本發(fā)明屬于有機(jī)硒制備領(lǐng)域，具體涉及一種雙硒多肽及其制備方法。

背景技術(shù)：

硒，被國(guó)內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)學(xué)界和醫(yī)藥界尊稱為“生命的火種”，素有“天然解毒劑”、“抗癌之王”、“長(zhǎng)壽元素”、“心臟守護(hù)神”之稱。它在人體組織內(nèi)的含量雖然僅為千萬(wàn)分之一，但是對(duì)于人類健康有著其他物質(zhì)無(wú)法替代的巨大作用，直接關(guān)系到生命的存在。"硒"是人體必需的，又不能自制，因此世界衛(wèi)生組織建議每天補(bǔ)充200μg硒，可有效預(yù)防多種疾病的高發(fā)。

補(bǔ)硒主要分為自然補(bǔ)硒和人工補(bǔ)硒。自然補(bǔ)硒：食取野生、天然的硒含量高的自然生長(zhǎng)的食品等，補(bǔ)充的為有機(jī)硒，相對(duì)于無(wú)機(jī)硒其毒性有所降低，更有益于人體健康吸收。人工補(bǔ)硒：攝取人工添加的各類補(bǔ)硒產(chǎn)品主要分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩類。無(wú)機(jī)硒主要為亞硒酸鈉，有很大的毒性。有機(jī)硒與無(wú)機(jī)硒相比，具有食用安全、無(wú)毒副作用、吸收利用率高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、生物活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

硒是生物體必需的微量元素之一。具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)生物膜的作用。缺硒會(huì)導(dǎo)致許多疾病如克山病、糖尿病、心血管疾病、白內(nèi)障、腫瘤、易衰老等。因此，硒在人類防癌抗癌、抗衰老、抗氧化、預(yù)防和治療心血管疾病、克山病和大骨節(jié)病等方面起到了重要的作用，微量元素硒與生物體，特別是與人體健康的關(guān)系，已經(jīng)引起了人 們極大的興趣。動(dòng)物飼料中硒攝入量為0.1～0.2mg·kg‐1，低于0.05mg·kg‐1就會(huì)出現(xiàn)硒缺乏癥。適量補(bǔ)硒對(duì)提高機(jī)體免疫能力、調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)自由基的防御功能、抑制衰老、預(yù)防疾病等均有重要意義。硒以無(wú)機(jī)和有機(jī)兩種形式存在，同其他微量元素一樣，動(dòng)物對(duì)于無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒的利用率差別很大。有機(jī)硒會(huì)主動(dòng)穿過(guò)腸壁，能有效地把硒元素貯存、積累在靶組織內(nèi)，供機(jī)體利用，而無(wú)機(jī)硒則被動(dòng)地?cái)U(kuò)散通過(guò)腸壁，具有強(qiáng)的助氧化作用，對(duì)脂肪造成氧化性應(yīng)激而自我抵消，產(chǎn)生毒副作用，人體對(duì)其吸收和利用率低。正是因?yàn)闊o(wú)機(jī)硒化合物的毒性大、活性低，應(yīng)用受到限制，因此開(kāi)發(fā)有機(jī)硒、尋找生物活性高且毒性小的有機(jī)硒化合物并成為補(bǔ)硒劑非常必要。制備雙硒多肽復(fù)合物能夠起到補(bǔ)硒的作用，有養(yǎng)顏，預(yù)防心血管疾病、腫瘤、白內(nèi)障、糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。此發(fā)明對(duì)促進(jìn)人體的健康有著重要的意義。作為一種高效安全的補(bǔ)硒劑，其良好的生物學(xué)特性，使雙硒多肽復(fù)合物有著更大的使用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供所述制備方法是以一種雙硒多肽的制備方法，所述制備方法是以低分子生物活性多肽為原料，進(jìn)行巰基化修飾后除去乙酰基，再和硒元素螯合，采用水體系合成法制成雙硒多肽；

