本發(fā)明涉及五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)，涉及它的制備方法，涉及它的溶血栓活性以及涉及它治療缺血性中風(fēng)的作用，因而本發(fā)明涉及它在制備溶血栓藥物以及治療缺血性中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

缺血性中風(fēng)是一類較常見且危害嚴(yán)重的腦血管疾病，特點(diǎn)是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風(fēng)面臨沒有有效藥物的現(xiàn)實(shí)，尤其中風(fēng)面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對中風(fēng)面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經(jīng)公開式I的咪唑啉化合物在中風(fēng)面24h的大鼠缺血性中風(fēng)模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa₁和aa₂可為同時(shí)存在，aa₁存在但aa₂不存在，或同時(shí)不存在；當(dāng)aa₁和aa₂同時(shí)存在時(shí)，aa₁為R(Arg)，且aa₂為G(Gly)，A(Ala)或Q(Gln)；當(dāng)aa₁存在但aa₂不存在時(shí)，aa₁為R(Arg)；aa₃可為S(Ser)，V(Val)或F(Phe)。由于式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys。而該Lys的側(cè)鏈氨基和主鏈羧基分別與RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相連接，所以結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜需要簡化。

發(fā)明人經(jīng)過3年實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)用五甲氧色胺基羰丙?；媸絀的2-(4-氧乙酰基)苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉咪唑啉基取代可以獲得結(jié)構(gòu)簡單和療效好的意想不到的技術(shù)效果。按照這個(gè)發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供下式的五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)。

本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)的制備方法，該方法包括以下步驟：

1)制備五甲氧色胺基羰丙酸；

2)制備Boc-Pro-Ala-OBzl；

3)制備Boc-Pro-Ala；

4)制備Boc-Pro-Ala-N^ω-Z-Lys-OBzl；

5)制備HCl Pro-Ala-N^ω-Z-Lys-OBzl；

6)制備Boc-N^G-NO₂-Arg-Pro-Ala-N^ω-Z-Lys-OBzl；

7)制備Boc-N^G-NO₂-Arg-Pro-Ala-N^ω-Z-Lys；

8)制備N^α-五甲氧色胺基羰丙酰-N^ω-Fmoc-Lys-OBzl；

9)制備N^α-五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-OBzl；

10)制備N^α-五甲氧色胺基羰丙酰-N^ω-Boc-N^G-NO₂-Arg-Pro-Ala-N^ω-Z-Lys-Lys-OBzl；

11)將N^α-五甲氧色胺基羰丙酰-N^ω-Boc-N^G-NO₂-Arg-Pro-Ala-N^ω-Z-Lys-Lys-OBzl脫保護(hù)得N^α-五甲氧色胺基羰丙酰-N^ω-Arg-Pro-Ala-Lys-Lys。

本發(fā)明的內(nèi)容之三是評價(jià)五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)的溶血栓活性以及治療缺血性中風(fēng)的作用。

附圖說明

圖1.五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)的合成路線.(a)DCC，HOBt，NMM，THF；(b)2N NaOH，THF；(c)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；(d)哌啶/DMF(e)丁二酸酐；(f)TFA/TFMSA。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1接肽通法

將1mmol羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入1.2mmol N-羥基苯駢三氮唑(HOBt)和干燥THF溶解的1.2mmol N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，攪拌0.5h，將1.05mmol氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，N-甲基嗎啉(NMM)調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3 次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，10/1)析純化后得到目標(biāo)化合物。

實(shí)施例2脫除N-叔丁氧羰基保護(hù)基通法

將1mmol含有N-叔丁氧羰基保護(hù)基的化合物用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入10mL 4N氯化氫/乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌1-2h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液減壓濃縮。殘留物加5ml無水乙酸乙酯，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。殘留物加5ml無水乙醚，，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。得到的目標(biāo)化合物直接用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例3水解脫除芐酯保護(hù)基通法

