本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，尤其是涉及一種生物活性多肽draahvkqvl及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的過程中，牛乳中的一部分蛋白質(zhì)被乳酸菌代謝利用，并發(fā)生了一系列生理生化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變?yōu)槎嚯幕蛘哂坞x的氨基酸，被人體消化吸收或通過小腸上皮細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)直接進(jìn)入人體的血液循環(huán)。在這些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被稱為“生物活性肽”。

氧化反應(yīng)和氧化代謝對(duì)于食物和人體來說都是至關(guān)重要的，自由基和活性氧引起了一系列的氧化反應(yīng)。當(dāng)過量的自由基形成，它們會(huì)超過保護(hù)性酶如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的保護(hù)作用，從而導(dǎo)致脂質(zhì)氧化、細(xì)胞凋亡等一系列的副作用產(chǎn)生。這一類的氧化反應(yīng)，不僅影響含脂食物的保質(zhì)期，也對(duì)人體的健康造成了一定的危害，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、動(dòng)脈硬化等。此外，collins等人2005年研究發(fā)現(xiàn)癌癥的發(fā)生也與dna的氧化損傷有關(guān)。

早期一些人工合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(bha)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)被運(yùn)用到食品中，作為脂質(zhì)的抗氧化劑，但這些人工合成的添加劑對(duì)于人體都有潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在天然食物來源中尋找安全的抗氧化劑尤為重要。近些年來，人們發(fā)現(xiàn)一些食物來源的多肽類物質(zhì)具有良好的抗氧化作用，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。這些多肽可以通過微生物發(fā)酵、消化酶解等多種途徑得到，并且大多具有抗氧化活性的多肽是由2～20個(gè)氨基酸殘基組成，分子量小于6000da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。

免疫活性肽是繼阿片肽發(fā)現(xiàn)后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生物活性多肽。1981年jolles等人首次發(fā)現(xiàn)，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一個(gè)氨基酸序列為val-glu-pro-ile-pro-tyr的六肽，體外實(shí)驗(yàn)證明該肽能夠增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)綿羊紅細(xì)胞的吞噬作用。migliore-samour等人發(fā)現(xiàn)來自酪蛋白的六肽thr-thr-met-pro-leu-trp能夠刺激綿羊血紅細(xì)胞對(duì)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的吞噬作用以及增強(qiáng)對(duì)于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫調(diào)節(jié)肽(pgpipn)飼喂大鼠發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用和紅細(xì)胞相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)功能有顯著的增強(qiáng)。

研究表明，免疫活性肽不僅能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放、提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，而且不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。

目前關(guān)于生物活性多肽的研究有很多，比如中國專利cn105254738a公布了一種來源于β-酪蛋白的乳源性生物活性多肽delqdkih，中國專利cn105254739a公布了一種來源于αs1-酪蛋白的乳源性生物活性多肽gtqytd，中國專利cn105254740a公布了一種來源于αs2-酪蛋白的乳源性生物活性多肽nqfyqkf。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種生物活性多肽draahvkqvl及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明第一方面，提供一種生物活性多肽draahvkqvl，其氨基酸序列為asp-arg-ala-ala-his-val-lys-gln-val-leu，如seqidno：1所示。

較優(yōu)的，所述生物活性多肽為乳源性。具體來源于乳鐵蛋白，并且為乳鐵蛋白第602～611位的氨基酸殘基。乳鐵蛋白氨基酸序列如seqidno：3所示。

乳鐵蛋白的氨基酸序列以及對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為既有技術(shù)，編碼乳鐵蛋白第602～611位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽draahvkqvl。

較優(yōu)的，所述生物活性多肽具有抗氧化功能和免疫調(diào)節(jié)功能。

本發(fā)明第二方面，提供了編碼所述生物活性多肽draahvkqvl的核苷酸片段，其序列為：5’-gatagggcagcacacgtgaaacaggtgctg-3’，如seqidno：2所示。

