本發(fā)明涉及抗菌肽分離技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種分離抗菌肽的方法。

背景技術(shù)：

抗菌肽原指昆蟲(chóng)體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，分子量在2000-7000左右，由20-60個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)。世界上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽的是1980年由瑞典科學(xué)家G.Boman等人經(jīng)注射陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶蛹產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽，定名為Cecropins。抗菌肽依其結(jié)構(gòu)可分為多種類型，其中Cathelicidin和Defensin為主要的類型；可將其分為5類:(1)單鏈無(wú)半胱氨酸殘基的α-螺旋，或由無(wú)規(guī)卷曲連接的兩段α-螺旋組成的肽；(2)富含某些氨基酸殘基但不含半胱氨酸殘基的抗菌肽；(3)含1個(gè)二硫鍵的抗菌多肽；(4)有2個(gè)或2個(gè)以上二硫鍵、具有β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽；(5)由其它已知功能的較大的多肽衍生而來(lái)的具有抗菌活性的肽。其中最早分離到的Cecropins和從非洲爪蟾中分離到的Magainins等屬于第一類抗菌肽，通常也將其稱為Cecropin類抗菌肽，目前對(duì)此類抗菌肽的研究也較深入。

一些常規(guī)的抗菌肽的分離方法存在原料浪費(fèi)較大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，抗菌肽的制得率較低的缺陷，為此，我們發(fā)明了一種分離抗菌肽的方法投入使用，以解決上述問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種分離抗菌肽的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的原料浪費(fèi)較大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，抗菌肽的制得率較低的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種分離抗菌肽的方法，包括原料制備、組織勻漿、免疫誘導(dǎo)、粗提液熱處理、提純和抗菌活性測(cè)定步驟，所述分離抗菌肽的方法的具體步驟如下：

S1：原料制備：將家蠅以含有2-4％蛋白粉，0.8-1.1％酵母的麥麩為飼料，在相對(duì)濕度60-70％的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行人工飼養(yǎng)繁殖；

S2：組織勻漿：按家蠅1.2-1.4g加液氮3-5g的比例混合，用研缽將家蠅研磨成粉末狀，并加入適量的緩沖液繼續(xù)研磨至糊狀，在3-5℃下，5000×g離心50-70min，取上清液，在-70--90℃保存；

S3：免疫誘導(dǎo)：將家蠅放入盛有乙醚的培養(yǎng)皿內(nèi)，使家蠅麻醉，將沾有誘導(dǎo)液的鋼針穿透家蠅體壁，使家蠅體內(nèi)產(chǎn)生抗菌肽；

S4：粗提液熱處理：取解凍的糊狀家蠅幼體在振蕩混勻器上混勻，并在沸水浴上加熱4-6min，然后在4℃，10000×g離心20-40min，取上清液，并在-70--90℃保存；

S5：提純：將家蠅粗提液用300-500目的檢驗(yàn)篩過(guò)濾，通過(guò)離心過(guò)濾并分別收集截留部分和濾出部分；

S6：抗菌活性測(cè)定：將抗菌肽菌株接種到培養(yǎng)基上，在25-45℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用氯化鈉溶液稀釋后，采用K-B藥敏實(shí)驗(yàn)做抗菌活性測(cè)定，并以青霉素做參照。

優(yōu)選的，所述步驟S2中，緩沖液為滅菌蒸餾水、50ml/L醋酸銨溶液和0.2M乙酸溶液混合物，其中滅菌蒸餾水：50ml/L醋酸銨溶液：0.2M乙酸溶液＝25：0.9：1.4。

優(yōu)選的，所述步驟S3中，誘導(dǎo)源的制備由各取等體積的菌液離心4-6min，棄上清液，并加入離心菌液體積一半的生理鹽水重新懸浮固定。

優(yōu)選的，所述菌液為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合液，其中大腸埃希氏菌：金黃色葡萄球菌：銅綠假單胞菌＝1.2:0.6:2.1，生理鹽水為150mmol/L氯化鈉和5mmol/L氫氧化鈉混合液。

優(yōu)選的，所述步驟S5中，離心過(guò)濾采用30-45°固定轉(zhuǎn)角的離心機(jī)，在4℃，4000×g離心20-40min，其中截留部分直接進(jìn)行冷凍干燥后，形成的凍干粉即為低純度抗菌肽，濾出部分通過(guò)400:1的比例加入一定量的輔料在110-130℃條件下，按1.2-1.6ml/min進(jìn)行噴干，其形成的噴干粉即為高純度抗菌肽。

優(yōu)選的，所述輔料內(nèi)部含有蛋白酶抑制劑和苯基硫脲，其中蛋白酶抑制劑的終濃度為1.2-1.6μmol/L，苯基硫脲的終濃度為15-30μmol/L。

