本發(fā)明屬于煙草化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種煙葉中FⅠ蛋白提取和分離純化方法。
背景技術(shù)：
：隨著對(duì)葉蛋白研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到植物葉蛋白是世界上最豐富的蛋白資源,是解決當(dāng)前世界人口日益膨脹問(wèn)題的一個(gè)新的食物蛋白來(lái)源。特別是在我國(guó)人多地少日益突出的情況下，充分利用植物葉片提取可食用的蛋白質(zhì)更是迫在眉睫，自然界的葉片資源非常豐富，當(dāng)前最主要用于蛋白質(zhì)提取的是煙草葉片，由于煙草葉片資源豐富，提取過(guò)程簡(jiǎn)單，易于結(jié)晶。我國(guó)是世界上煙草產(chǎn)量最大的國(guó)家，煙草種植中不可避免地會(huì)產(chǎn)生大量低次煙葉，約占年生產(chǎn)煙葉的20%，社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益受到嚴(yán)重影響。如何充分、合理地利用這些低次煙葉，無(wú)疑是一項(xiàng)值得充分研究的課題。而且由于世界性戒煙運(yùn)動(dòng)的逐步普及，煙草的傳統(tǒng)用途將逐步減少，這將嚴(yán)重沖擊煙草的種植和加工業(yè)。因此人們對(duì)煙草的興趣，已開(kāi)始從直接生產(chǎn)卷煙，轉(zhuǎn)向用它生產(chǎn)其它植物用品，如提取FI蛋白等，以作它途。煙草葉片蛋白質(zhì)含量較高，其在白肋煙中的含量高達(dá)20.48%。煙葉中的蛋白質(zhì)分為可溶性蛋白和不可溶性蛋白?？扇苄缘鞍字幸话胱笥沂侨~綠體蛋白質(zhì)(FractionIprotein,FI蛋白)，另一半為其他可溶性蛋白質(zhì)的復(fù)合物(FractionIIprotein,FII蛋白)。煙草FI蛋白是目前已知的自然界唯一可以被大量結(jié)晶的植物Rubisco，其結(jié)晶為白色或米白色粉末。而煙草中所含的組分FI可溶性蛋白質(zhì)，由于其純凈、易于分離、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而最具開(kāi)發(fā)前景。有研究表明，從煙草中提取的可供食用的蛋白質(zhì)含有人體所需的全部必需氨基酸，其吸水性、乳化性、發(fā)泡性和凝膠性均優(yōu)于酪蛋白(牛奶的主要蛋白成分)。從營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)療和食品角度來(lái)評(píng)價(jià)，煙草蛋白屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。目前，意大利、美國(guó)、法國(guó)、印度和保加利亞等國(guó)正在研究和開(kāi)發(fā)煙草中所含的這種晶態(tài)蛋白質(zhì)。相比之下，我國(guó)在這方面的研究工作則報(bào)道較少，鑒于此，本研究通過(guò)總結(jié)國(guó)內(nèi)外前人研究的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合我國(guó)的實(shí)際情況開(kāi)發(fā)出一套適合大規(guī)模投入生產(chǎn)的新方法，實(shí)現(xiàn)我國(guó)煙草生產(chǎn)中低次煙葉變廢為寶，增加農(nóng)民的收入。以期對(duì)我國(guó)煙草新用途的研究及開(kāi)發(fā)有所裨益。