本發(fā)明第三方面，提供了所述生物活性多肽draahvkqvl的制備方法，可以通過基因工程的方法人工合成，可以從乳制品中通過分離純化的方法直接獲得，可以直接通過化學(xué)合成制備。

本發(fā)明第四方面，提供了所述生物活性多肽draahvkqvl在制備具有抗氧化功能的食品、保健品、藥物或化妝品中的應(yīng)用。

本發(fā)明第五方面，提供了所述生物活性多肽draahvkqvl在制備具有免疫調(diào)節(jié)功能的食品、保健品或藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明第六方面，提供了所述生物活性多肽draahvkqvl在制備同時(shí)具有抗氧化功能和免疫調(diào)節(jié)功能的食品、保健品或藥物中的應(yīng)用。

具體而言，本發(fā)明的生物活性多肽draahvkqvl可以用于制備減少自由基對(duì)皮膚傷害的化妝品、制備具有抗氧化和/或調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的藥物；并且由于本發(fā)明的生物活性多肽draahvkqvl通過胃腸道降解后的產(chǎn)物仍舊具有生物活性，因此還可以用于制備酸奶等食品、調(diào)節(jié)免疫力的保健品，以及口服的用于制備具有抗氧化和/或調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的藥物。

本發(fā)明第七方面，提供了一種抗氧化產(chǎn)品，包括所述生物活性多肽draahvkqvl或所述生物活性多肽draahvkqvl的衍生物；所述的抗氧化產(chǎn)品包括抗氧化食品、抗氧化保健品、抗氧化藥物或抗氧化化妝品；所述生物活性多肽draahvkqvl的衍生物，是指在生物活性多肽draahvkqvl的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。

本發(fā)明第八方面，提供了一種免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)品，包括所述生物活性多肽draahvkqvl或所述生物活性多肽draahvkqvl的衍生物；所述的免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)品包括免疫調(diào)節(jié)食品、免疫調(diào)節(jié)保健品或免疫調(diào)節(jié)藥物；所述生物活性多肽draahvkqvl的衍生物，是指在生物活性多肽draahvkqvl的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?；⒘姿峄?、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。

本發(fā)明第九方面，提供了一種同時(shí)具有抗氧化功能和免疫調(diào)節(jié)功能的產(chǎn)品，包括所述生物活性多肽draahvkqvl或所述生物活性多肽draahvkqvl的衍生物；具有抗氧化功能和免疫調(diào)節(jié)功能的產(chǎn)品包括食品、保健品或藥物；所述生物活性多肽draahvkqvl的衍生物，是指在生物活性多肽draahvkqvl的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?；?、磷酸化、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。

本發(fā)明生物活性多肽draahvkqvl的有益效果為：本發(fā)明的乳源性生物活性多肽draahvkqvl具有較好的抗氧化活性和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力活性；一方面能夠清除機(jī)體內(nèi)的自由基，減少自由基對(duì)人體的傷害；另一方面，本發(fā)明的生物活性多肽draahvkqvl還能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖能力，提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，而且不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，對(duì)開發(fā)具有抗氧化功能及調(diào)節(jié)免疫功能的乳制品和保健品具有十分重要的意義。

附圖說明

圖1：質(zhì)量色譜提取圖(m/z＝568.83)；

圖2：質(zhì)荷比為568.83的片段的一級(jí)質(zhì)譜圖；

圖3：質(zhì)荷比為568.83的多肽az、by斷裂情況；

圖4：[dpph·]甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5：feso4標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6：生物活性多肽draahvkqvl的體外巨噬細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)；

圖7：il-4標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖8：生物活性多肽draahvkqvl使用濃度細(xì)胞因子il-4分泌量的影響。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方案之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組dna技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1活性肽draahvkqvl的人工合成

一、生物活性肽的合成

1.稱取rink樹脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反應(yīng)器中，用50ml的二氯甲烷(dcm)浸泡。

2.2小時(shí)后，用3倍樹脂體積的氮-二甲基甲酰胺(dmf)洗滌樹脂，然后抽干，如此重復(fù)四次，將樹脂抽干后待用。

3.向反應(yīng)器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4,v:v)，放在脫色搖床上搖晃20min，以此來脫去樹脂上的fmoc保護(hù)基團(tuán)。脫完保護(hù)后用3倍樹脂體積的dmf洗滌四次，然后抽干。