優(yōu)選的，所述步驟S6中，培養(yǎng)基由8-12g蛋白胨、4-6g酵母粉和9-11g氯化鈉并加入700-900ml超純水，用10N氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至6.8-7.2，定容至1000ml后進(jìn)行分裝，并采用110-130℃高溫滅菌15-30min后制得。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用家蠅作為原料，制備出天然抗菌肽，其制備工藝的副產(chǎn)品可作為畜禽、水產(chǎn)等動(dòng)物養(yǎng)殖的蛋白飼料添加劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)原材料的綜合利用，該方法可大規(guī)模工廠化生產(chǎn)抗菌肽，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本較低，制得率較高，且受外在環(huán)境的影響較小，本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)便快速，抗菌肽的產(chǎn)率較高，其抗菌活性高。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明工作流程圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例一

一種分離抗菌肽的方法，包括原料制備、組織勻漿、免疫誘導(dǎo)、粗提液熱處理、提純和抗菌活性測(cè)定步驟，所述分離抗菌肽的方法的具體步驟如下：

S1：原料制備：將家蠅以含有2％蛋白粉，0.8％酵母的麥麩為飼料，在相對(duì)濕度60％的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行人工飼養(yǎng)繁殖；

S2：組織勻漿：按家蠅1.2g加液氮3g的比例混合，用研缽將家蠅研磨成粉末狀，并加入適量的緩沖液繼續(xù)研磨至糊狀，在3℃下，5000×g離心50min，取上清液，在-70℃保存，緩沖液為滅菌蒸餾水、50ml/L醋酸銨溶液和0.2M乙酸溶液混合物，其中滅菌蒸餾水：50ml/L醋酸銨溶液：0.2M乙酸溶液＝25：0.9：1.4；

S3：免疫誘導(dǎo)：將家蠅放入盛有乙醚的培養(yǎng)皿內(nèi)，使家蠅麻醉，將沾有誘導(dǎo)液的鋼針穿透家蠅體壁，使家蠅體內(nèi)產(chǎn)生抗菌肽，誘導(dǎo)源的制備由各取等體積的菌液離心4min，棄上清液，并加入離心菌液體積一半的生理鹽水重新懸浮固定，菌液為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合液，其中大腸埃希氏菌：金黃色葡萄球菌：銅綠假單胞菌＝1.2:0.6:2.1，生理鹽水為150mmol/L氯化鈉和5mmol/L氫氧化鈉混合液；

S4：粗提液熱處理：取解凍的糊狀家蠅幼體在振蕩混勻器上混勻，并在沸水浴上加熱4min，然后在4℃，10000×g離心20min，取上清液，并在-70℃保存；

S5：提純：將家蠅粗提液用300目的檢驗(yàn)篩過(guò)濾，通過(guò)離心過(guò)濾并分別收集截留部分和濾出部分，離心過(guò)濾采用30°固定轉(zhuǎn)角的離心機(jī)，在4℃，4000×g離心20min，其中截留部分直接進(jìn)行冷凍干燥后，形成的凍干粉即為低純度抗菌肽，濾出部分通過(guò)400:1的比例加入一定量的輔料在110℃條件下，按1.2ml/min進(jìn)行噴干，其形成的噴干粉即為高純度抗菌肽，輔料內(nèi)部含有蛋白酶抑制劑和苯基硫脲，其中蛋白酶抑制劑的終濃度為1.2μmol/L，苯基硫脲的終濃度為15μmol/L；

S6：抗菌活性測(cè)定：將抗菌肽菌株接種到培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用氯化鈉溶液稀釋后，采用K-B藥敏實(shí)驗(yàn)做抗菌活性測(cè)定，并以青霉素做參照，培養(yǎng)基由8g蛋白胨、4g酵母粉和9g氯化鈉并加入700ml超純水，用10N氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至6.8，定容至1000ml后進(jìn)行分裝，并采用110℃高溫滅菌15min后制得。

實(shí)施例二

一種分離抗菌肽的方法，包括原料制備、組織勻漿、免疫誘導(dǎo)、粗提液熱處理、提純和抗菌活性測(cè)定步驟，所述分離抗菌肽的方法的具體步驟如下：

S1：原料制備：將家蠅以含有4％蛋白粉，1.1％酵母的麥麩為飼料，在相對(duì)濕度70％的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行人工飼養(yǎng)繁殖；

S2：組織勻漿：按家蠅1.4g加液氮5g的比例混合，用研缽將家蠅研磨成粉末狀，并加入適量的緩沖液繼續(xù)研磨至糊狀，在5℃下，5000×g離心70min，取上清液，在-90℃保存，緩沖液為滅菌蒸餾水、50ml/L醋酸銨溶液和0.2M乙酸溶液混合物，其中滅菌蒸餾水：50ml/L醋酸銨溶液：0.2M乙酸溶液＝25：0.9：1.4；