進(jìn)一步地，所述制備方法包括：

S1:以生物活性多肽和嗎啉丙磺酸緩沖液為原料，所述生物活性多肽與嗎啉丙磺酸緩沖液的質(zhì)量比為1：(5～10)，反應(yīng)溫度為20～35 ℃，在攪拌條件下反應(yīng)0.5～1.5h，同時(shí)加入0.5～2mol/L的堿液以控制反應(yīng)液的pH值為6.0～8.0；

S2:加入S‐乙酰巰基丁二酸酐，所述S‐乙酰巰基丁二酸酐與S1中原料生物活性多肽的質(zhì)量比為1：(1～4)，反應(yīng)溫度為20～35℃，在攪拌條件下反應(yīng)1.5～5h，同時(shí)加入0.5～2mol/L的堿液以控制反應(yīng)液的pH值為6.0～8.0，對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)；

S3:將S2純化后的溶液中加入25ml 0.01mol/L的pH為7.3的鹽酸羥胺，同時(shí)通氮?dú)?，反?yīng)1～3h，去除復(fù)合物中的乙?；瑢?duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)；

S4:S3純化處理后的液體中加入硒元素，所述硒元素與S1中原料生物活性多肽的質(zhì)量比為1：(1～4)，反應(yīng)1～3h，對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)；

S5：S4反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到雙硒多肽；

進(jìn)一步地，S1中所述的生物活性多肽為直接從正常山羊肝臟提取的一種低分子生物活性多肽；

進(jìn)一步地，S1中所述的嗎啉丙磺酸緩沖液為3‐嗎啉‐丙磺酸或2‐嗎啉‐丙磺酸；

進(jìn)一步地，S1和S2中所述的堿液包括氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液和氫氧化鋇溶液；

進(jìn)一步地，S4中所述的硒元素為亞硒酸鈉；

進(jìn)一步地，一種雙硒多肽，所述雙硒多肽是由生物活性多肽與硒元素結(jié)合后，生成一個(gè)雙硒連接的多肽鏈，多肽鏈與巰基之間通過(guò)酰胺鍵連接，形成的雙硒多肽的復(fù)合物；

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明所涉及的一種雙硒多肽是將硒元素與生物活性多肽結(jié)合起來(lái)制成的功能性食品，以山羊肝臟直接提取的生物活性多肽經(jīng)過(guò)巰基化修飾和亞硒酸鈉為原料，采用水體系合成法制成，具有穩(wěn)定性良好、生物學(xué)效價(jià)高、能直接被腸道粘膜吸收從而真正實(shí)現(xiàn)高吸收的優(yōu)勢(shì)，而且使硒在生物活性多肽的結(jié)合下制成有機(jī)雙硒抗癌劑，最終達(dá)到抗癌的目的

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中生物活性多肽的曲線；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1和實(shí)施例2中雙硒多肽的紫外吸收曲線；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3和實(shí)施例4中雙硒多肽的紫外吸收曲線；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例5和實(shí)施例6中雙硒多肽的紫外吸收曲線；

圖5為本發(fā)明中生物活性多肽的紅外吸收曲線；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例一、實(shí)施例二、實(shí)施例三、實(shí)施例四、實(shí)施例五和實(shí)施例六中的雙硒多肽的紅外吸收曲線；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例一、實(shí)施例二、實(shí)施例三、實(shí)施例四、實(shí)施例五和實(shí)施例六中的雙硒多肽的核磁共振氫譜圖；

圖8為本發(fā)明生物活性多肽對(duì)人肺癌A549細(xì)胞抑制作用的細(xì)胞形態(tài)圖，圖中A為RPMI‐1640培養(yǎng)基，圖中a為RPMI‐1640培養(yǎng)基對(duì)照組，圖中B為正常生物活性多肽對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用24小時(shí)后 的細(xì)胞形態(tài)圖，圖中b為正常生物活性多肽對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)圖對(duì)照組。