4.取少量樹脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法檢測(檢a、檢b各兩滴，100℃反應(yīng)1min)，樹脂有顏色，說明脫保護(hù)成功。

5.稱取氨基酸asp適量和1-羥基-苯駢三唑(hobt)適量于50ml的離心管中，加入20ml的dmf將其溶解，然后加入3ml的n,n二異丙基碳二亞胺(dic)振蕩搖勻1min，待溶液澄清后加入到反應(yīng)器中，然后將反應(yīng)器置于30℃的搖床中反應(yīng)。

6.2小時(shí)后，用一定量的醋酸酐封頭(醋酸酐:diea:dcm＝1:1:2,v:v:v)半小時(shí)，然后用3倍樹脂體積的dmf洗滌四次，抽干待用。

7.向反應(yīng)器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4，v:v)，放在脫色搖床上搖晃20min，以此來脫去樹脂上的fmoc保護(hù)基團(tuán)。脫完保護(hù)后用dmf洗滌四次，然后抽干。

8.取少量樹脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法檢測(檢a、檢b各兩滴，100℃反應(yīng)1min)，樹脂有顏色，說明脫保護(hù)成功。

9.稱取后面第二個(gè)氨基酸適量和hobt適量于50ml的離心管中，加入25ml的dmf將其溶解，然后加入2.5ml的dic振蕩搖勻1min，待溶液澄清后加入到反應(yīng)器中，然后將反應(yīng)器置于30℃的搖床中反應(yīng)。

10.1小時(shí)后，取少量樹脂檢測，用茚三酮法檢測(檢a、檢b各兩滴，100℃反應(yīng)1min)，若樹脂為無色，說明反應(yīng)完全；若樹脂有顏色，說明縮合不完全，繼續(xù)反應(yīng)。

11.待反應(yīng)完全后，用dmf洗滌樹脂四次，然后抽干，向反應(yīng)器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4,v:v)，放在脫色搖床上搖晃20min，以此來脫去樹脂上的fmoc保護(hù)基團(tuán)。脫完保護(hù)后用dmf洗滌四次，然后抽干檢測保護(hù)是否脫去。

12.按照步驟9-11依次接上氨基酸arg、ala、ala、his、val、lys、gln、val和leu。

13.待接上最后一個(gè)氨基酸后，脫去保護(hù)，用dmf洗滌四次，然后用甲醇將樹脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，異丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)將多肽從樹脂上切割下來(每克樹脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)離心沉降四次。

至此，人工合成了生物活性肽draahvkqvl。

以上步驟5、步驟9中所述的適量是指根據(jù)目標(biāo)合成量和得率計(jì)算出一個(gè)理論用量，在理論用量基礎(chǔ)上乘以一個(gè)系數(shù)(本實(shí)施例中為1.1)，最后得到的實(shí)際用量。

由于每次目標(biāo)肽的合成量不同，而且得率也不同，所以每次稱取的氨基酸的量也就不同。

例如目標(biāo)肽的合成量是10克，合成肽的得率(回收率)為90％，那么氨基酸的理論稱取量的計(jì)算公式為：

氨基酸的理論稱取量＝10克*氨基酸分子量/目標(biāo)肽分子量/90％.

這樣計(jì)算出來的結(jié)果是氨基酸的理論稱取量，在實(shí)際合成過程中為了保證得到10克的多肽，氨基酸要多稱取一點(diǎn)，實(shí)際操作時(shí)氨基酸稱取量一般都是理論稱取量的1.1倍。

