年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月11日
發(fā)明者A·弗勒比杰根, D·Y·劉, N·A·奧利弗, Q·王, T·B·內(nèi)夫, W·R·尤辛格, 郭廣杰 申請人:法布羅根股份有限公司