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種煙葉中FⅠ蛋白提取和分離純化方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的煙葉中FⅠ葉蛋白提取和分離純化方法包括樣品采集、FⅠ葉蛋白提取、FⅠ葉蛋白分離、FⅠ葉蛋白純化、FⅠ葉蛋白結(jié)晶步驟，具體包括：A、樣品采集：采集綠色煙葉，然后避光存放6~24h（不超過(guò)24h）直至葉片出現(xiàn)輕度萎蔫備用；B、FⅠ葉蛋白提?。簩步驟得到的煙葉片去掉主脈，置入組織搗碎機(jī)中，加入煙葉片重量體積0.1~0.3倍的0.1MNaCl溶液，同時(shí)加入煙葉片重量0.04~0.06倍的711陰離子交換樹(shù)脂，用組織搗碎機(jī)磨漿0.5~1.5min得到勻漿液，將勻漿液過(guò)濾得到濾液，調(diào)節(jié)濾液的pH值為7.3~7.6，快速加熱濾液至45~55℃，并維持20~40min，然后迅速冷卻至20℃，然后轉(zhuǎn)入離心機(jī)離心得到離心上清液；C、FⅠ葉蛋白分離：取B步驟的離心上清液，用(NH4)2SO4鹽析，取45%～55%鹽析出的蛋白質(zhì)沉淀段得到沉淀a；D、FⅠ葉蛋白純化：將沉淀a用柱平衡緩沖液溶解得到蛋白初溶液b，將蛋白初溶液b通過(guò)經(jīng)緩沖液平衡過(guò)的葡聚糖凝膠G-50柱，以1.5ml/min的流速洗脫，收集第6~7ml的洗脫液即為分離得到的FⅠ葉蛋白溶液；E、FⅠ葉蛋白結(jié)晶：向收集的FⅠ葉蛋白溶液中加入等體積的0.025MTris-Cl，pH7.4緩沖液得到稀釋后的蛋白流出液，于4℃靜置結(jié)晶得到FⅠ葉蛋白結(jié)晶。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明能夠有效提高FⅠ葉蛋白的提取率，與其它方法相比，具有提取率高的特點(diǎn)；提取方法蛋白種類粗提分離精提提取效率本方法可溶蛋白15.4713.3311.1271.88FI蛋白7.496.505.0769.69透析稀釋結(jié)晶法可溶蛋白15.2612.5710.1366.38FI蛋白7.335.994.6663.57直接稀釋結(jié)晶法可溶蛋白15.1912.048.9258.72FI蛋白7.285.634.0855.49雙水相萃取法可溶蛋白15.3813.1610.5568.60FI蛋白7.456.324.8765.372、提出煙葉FⅠ葉蛋白純度高，達(dá)到Native-page電泳純。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明粗體液中蛋白示意圖；圖2為本發(fā)明層析分離液中蛋白示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的煙葉中FⅠ葉蛋白提取和分離純化方法包括樣品采集、FⅠ葉蛋白提取、FⅠ葉蛋白分離、FⅠ葉蛋白純化、FⅠ葉蛋白結(jié)晶步驟，具體包括：A、樣品采集：采集綠色煙葉，然后避光存放6~24h（不超過(guò)24h）直至葉片出現(xiàn)輕度萎蔫備用；B、FⅠ葉蛋白提?。簩步驟得到的煙葉片去掉主脈，置入組織搗碎機(jī)中，加入煙葉片重量體積0.1~0.3倍的0.1MNaCl溶液，同時(shí)加入煙葉片重量0.04~0.06倍的711陰離子交換樹(shù)脂，用組織搗碎機(jī)磨漿0.5~1.5min得到勻漿液，將勻漿液過(guò)濾得到濾液，調(diào)節(jié)濾液的pH值為7.3~7.6，快速加熱濾液至45~55℃，并維持20~40min，然后迅速冷卻至20℃，然后轉(zhuǎn)入離心機(jī)離心得到離心上清液；C、FⅠ葉蛋白分離：取B步驟的離心上清液，用(NH4)2SO4鹽析，取45%～55%鹽析出的蛋白質(zhì)沉淀段得到沉淀a；D、FⅠ葉蛋白純化：將沉淀a用柱平衡緩沖液溶解得到蛋白初溶液b，將蛋白初溶液b通過(guò)經(jīng)緩沖液平衡過(guò)的葡聚糖凝膠G-50柱，以1.5ml/min的流速洗脫，收集第6~7ml的洗脫液即為分離得到的FⅠ葉蛋白溶液；E、FⅠ葉蛋白結(jié)晶：向收集的FⅠ葉蛋白溶液中加入等體積的0.025MTris-Cl，pH7.4緩沖液得到稀釋后的蛋白流出液，于4℃靜置結(jié)晶得到FⅠ葉蛋白結(jié)晶。