同理，1-羥基-苯駢三唑(hobt)作為多肽合成過程中的一個(gè)中介物，也是理論稱取量的1.1倍。

由于生物活性肽合成過程中所用氨基酸以及1-羥基-苯駢三唑(hobt)的理論用量是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)目標(biāo)合成肽的需求量能夠計(jì)算得到的，因此，實(shí)際操作時(shí)，在理論用量的基礎(chǔ)上乘以一個(gè)系數(shù)就能夠合成出目標(biāo)肽，在參照本實(shí)施例的合成步驟以及合成工藝條件基礎(chǔ)上，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)知識(shí)就能夠合成得到本實(shí)施例中的生物活性肽。

二、生物活性肽的確認(rèn)

1)uplc分析

uplc條件如下：

儀器：watersacquityuplc超高效液相-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀

色譜柱規(guī)格：behc18色譜柱

流速：0.4ml/min

溫度：50℃

紫外檢測波長：210nm

進(jìn)樣量：2μl

梯度條件：a液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，b液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈

2)質(zhì)譜分析

質(zhì)譜條件如下：

離子方式：es+

質(zhì)量范圍(m/z)：100-1000

毛細(xì)管電壓(capillary)(kv)：3.0

采樣錐(v)：35.0

離子源溫度(℃)：115

去溶劑溫度(℃)：350

去溶劑氣流(l/hr)：700.0

碰撞能量(ev)：4.0

掃描時(shí)間(sec)：0.25

內(nèi)掃描時(shí)間(sec)：0.02

根據(jù)以上分析方法，利用超高效液相-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜，對(duì)生物活性肽draahvkqvl進(jìn)行色譜分析和質(zhì)譜分析，其質(zhì)量色譜提取圖如圖1所示，提取此峰的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖如圖2和3所示，可得此峰的多肽質(zhì)荷比為568.83da，保留時(shí)間是16.97min。

3)結(jié)果

由圖3可知，根據(jù)az、by斷裂的情況，經(jīng)過progenesisqi軟件分析計(jì)算，得到質(zhì)荷比568.83da的片段序列為asp-arg-ala-ala-his-val-lys-gln-val-leu(draahvkqvl)，記為seqidno：1。該片段與乳鐵蛋白第602～611位的殘基序列相對(duì)應(yīng)，乳鐵蛋白氨基酸序列的genbank編號(hào)為aaa30617.1，序列見seqidno：3。

實(shí)施例2生物活性肽的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

采用清除自由基法(dpph·法)和總抗氧化能力法(ferricreducingabilitypowerfrap法)，對(duì)實(shí)施例1得到的生物活性多肽draahvkqvl的抗氧化活性進(jìn)行測試。

1、[dpph·]法測定生物活性肽draahvkqvl的體外抗氧化活性

1)實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl[dpph·])，日本wako公司生產(chǎn)；甲醇，上海國藥公司提供；實(shí)施例1獲得的乳源性生物活性多肽draahvkqvl。

主要儀器：sunrise酶標(biāo)儀，奧地利tecan公司產(chǎn)品；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國millipore公司制造；分析天平，meitelei-tolido公司產(chǎn)品。

2)實(shí)驗(yàn)方法

(1)1mmol/l[dpph·]甲醇溶液

用分析天平稱取0.349mg[dpph·]溶于1ml甲醇溶液中，配制得到的1mmol/l[dpph·]甲醇溶液，錫紙避光保存，即配即用。

(2)[dpph·]甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

在96孔板中按表1分別加入100μl[dpph·]甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，室溫靜置90min，用酶標(biāo)儀在517nm處檢測吸光值。

表1[dpph·]甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用excel擬合曲線并計(jì)算回歸方程，結(jié)果見圖4(回歸方程：y＝-0.192x+0.2271，r²＝0.9991)。[dpph·]甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999，表明[dpph·]甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線精密度和準(zhǔn)確度均符合檢測要求。從結(jié)果看，吸光度值與[dpph·]含量呈反比關(guān)系，[dpph·]含量越少，吸光值越高，即樣品清除自由基的能力越強(qiáng)。

(3)[dpph·]法測定生物活性肽draahvkqvl的抗氧化活性

1)樣品組：在96孔板中加入80μl濃度為1mmol/l[dpph·]甲醇溶液、按表2分別加入20μl不同濃度的待測樣品(draahvkqvl)、陽性對(duì)照1(2.5mg/ml的trolox)、陽性對(duì)照2(0.025mg/ml的trolox)，和陰性對(duì)照(植酸)；