圖9為雙硒多肽對(duì)人肺癌A549細(xì)胞抑制作用的細(xì)胞形態(tài)圖，圖中C為實(shí)施例一對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)圖，圖中D為實(shí)施例三對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)圖，圖中E為實(shí)施例六對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)圖，圖中c為實(shí)施例一對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)圖對(duì)照組，圖中d為實(shí)施例三對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)圖對(duì)照組，圖中e為實(shí)施例六對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)圖對(duì)照組。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。相反，本發(fā)明涵蓋任何由權(quán)利要求定義的在本發(fā)明的精髓和范圍上做的替代、修改、等效方法以及方案。進(jìn)一步，為了使公眾對(duì)本發(fā)明有更好的了解，在下文對(duì)本發(fā)明的細(xì)節(jié)描述中，詳盡描述了一些特定的細(xì)節(jié)部分。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)沒(méi)有這些細(xì)節(jié)部分的描述也可以完全理解本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。下面為本發(fā)明的舉出最佳實(shí)施例：

如圖1‐圖9所示，本發(fā)明提供一種雙硒多肽的制備方法，所述制備方法是以一種低分子生物活性多肽為原料，進(jìn)行巰基化修飾后除去乙?；?，再和硒元素螯合，采用水體系合成法制成雙硒多肽，所述制備方法包括：

S1:以生物活性多肽和嗎啉丙磺酸緩沖液為原料，所述生物活性多肽與嗎啉丙磺酸緩沖液的質(zhì)量比為1：(5～10)，反應(yīng)溫度為20～35℃，在攪拌條件下反應(yīng)0.5～1.5h，同時(shí)加入0.5～2mol/L的堿液以控制反應(yīng)液的pH值為6.0～8.0，所述生物活性多肽為直接從正常山羊肝臟提取的一種低分子生物活性多肽，所述嗎啉丙磺酸緩沖液為3‐嗎啉‐丙磺酸或2‐嗎啉‐丙磺酸；

S2:加入S‐乙酰巰基丁二酸酐，所述S‐乙酰巰基丁二酸酐與S1中原料生物活性多肽的質(zhì)量比為1：(1～4)，反應(yīng)溫度為20～35℃，在攪拌條件下反應(yīng)1.5～5h，同時(shí)加入0.5～2mol/L的堿液以控制反應(yīng)液的pH值為6.0～8.0，對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)；

S3:將S2純化后的溶液中加入25ml 0.01mol/L的pH為7.3的鹽酸羥胺，同時(shí)通氮?dú)?，反?yīng)1～3h，去除復(fù)合物中的乙?；?，對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)；

S4:S3純化處理后的液體中加入硒元素，所述硒元素與S1中原料生物活性多肽的質(zhì)量比為1：(1～4)，反應(yīng)1～3h，對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)，所述的硒元素為亞硒酸鈉；

S5：S4反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到雙硒多肽。

S1和S2中所述的堿液包括氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液和氫氧化鋇溶液。

一種雙硒多肽，由上述制備方法制的，所述雙硒多肽是由生物活性多肽與硒元素結(jié)合后，生成一個(gè)雙硒連接的多肽鏈，多肽鏈與巰基之間通過(guò)酰胺鍵連接，形成的雙硒多肽的復(fù)合物。

圖1中橫軸為波長(zhǎng)(Wavelength:nm)，縱軸為吸光(Absorbance)，圖2中橫軸為波長(zhǎng)(cm^‐1)，縱軸為透過(guò)率(％)，圖3中橫軸為化學(xué)位移δ(ppm)，縱軸為信號(hào)強(qiáng)度。

實(shí)施例1：

S1：以生物活性多肽和3‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液為原料，生物活性多肽與3‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液的質(zhì)量比為1：5，反應(yīng)溫度為20℃，在攪拌條件下反應(yīng)0.5h，同時(shí)加入0.5mol/L的氫氧化鈉以控制反應(yīng)液的pH值為6.0；