A步驟中采集綠色煙葉的時(shí)間為晴天上午10：00~12：00。B步驟中所述的過(guò)濾是采用四層紗布過(guò)濾。B步驟中所述的迅速冷卻是于冰浴中迅速冷卻。B步驟中所述的離心是于3~5℃條件下以12000rpm的速度離心20min得到離心上清液。D步驟中靜置結(jié)晶的靜置時(shí)間為4~6天。下面以具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明：實(shí)施例1（1）樣品采集：在云南省玉溪市紅塔區(qū)大營(yíng)街田間，于晴天上午10：00-10:20采集綠色煙葉，品種為K326，帶回室內(nèi)，立即進(jìn)行處理。（2）FⅠ葉蛋白提?。簩⑷~片去掉主脈，取500g葉片放入組織搗碎機(jī)中，加入100mL0.1MNaCI溶液，加入25克711陰離子交換樹(shù)脂，用組織搗碎機(jī)磨漿1分鐘。綠色的勻漿液用四層紗布過(guò)濾，調(diào)節(jié)濾液的pH值到7.4，將濾液攪拌的同時(shí)快速加熱到50℃，并維持30分鐘，然后將懸浮液在冰浴中迅速冷卻至20℃。在4℃條件下，以12000rpm速度離心20min。（3）FⅠ葉蛋白分離：取離心后的上清液，用(NH4)2SO4鹽析，取45%～55%鹽析出的蛋白質(zhì)段。具體做法：準(zhǔn)確量取上清液體積，依25.8g硫酸銨/100mL上清液的比例（即45%飽和硫酸銨）準(zhǔn)確稱取硫酸銨，在低速攪拌下，少量多次緩慢地加入。加完后，置冰箱中沉靜15分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10min，準(zhǔn)確量取上清液體積，依5.9g硫酸銨/100ml上清液的比例（即55%飽和硫酸銨）準(zhǔn)確稱取硫酸銨，攪拌下少量多次緩慢地加入，再以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10min，棄去上清液，留沉淀備用。（4）FⅠ葉蛋白純化：所得沉淀用5mL柱平衡緩沖液溶解，得到蛋白初溶液。通過(guò)一根經(jīng)緩沖液平衡過(guò)葡聚糖凝膠G-50柱，以1.5mL/min的流速洗脫，收集第6-7mL洗脫液，得到FⅠ葉蛋白溶液。（5）FⅠ葉蛋白結(jié)晶：向收集的FⅠ葉蛋白溶液加入等體積0.025MTris-Cl，pH7.4內(nèi)含(0.2mMEDTA)緩沖液，經(jīng)稀釋后的蛋白流出液于4℃放置4天后有大量FⅠ葉蛋白結(jié)晶出現(xiàn)。（6）每100克煙葉可產(chǎn)出FⅠ葉蛋白結(jié)晶0.70g，即FⅠ葉蛋白產(chǎn)出率為0.70%。實(shí)施例2（1）樣品采集：在云南省昆明市宜良縣北古城田間，于晴天上午11：00-11：30采集綠色煙葉，品種為云煙87，帶回室內(nèi)，立即進(jìn)行處理。（2）FⅠ葉蛋白提?。簩⑷~片去掉主脈，取500g葉片放入組織搗碎機(jī)中，加入100mL0.1MNaCI溶液，加入25克711陰離子交換樹(shù)脂，用組織搗碎機(jī)磨漿1分鐘。綠色的勻漿液用四層紗布過(guò)濾，調(diào)節(jié)濾液的pH值到7.4，將濾液攪拌的同時(shí)快速加熱到50℃，并維持30分鐘，然后將懸浮液在冰浴中迅速冷卻至20℃。在4℃條件下，以12000rpm速度離心20min。