2)空白組：在同一96孔板上，以加入80μl濃度為1mmol/l[dpph·]甲醇溶液和20μl去離子水的樣品做空白對(duì)照。

待檢測樣品加樣完畢后，室溫靜置90min，用酶標(biāo)儀在517nm處檢測吸光值。按照下式計(jì)算自由基清除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

公式：

表2[dpph·]法測定生物活性多肽的抗氧化活性結(jié)果

從表2可以看出，作為陽性對(duì)照的2.5mg/ml的trolox在相同條件下具有最強(qiáng)的清除自由基的能力，幾乎能清除溶液中所有的自由基，其次為0.025mg/ml的trolox、植酸、活性多肽。多肽draahvkqvl清除[dpph·]自由基率隨濃度變化呈現(xiàn)倒鐘型，在濃度為2.5mg/ml處達(dá)到最高值，為24.90％。

2、farp法測定生物活性肽draahvkqvl體外抗氧化能力

1)實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

總抗氧化能力檢測試劑盒(ferricreducingabilityofplasmafrap法)，購自上海碧云天生物科技公司；feso4溶液(10mmol/l)，水溶性維生素e(trolox溶液)(10mmol/l)，實(shí)施例1獲得的乳源性生物活性多肽draahvkqvl。

主要儀器：sunrise酶標(biāo)儀，奧地利tecan公司產(chǎn)品；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國millipore公司制造；分析天平，meitelei-tolido公司產(chǎn)品；hws26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司制造。

2)實(shí)驗(yàn)方法

(1)frap工作液的配制

根據(jù)總抗氧化能力檢測試劑盒，將tptz7.5ml稀釋液、tptz750μl溶液、檢測緩沖液750μl混合均勻，并在37℃水浴中孵育，2小時(shí)h內(nèi)用完。

(2)feso4標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線的制作測定

在96孔板中先加入180μlfrap工作液，按表3加入5μlfeso4標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，輕輕混勻，37℃孵育3-5min后，用酶標(biāo)儀在593nm處測定吸光值。

表3feso4標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的溶液配制

feso4濃度與吸光值呈良好的正比關(guān)系，feso4濃度越高，吸光值越高。本發(fā)明feso4標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖5，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998，feso4標(biāo)準(zhǔn)曲線的精密度和準(zhǔn)確度均符合檢測要求，可用于后續(xù)計(jì)算。

(3)frap法測定生物活性多肽draahvkqvl的抗氧化能力

在96孔板中先加入180μlfrap工作液，空白對(duì)照孔中加入5μlddh2o，樣品檢測孔內(nèi)加入5μl待測樣品、陽性對(duì)照內(nèi)加入5μl植酸，輕輕混勻，37℃孵育3-5min后，用酶標(biāo)儀在593nm處測定吸光值?？偪寡趸芰Ρ硎痉绞揭詅eso4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示。按照下式計(jì)算自由基清除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4farp法測定生物活性多肽draahvkqvl的總抗氧化能力結(jié)果

通過總抗氧化能力法(ferricreducingabilitypowerfrap法)對(duì)多肽draahvkqvl的體外總抗氧化活性進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)生物活性多肽draahvkqvl具有較好的還原氧化物質(zhì)的能力；在濃度為4mg/ml情況下，多肽draahvkqvl的總抗氧化水平達(dá)到0.0247mmol/g；說明生物活性多肽draahvkqvl的總抗氧化能力，高于同等濃度下的具有弱抗氧化活性的植酸，具有顯著性(p>0.05)差異。因此，可認(rèn)定發(fā)明的生物活性多肽draahvkqvl具有顯著的抗氧化能力。

實(shí)施例3生物活性肽的促進(jìn)機(jī)體免疫力活性實(shí)驗(yàn)

一、mtt法測定生物活性多肽draahvkqvl的體外淋巴細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)