S2：以上反應(yīng)結(jié)束后，加入S‐乙酰巰基丁二酸酐，生物活性多肽與S‐乙酰巰基丁二酸酐的質(zhì)量比為1：1，反應(yīng)溫度為20℃，在攪拌條件下反應(yīng)1.5h，同時(shí)加入0.5mol/L的氫氧化鈉以控制反應(yīng)液的pH值為6.0；對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S3：將上述純化后的溶液中加入25ml 0.01mol/L的pH為7.3的鹽酸羥胺，同時(shí)通氮?dú)猓磻?yīng)1h，去除復(fù)合物中的乙?；?duì)反應(yīng) 液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S4：上述純化處理后的液體中加入硒元素，生物活性多肽與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1：4，反應(yīng)1h。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S5：以上反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到雙硒多肽。

實(shí)施例2：

S1：以生物活性多肽和2‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液為原料，生物活性多肽與2‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液的質(zhì)量比為1：6，反應(yīng)溫度為35℃，在攪拌條件下反應(yīng)1.5h，同時(shí)加入2mol/L的氫氧化鉀以控制反應(yīng)液的pH值為8.0；

S2：以上反應(yīng)結(jié)束后，加入S‐乙酰巰基丁二酸酐，生物活性多肽與S‐乙酰巰基丁二酸酐的質(zhì)量比為1：2，反應(yīng)溫度為35℃，在攪拌條件下反應(yīng)5h，同時(shí)加入2mol/L的氫氧化鉀以控制反應(yīng)液的pH值為8.0；對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S3：將上述純化后的溶液中加入25ml 0.01mol/L的pH為7.3的鹽酸羥胺，同時(shí)通氮?dú)?，反?yīng)3h，去除復(fù)合物中的乙?；?。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S4：上述純化處理后的液體中加入硒元素，生物活性多肽與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1：3，反應(yīng)3h。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S5：以上反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到雙硒多肽。

實(shí)施例3：

S1：以生物活性多肽和3‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液為原料，生物活性多肽與3‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液的質(zhì)量比為1：7，反應(yīng)溫度為20℃，在攪拌條件下反應(yīng)0.5h，同時(shí)加入0.5mol/L的氫氧化鋇以控制反應(yīng)液的pH值為6.0；

S2：以上反應(yīng)結(jié)束后，加入S‐乙酰巰基丁二酸酐，生物活性多肽與S‐乙酰巰基丁二酸酐的質(zhì)量比為1：3，反應(yīng)溫度為20℃，在攪拌條件下反應(yīng)1.5h，同時(shí)加入1mol/L的氫氧化鋇以控制反應(yīng)液的pH值為6.0；對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S3：將上述純化后的溶液中加入25ml 0.01mol/L的pH為7.3的鹽酸羥胺，同時(shí)通氮?dú)?，反?yīng)1h，去除復(fù)合物中的乙?；?duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S4：上述純化處理后的液體中加入硒元素，生物活性多肽與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1：2，反應(yīng)1h。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S5：以上反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到雙硒多肽。

實(shí)施例4：

S1：以生物活性多肽和2‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液為原料，生物活性 多肽與2‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液的質(zhì)量比為1：8，反應(yīng)溫度為35℃，在攪拌條件下反應(yīng)1.5h，同時(shí)加入2mol/L的氫氧化鈉以控制反應(yīng)液的pH值為8.0；

S2：以上反應(yīng)結(jié)束后，加入S‐乙酰巰基丁二酸酐，生物活性多肽與S‐乙酰巰基丁二酸酐的質(zhì)量比為1：4，反應(yīng)溫度為35℃，在攪拌條件下反應(yīng)5h，同時(shí)加入2mol/L的氫氧化鈉以控制反應(yīng)液的pH值為8.0；對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S3：將上述純化后的溶液中加入25ml 0.01mol/L的pH為7.3的鹽酸羥胺，同時(shí)通氮?dú)猓磻?yīng)3h，去除復(fù)合物中的乙酰基。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S4：上述純化處理后的液體中加入硒元素，生物活性多肽與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1：1，反應(yīng)3h。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S5：以上反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到雙硒多肽。