將含有芐酯保護(hù)基的化合物溶于甲醇，冰浴和攪拌下緩慢滴加2M NaOH水溶液，調(diào)至pH12，反應(yīng)5h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH7，減壓濃縮除去甲醇，剩余的水溶液在冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH3，乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯層用飽和NaCl水溶液洗3次，用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到目標(biāo)化合物。

實(shí)施例4氫解脫除芐酯保護(hù)基通法

將含有芐酯保護(hù)基的化合物溶于甲醇，加入Pd/C(反應(yīng)物量的20％)，減壓抽出反應(yīng)體系內(nèi)的空氣，通入氫氣，室溫?cái)嚢?0h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去Pd/C，濾液減壓濃縮，得到目標(biāo)化合物。

實(shí)施例5制備五甲氧色胺基羰丙酸

由1.9g(10.0mmol)五甲氧色胺溶于干燥THF，冰浴攪拌下加入1.20g(12.0mmol)丁二酸酐，用NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干后得到2.81g(96.9％)標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS(m/e)：289[M-H]-。

實(shí)施例6制備Boc-Pro-Ala-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由0.84g(3.90mmol)Boc-Pro和1.30g(3.7mmol)HCl·Ala-OBzl得到1g(72％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：377[M+H]⁺。

實(shí)施例7制備Boc-Pro-Ala

按照實(shí)施例3水解脫除芐酯保護(hù)基通法從1g(2.66mmol)Boc-Pro-Ala-OBzl得0.7g(92％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：285[M-H]^-。

實(shí)施例8制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由1.0g(3.7mmol)Boc-Pro-Ala和1.25g(3.10mmol) HCl·Lys(Z)-OBzl得到1.5g(76％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：639[M+H]⁺。

實(shí)施例9制備HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實(shí)施例2脫除N-叔丁氧羰基保護(hù)基通法從1g(1.6mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到的目標(biāo)化合物直接用于下步反應(yīng)。ESI-MS(m/e)：639[M+H]⁺。

實(shí)施例10制備Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由1.5g(4.60mmol)Boc-Arg(NO₂)和1.30g(3.7mmol)HCl·Ala-OBzl得4.46g(69％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：841[M+H]⁺。

實(shí)施例13制備Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)

按照實(shí)施例3水解脫除芐酯保護(hù)基通法從1g(1.19mmol)Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到0.89g(100％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：749[M-H]^-。

實(shí)施例14制備五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Fmoc)-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由207mg(0.69mmol)五甲氧色胺基羰丙酸和0.283g(0.62mmol)Lys(Fmoc)-OBzl得0.218g(48％)標(biāo)題化合物。ESI-MS(m/e)：731[M+H]⁺。

實(shí)施例15制備五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-OBzl

冰浴下將0.5g(0.68mmol)五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Fmoc)-OBzl溶于1mL 20％哌啶/DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，反應(yīng)30分鐘，TLC(CHCl₃/CH₃OH，5/1)顯示原料點(diǎn)消失。加入乙醚使固體析出，過濾得標(biāo)題化合物，為無色固體，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/e)：508[M+H]⁺。

實(shí)施例16制備五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由0.188g(0.25mmol)Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)和0.153g(0.3mmol)五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-OBzl得0.133g(43％)標(biāo)題化合物。ESI-MS(m/e)：1241[M+H]⁺。

實(shí)施例17制備五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)(1)

冰浴下將100mg(0.081mmol)五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-OBzl與1mL三氟乙酸和0.33mL三氟甲磺酸混合，攪拌40min，倒入50mL無水乙醚，使析出沉淀。固體用無水乙醚反復(fù)洗滌并減壓濃縮，得到的淡黃色粉末用水溶解，用氨水調(diào)pH8，經(jīng)Sephadex G10除鹽，用C18柱純化(洗脫劑＝甲醇∶水＝5∶95)，收集的餾分凍干，得29mg(47％)標(biāo)題化合物，為無色固體。Mp：140.1-143.7℃；ESI-MS(m/e)：871[M+H]⁺。