1)實(shí)驗(yàn)材料與儀器：

試劑與材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物balb/c小鼠(雄性6-8周齡，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；實(shí)施例1獲得的乳源性生物活性多肽draahvkqvl；小鼠淋巴細(xì)胞提取液(購自索來寶公司)；rpmi1640培養(yǎng)基(購自gibco公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt，購自amresco公司)；伴刀豆蛋白(cona，購自sigma公司)；牛血清白蛋白(bsa，購自genebase公司)；胃蛋白酶(購自sigma公司)；胰酶(corolasepp，購自ab公司)。

儀器：lrh-250f生化培養(yǎng)箱，上海恒科技有限公司；gl-22m高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；heracell150co2培養(yǎng)箱，heraeus公司；dragonwellscanmk3酶標(biāo)儀，labsystems公司；alphav1-2-ld真空冷凍干燥機(jī)，christ公司；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，waters公司。

2)實(shí)驗(yàn)方法：

無菌條件下取小鼠脾臟，用淋巴細(xì)胞提取液提取小鼠淋巴細(xì)胞，進(jìn)行元代培養(yǎng)。用完全rpmi1640培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×10⁶個(gè)/ml。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入：100μl小鼠淋巴細(xì)胞懸液，100μlrpmi1640完全培養(yǎng)液，20μl伴刀豆蛋白，100μl樣品。另外，設(shè)置空白對(duì)照組(ph7.2～7.4，3mol/l的pbs)和陰性對(duì)照組(500μg/mlbsa)，研究表明其對(duì)于體外淋巴細(xì)胞增殖沒有影響。每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)樣。在5％co237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h后，無菌條件下每孔加入20μlmtt，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心棄去上清液，每孔加入100μl二甲基亞砜，37℃生化培養(yǎng)箱孵化10min，搖勻，用酶標(biāo)儀在570nm處測定吸光值。

體外淋巴細(xì)胞增殖能力用刺激指數(shù)來表示，計(jì)算方法如下：

式中：a1為空白對(duì)照在570nm處下的吸光值；a2為陰性對(duì)照組在570nm處下的吸光值，a3為實(shí)驗(yàn)組在570nm處下的吸光值。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，在生物活性肽draahvkqvl的質(zhì)量濃度為100μg/ml的條件下，乳源性生物活性肽draahvkqvl的刺激指數(shù)大于bsa，說明draahvkqvl一定程度上能刺激體外小鼠淋巴細(xì)胞的增殖。并且draahvkqvl的刺激指數(shù)達(dá)到了1.245，和陰性對(duì)照組具有顯著差異(p<0.05)。因此，可以認(rèn)定該活性多肽draahvkqvl具有顯著促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的能力，可以作為一種保健品或者添加劑食用，能夠提高動(dòng)物和人體的免疫力。

表5生物活性多肽draahvkqvl對(duì)體外淋巴細(xì)胞增殖的影響

注：*號(hào)標(biāo)記為與陰性對(duì)照比較，有顯著性差異(p＜0.05)。

二、mtt法測定生物活性多肽draahvkqvl的體外巨噬細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)

1)實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

試劑：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物balb/c小鼠(雄性6-8周齡)上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；實(shí)施例1獲得的乳源性生物活性多肽draahvkqvl；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt)amresco公司；lps(脂多糖)sigma公司；牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)genebase公司；三聯(lián)溶解液，含10％sds、5％異丁醇以及0.012mol/lhcl的水溶液。

儀器設(shè)備：lrh-250f生化培養(yǎng)箱上海恒科技有限公司；gl-22m高速冷凍離心機(jī)上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；heracell150co2培養(yǎng)箱heraeus公司；dragonwellscanmk3酶標(biāo)儀labsystems公司。