實(shí)施例5：

S1：以生物活性多肽和2‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液為原料，生物活性多肽與2‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液的質(zhì)量比為1：9，反應(yīng)溫度為30℃，在攪拌條件下反應(yīng)1h，同時(shí)加入1.5mol/L的氫氧化鉀以控制反應(yīng)液的pH值為7；

S2：以上反應(yīng)結(jié)束后，加入S‐乙酰巰基丁二酸酐，生物活性多肽 與S‐乙酰巰基丁二酸酐的質(zhì)量比為1：2，反應(yīng)溫度為30℃，在攪拌條件下反應(yīng)4h，同時(shí)加入1.5mol/L的氫氧化鉀以控制反應(yīng)液的pH值為8；對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S3：將上述純化后的溶液中加入25ml 0.01mol/L的pH為7.3的鹽酸羥胺，同時(shí)通氮?dú)?，反?yīng)2h，去除復(fù)合物中的乙?；?duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S4：上述純化處理后的液體中加入硒元素，生物活性多肽與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1：3，反應(yīng)2h。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S5：以上反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到雙硒多肽。

實(shí)施例6：

S1：以生物活性多肽和2‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液為原料，生物活性多肽與2‐嗎啉‐丙磺酸緩沖液的質(zhì)量比為1：10，反應(yīng)溫度為35℃，在攪拌條件下反應(yīng)1.5h，同時(shí)加入2mol/L的氫氧化鋇以控制反應(yīng)液的pH值為8.0；

S2：以上反應(yīng)結(jié)束后，加入S‐乙酰巰基丁二酸酐，生物活性多肽與S‐乙酰巰基丁二酸酐的質(zhì)量比為1：4，反應(yīng)溫度為20℃，在攪拌條件下反應(yīng)1.5h，同時(shí)加入0.5mol/L的氫氧化鋇以控制反應(yīng)液的pH值為7.0；對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S3：將上述純化后的溶液中加入25ml 0.01mol/L的pH為7.3的 鹽酸羥胺，同時(shí)通氮?dú)猓磻?yīng)1h，去除復(fù)合物中的乙?；?。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S4：上述純化處理后的液體中加入硒元素，生物活性多肽與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1：2，反應(yīng)1h。對(duì)反應(yīng)液體用凝膠層析純化后除去多余的鹽及雜質(zhì)。

S5：以上反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到雙硒多肽。

對(duì)以上實(shí)施例的產(chǎn)物進(jìn)行紫外光譜分析、紅外光譜分析、核磁共振分析、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和硒元素含量測(cè)定，其分析結(jié)果如下：

1、雙硒多肽的紫外光譜分析：

圖1(生物活性多肽)，圖2(實(shí)施例一和實(shí)施例二)，圖3(實(shí)施例三和實(shí)施例四)和圖4(實(shí)施例五和實(shí)施例六)中顯示，與純生物活性多肽的最大吸收峰(λ_max＝206nm)相比，雙硒多肽的最大吸收峰(λ_max＝210～220nm)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)了4～14nm，且最大吸收峰的高度明顯增加。且在吸收波長(zhǎng)為210～220nm范圍內(nèi)，存在兩處高的吸收峰，分別代表-RCONHR′中-C＝O和-NH，-OH的特征吸收峰，說(shuō)明可能在生物活性多肽巰基化后去乙?；螽a(chǎn)物中有仲酰胺官能團(tuán)的形成。

2、雙硒多肽的紅外光譜分析如圖5(生物活性多肽)和圖6(實(shí)施例一、二、三、四、五和六)所示，具體分析結(jié)果為：圖6與圖5圖譜區(qū)分非常明顯，說(shuō)明圖6是生成一種新的物質(zhì)，且不同于生物活性多肽：圖6中，535cm^-1和640cm^-1是Se-Se鍵的振動(dòng)峰， 736.8cm^-1，721cm^-1和775cm^-1則歸屬于C-Se鍵的吸收峰。2336cm^-1是硒元素的獨(dú)特吸收峰。且在2600cm^-1是-SH的特征吸收峰。同時(shí)3391cm^-1，1585.5cm^-1和1406.2cm^-1是仲酰胺的特征吸收峰，且不同于圖5，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)。以上結(jié)果可能說(shuō)明生物活性多肽與硒元素結(jié)合后，生成一個(gè)雙硒連接的多肽鏈，而且多肽鏈與巰基之間通過(guò)酰胺鍵連接，形成一個(gè)雙硒多肽的復(fù)合物。