實(shí)驗(yàn)例1評價(jià)化合物1的溶血栓活性

SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg^-1的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠后將其仰臥位固定，分離其右頸總動(dòng)脈，近心端處夾住動(dòng)脈夾，將近心端及遠(yuǎn) 心端分別穿入手術(shù)線，遠(yuǎn)心端的手術(shù)線結(jié)扎，遠(yuǎn)心端插管，將動(dòng)脈夾松開，取出約1mL動(dòng)脈血，置于1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長15mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內(nèi)注入0.1ml大鼠動(dòng)脈血，隨后在管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼材質(zhì)的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長10mm，內(nèi)含15個(gè)螺圈，螺圈的直徑為1.0mm，托柄與螺旋相連，長約7.0mm，呈問號型)。血液凝固45min后，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。

旁路插管由三部分構(gòu)成，中間段為長60.0mm，內(nèi)徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長100.0mm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長約10.0mm(用于插入大鼠頸動(dòng)脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))，3段管的內(nèi)壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環(huán)的過程中不會(huì)漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。

分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述制備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時(shí)遠(yuǎn)離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋。用注射器通過另一端的尖管注入準(zhǔn)確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時(shí)注射器不要撤離聚乙烯管，用動(dòng)脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動(dòng)脈的近心端用動(dòng)脈夾止血，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在離動(dòng)脈夾不遠(yuǎn)處將右頸總動(dòng)脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動(dòng)脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號手術(shù)縫線將動(dòng)靜脈固定。

用頭皮針將生理鹽水(3ml/kg)或尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IU/kg)或化合物1的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)，扎入遠(yuǎn)離血栓固定螺旋的近靜脈端，松開動(dòng)脈夾，使血流通過旁路管道從動(dòng)脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動(dòng)脈的順序作用于螺旋的血栓上。血液循環(huán)1h之后，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計(jì)算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環(huán)前后血栓的重量差，以均值±SD mg表示并代表溶血栓活性，作t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)列入表1。結(jié)果表明100nmol/kg化合物1能有效地溶解形成的血栓。100nmol/kg化合物1溶解血栓的活性與20000IU/kg尿激酶相當(dāng)。說明結(jié)構(gòu)簡化之后，技術(shù)效果明顯。

表1 化合物1的溶栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01，與尿激酶比p＞0.05。

實(shí)驗(yàn)例2評價(jià)化合物1對缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用

在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。用無創(chuàng)動(dòng)脈夾分別夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈開口處和頸總動(dòng)脈近心端，結(jié)扎頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端，在頸外動(dòng)脈剪一小口，松開頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾，取10μl血，之后再用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈的近心端。將取得的10μl血放置在1ml EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置1小時(shí)，使血液凝塊結(jié)實(shí)。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為400mg/kg。取出血液凝塊，加入1ml生理鹽水，用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細(xì)小血栓塊，制備細(xì)小血栓的懸液并轉(zhuǎn)移至1ml注射器內(nèi)。松開頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾，將1ml血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動(dòng)脈向近心端經(jīng)過頸內(nèi)動(dòng)脈注入大鼠的大腦，然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，打開頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈處得動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流。等待蘇醒。大鼠蘇醒24小時(shí)后按Zealonga方法評定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無任何神經(jīng)功能缺失體征、1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展、2分表示向未損傷側(cè)行走、3分表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走、4分表示意識(shí)障礙無自主行走、5分表示死亡。按照得分平均分組。各組大鼠經(jīng)尾靜脈每天注射1次化合物1，劑量為100nmol/kg。連續(xù)注射6天，每天評分。結(jié)果列入表2。數(shù)據(jù)表明化合物1連續(xù)治療6天使3只腦缺血24小時(shí)的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分為0分，使11只腦缺血24小時(shí)的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分為1分。因?yàn)椴幌褚呀?jīng)公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg，后5次維持劑量需要2μmol/kg，化合物1的6次劑量均為100nmol/kg。這樣一來，首次劑量和維持劑量分別降低了50倍和20倍。加上結(jié)構(gòu)簡化的好處，本發(fā)明獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表2化合物1連續(xù)治療6天對腦缺血24小時(shí)大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分的影響

n＝14。