（3）FⅠ葉蛋白分離：取離心后的上清液，用(NH4)2SO4鹽析，取45%～55%鹽析出的蛋白質(zhì)段。具體做法：準(zhǔn)確量取上清液體積，依25.8g硫酸銨/100mL上清液的比例（即45%飽和硫酸銨）準(zhǔn)確稱取硫酸銨，在低速攪拌下，少量多次緩慢地加入。加完后，置冰箱中沉靜15分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10min，準(zhǔn)確量取上清液體積，依5.9g硫酸銨/100ml上清液的比例（即55%飽和硫酸銨）準(zhǔn)確稱取硫酸銨，攪拌下少量多次緩慢地加入，再以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10min，棄去上清液，留沉淀備用。（4）FⅠ葉蛋白純化：所得沉淀用5mL柱平衡緩沖液溶解，得到蛋白初溶液。通過(guò)一根經(jīng)緩沖液平衡過(guò)葡聚糖凝膠G-50柱，以1.5mL/min的流速洗脫，收集第6-7mL洗脫液，得到FⅠ葉蛋白溶液。（5）FⅠ葉蛋白結(jié)晶：向收集的FⅠ葉蛋白溶液加入等體積0.025MTris-Cl，pH7.4內(nèi)含(0.2mMEDTA)緩沖液，經(jīng)稀釋后的蛋白流出液于4℃放置5天后有大量FⅠ葉蛋白結(jié)晶出現(xiàn)。（6）每100克煙葉可產(chǎn)出FⅠ葉蛋白結(jié)晶0.65g，即FⅠ葉蛋白產(chǎn)出率為0.65%。實(shí)施例3（1）樣品采集：在云南省大理州市祥云縣田間，于晴天上午11：20-11：50采集綠色煙葉，品種為紅花大金元，帶回室內(nèi)，立即進(jìn)行處理。（2）FⅠ葉蛋白提?。簩⑷~片去掉主脈，取500g葉片放入組織搗碎機(jī)中，加入100mL0.1MNaCI溶液，加入25克711陰離子交換樹(shù)脂，用組織搗碎機(jī)磨漿1分鐘。綠色的勻漿液用四層紗布過(guò)濾，調(diào)節(jié)濾液的pH值到7.4，將濾液攪拌的同時(shí)快速加熱到50℃，并維持30分鐘，然后將懸浮液在冰浴中迅速冷卻至20℃。在4℃條件下，以12000rpm速度離心20min。（3）FⅠ葉蛋白分離：取離心后的上清液，用(NH4)2SO4鹽析，取45%～55%鹽析出的蛋白質(zhì)段。具體做法：準(zhǔn)確量取上清液體積，依25.8g硫酸銨/100mL上清液的比例（即45%飽和硫酸銨）準(zhǔn)確稱取硫酸銨，在低速攪拌下，少量多次緩慢地加入。加完后，置冰箱中沉靜15分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10min，準(zhǔn)確量取上清液體積，依5.9g硫酸銨/100ml上清液的比例（即55%飽和硫酸銨）準(zhǔn)確稱取硫酸銨，攪拌下少量多次緩慢地加入，再以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10min，棄去上清液，留沉淀備用。（4）FⅠ葉蛋白純化：所得沉淀用5mL柱平衡緩沖液溶解，得到蛋白初溶液。通過(guò)一根經(jīng)緩沖液平衡過(guò)葡聚糖凝膠G-50柱，以1.5mL/min的流速洗脫，收集第6-7mL洗脫液，得到FⅠ葉蛋白溶液。（5）FⅠ葉蛋白結(jié)晶：向收集的FⅠ葉蛋白溶液加入等體積0.025MTris-Cl，pH7.4內(nèi)含(0.2mMEDTA)緩沖液，經(jīng)稀釋后的蛋白流出液于4℃放置5天后有大量FⅠ葉蛋白結(jié)晶出現(xiàn)。（6）每100克煙葉可產(chǎn)出FⅠ葉蛋白結(jié)晶0.72g，即FⅠ葉蛋白產(chǎn)出率為0.72%。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3