S3：免疫誘導(dǎo)：將家蠅放入盛有乙醚的培養(yǎng)皿內(nèi)，使家蠅麻醉，將沾有誘導(dǎo)液的鋼針穿透家蠅體壁，使家蠅體內(nèi)產(chǎn)生抗菌肽，誘導(dǎo)源的制備由各取等體積的菌液離心6min，棄上清液，并加入離心菌液體積一半的生理鹽水重新懸浮固定，菌液為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合液，其中大腸埃希氏菌：金黃色葡萄球菌：銅綠假單胞菌＝1.2:0.6:2.1，生理鹽水為150mmol/L氯化鈉和5mmol/L氫氧化鈉混合液；

S4：粗提液熱處理：取解凍的糊狀家蠅幼體在振蕩混勻器上混勻，并在沸水浴上加熱6min，然后在4℃，10000×g離心40min，取上清液，并在-90℃保存；

S5：提純：將家蠅粗提液用500目的檢驗(yàn)篩過(guò)濾，通過(guò)離心過(guò)濾并分別收集截留部分和濾出部分，離心過(guò)濾采用45°固定轉(zhuǎn)角的離心機(jī)，在4℃，4000×g離心40min，其中截留部分直接進(jìn)行冷凍干燥后，形成的凍干粉即為低純度抗菌肽，濾出部分通過(guò)400:1的比例加入一定量的輔料在130℃條件下，按1.6ml/min進(jìn)行噴干，其形成的噴干粉即為高純度抗菌肽，輔料內(nèi)部含有蛋白酶抑制劑和苯基硫脲，其中蛋白酶抑制劑的終濃度為1.6μmol/L，苯基硫脲的終濃度為30μmol/L；

S6：抗菌活性測(cè)定：將抗菌肽菌株接種到培養(yǎng)基上，在45℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用氯化鈉溶液稀釋后，采用K-B藥敏實(shí)驗(yàn)做抗菌活性測(cè)定，并以青霉素做參照，培養(yǎng)基由12g蛋白胨、6g酵母粉和11g氯化鈉并加入900ml超純水，用10N氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至7.2，定容至1000ml后進(jìn)行分裝，并采用130℃高溫滅菌30min后制得。

實(shí)施例三

一種分離抗菌肽的方法，包括原料制備、組織勻漿、免疫誘導(dǎo)、粗提液熱處理、提純和抗菌活性測(cè)定步驟，所述分離抗菌肽的方法的具體步驟如下：

S1：原料制備：將家蠅以含有3％蛋白粉，1％酵母的麥麩為飼料，在相對(duì)濕度65％的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行人工飼養(yǎng)繁殖；

S2：組織勻漿：按家蠅1.3g加液氮4g的比例混合，用研缽將家蠅研磨成粉末狀，并加入適量的緩沖液繼續(xù)研磨至糊狀，在4℃下，5000×g離心60min，取上清液，在-80℃保存，緩沖液為滅菌蒸餾水、50ml/L醋酸銨溶液和0.2M乙酸溶液混合物，其中滅菌蒸餾水：50ml/L醋酸銨溶液：0.2M乙酸溶液＝25：0.9：1.4；

S3：免疫誘導(dǎo)：將家蠅放入盛有乙醚的培養(yǎng)皿內(nèi)，使家蠅麻醉，將沾有誘導(dǎo)液的鋼針穿透家蠅體壁，使家蠅體內(nèi)產(chǎn)生抗菌肽，誘導(dǎo)源的制備由各取等體積的菌液離心5min，棄上清液，并加入離心菌液體積一半的生理鹽水重新懸浮固定，菌液為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合液，其中大腸埃希氏菌：金黃色葡萄球菌：銅綠假單胞菌＝1.2:0.6:2.1，生理鹽水為150mmol/L氯化鈉和5mmol/L氫氧化鈉混合液；

S4：粗提液熱處理：取解凍的糊狀家蠅幼體在振蕩混勻器上混勻，并在沸水浴上加熱5min，然后在4℃，10000×g離心30min，取上清液，并在-80℃保存；

S5：提純：將家蠅粗提液用400目的檢驗(yàn)篩過(guò)濾，通過(guò)離心過(guò)濾并分別收集截留部分和濾出部分，離心過(guò)濾采用35°固定轉(zhuǎn)角的離心機(jī)，在4℃，4000×g離心30min，其中截留部分直接進(jìn)行冷凍干燥后，形成的凍干粉即為低純度抗菌肽，濾出部分通過(guò)400:1的比例加入一定量的輔料在120℃條件下，按1.4ml/min進(jìn)行噴干，其形成的噴干粉即為高純度抗菌肽，輔料內(nèi)部含有蛋白酶抑制劑和苯基硫脲，其中蛋白酶抑制劑的終濃度為1.4μmol/L，苯基硫脲的終濃度為25μmol/L；

S6：抗菌活性測(cè)定：將抗菌肽菌株接種到培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用氯化鈉溶液稀釋后，采用K-B藥敏實(shí)驗(yàn)做抗菌活性測(cè)定，并以青霉素做參照，培養(yǎng)基由10g蛋白胨、5g酵母粉和10g氯化鈉并加入800ml超純水，用10N氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至7，定容至1000ml后進(jìn)行分裝，并采用120℃高溫滅菌28min后制得。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。