3、雙硒多肽的核磁共振1HNMR分析如圖3所示，具體分析結(jié)果如下，在化學(xué)位移為δ2.31附件可有‐OH的吸收峰，在δ6～8.2出現(xiàn)‐NH的吸收峰，在δ1.43附件出現(xiàn)‐SH的吸收峰，同時(shí)出現(xiàn)不同程度的吸收峰，不同的化學(xué)位移，說(shuō)明不同配比的生物活性多肽與硒元素結(jié)合的過(guò)程中，有不同程度的結(jié)合量。

4、生物活性多肽和雙硒多肽對(duì)人肺癌A459細(xì)胞作用后的細(xì)胞形態(tài)如圖4和圖5所示，具體分析結(jié)果如下，與正常RPMI‐1640培養(yǎng)液作用后的細(xì)胞做對(duì)照，正常生物活性多肽可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。與正常生物活性多肽相比，雙硒多肽作用于A549細(xì)胞后明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并引起大量細(xì)胞凋亡，效果非常明顯。

5、雙硒多肽中硒元素的含量測(cè)定，分析結(jié)果如表1所示，結(jié)果顯示，不同配比的生物活性多肽與硒元素結(jié)合后，硒元素的含量不同。當(dāng)配比達(dá)到一定程度，結(jié)合量達(dá)到飽和狀態(tài)。比如實(shí)施例五中，每摩爾生物活性多肽分子中的硒元素含量達(dá)到9個(gè)。

6、雙硒多肽作用于人肺癌A549細(xì)胞后細(xì)胞存活率的測(cè)定，分析結(jié)果如表2所示，結(jié)果顯示，雙硒多肽作用于A549細(xì)胞后明顯抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)，并引起大量細(xì)胞凋亡，5％、10％、15％、20％濃度的雙硒多肽隨作用濃度的增加其細(xì)胞抑制率逐漸增加，實(shí)施例一的IR％為11.50％、17.66％、27.32％、36.04％，IC50為35.72％；實(shí)施例三的IR％為11.79％、10.54％、19.34％、24.17％，IC50為116.15％；實(shí)施例六的IR％為18.89％、29.98％、31.50％、45.83％，IC50為36.25％。結(jié)果顯示人肺癌A549細(xì)胞對(duì)實(shí)施例中制備的雙硒多肽呈敏感陽(yáng)性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表1 生物活性多肽與硒元素結(jié)合后的硒元素含量測(cè)定

表1為雙硒多肽中硒元素的含量。分別為實(shí)施例(一、二、三、四、五和六)中的雙硒多肽中硒元素的含量(n_硒/n_{生物活性多肽})，定義為每摩爾生物活性多肽分子中可以結(jié)合的硒元素的個(gè)數(shù)。

表2為雙硒多肽對(duì)人肺癌A549細(xì)胞作用后的細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果。用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處吸光度(A)值，每個(gè)藥物濃度設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其平均數(shù)。按下列公式計(jì)算平均細(xì)胞抑制率(IR)：IR％＝(對(duì)照組A值一實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值x100％，計(jì)算各孔平均值。設(shè)定IR值>30％為對(duì)藥物敏感陽(yáng)性，反之陰性。

本發(fā)明制得的雙硒多肽螯合物用于體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明：與具有相同生物活性多肽濃度的抗癌效果相比，可提高A549細(xì)胞的抑瘤率。

以上所述的實(shí)施例，只是本發(fā)明較優(yōu)選的具體實(shí)施方式的一種，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)進(jìn)行的通常變化和替換都應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。