2)試驗(yàn)方法：

balb/c小鼠腹腔注射2ml的2％(w/w)滅菌淀粉溶液，連續(xù)注射三天，最后一次注射24小時(shí)后斷頸處死。剝?nèi)ジ共科つw，用注射器吸取4℃磷酸鹽緩沖液(pbs)反復(fù)沖洗腹腔，離心管收集沖洗液后，離心(1000rpm，4℃)10分鐘后棄上清，用4℃rpmi1640完全培養(yǎng)液(含10％fbs)洗滌兩次，0.2％臺(tái)盼藍(lán)溶液染色做細(xì)胞活力檢測，確認(rèn)采集到的有活力巨噬細(xì)胞占95％以上。細(xì)胞計(jì)數(shù)板讀數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度。

將已吹打至完全懸浮的細(xì)胞懸液以合適體積加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5％co2環(huán)境下培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄孔中液體，用37℃rpmi1640完全培養(yǎng)液小心清洗細(xì)胞培養(yǎng)板孔底，洗去未貼壁的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，得到純化后的貼壁腹腔巨噬細(xì)胞。每孔加入0.2mlrpmi1640完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)用小肽樣品及l(fā)ps事先溶解于培養(yǎng)基后加入，開始細(xì)胞培養(yǎng)。

加入細(xì)胞個(gè)數(shù)為2×10⁵/ml的細(xì)胞懸液100μl/孔，貼壁純化后加入含生物活性多肽(100，500，1000μg/ml)的rpmi1640完全培養(yǎng)液(10％fbs)200μl/孔，連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，炎癥組在24小時(shí)時(shí)加入lps至終濃度100ng/ml。44小時(shí)時(shí)加入5％mtt20μl/孔，達(dá)到48小時(shí)后加入100μl/孔的三聯(lián)溶解液以終止培養(yǎng)，隔夜溶解后，在波長570nm下用酶標(biāo)儀測各孔的吸光度值(od570)，生長指數(shù)(growthindices)的計(jì)算公式如下：

其中，空白組為不施加小肽和bsa的細(xì)胞處理組，bsa組為陰性對(duì)照。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6，在實(shí)驗(yàn)組中生物活性多肽(draahvkqvl)的添加濃度分別為1000，500，100μg/ml，空白組加入相應(yīng)量的pbs作為空白對(duì)照，表示在沒有l(wèi)ps刺激的情況下巨噬細(xì)胞的增殖情況。和空白對(duì)照組相比，添加不同濃度的多肽draahvkqvl實(shí)驗(yàn)組隨著實(shí)驗(yàn)濃度的增加，巨噬細(xì)胞的增殖能力逐漸上升，在濃度為1000，500μg/ml時(shí)，具有顯著性差異(p<0.05)。說明生物活性多肽draahvkqvl具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的能力。

三、生物活性多肽draahvkqvl的促巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)(elisa法)

1.實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

1)試劑：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物balb/c小鼠(雄性6-8周齡)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；小鼠淋巴細(xì)胞提取液，上海索萊寶生物科技有限公司；rpmi1640培養(yǎng)基，gibco公司；牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)，genebase公司；實(shí)施例1獲得的乳源性生物活性多肽draahvkqvl；elisa細(xì)胞因子快速試劑盒(il-4)，武漢博士德生物工程有限公司。

2)儀器設(shè)備

cm-230型摩爾超凈水，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；lrh-250f生化培養(yǎng)箱，上海恒科技有限公司；gl-22m高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；heracell150co2培養(yǎng)箱，heraeus公司；dragonwellscanmk3酶標(biāo)儀，labsystems公司。

2.試驗(yàn)方法

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

制作il-4標(biāo)準(zhǔn)曲線：將濃度為500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml，7.8pg/ml的il-4標(biāo)準(zhǔn)品分別依次加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，再加入生物素標(biāo)記抗小鼠il-4抗體(elisa細(xì)胞因子快速試劑盒)，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90min。甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，每孔依次加入親和素-過氧化物酶復(fù)合物(elisa細(xì)胞因子快速試劑盒)0.1ml。37℃反應(yīng)60min。0.01mpbs洗滌3次，每孔加入0.1mlabc工作液，37℃反應(yīng)30min。0.01mpbs洗滌5次，每孔加入90ultmb顯色液，37℃避光反應(yīng)25min。每孔加入0.1mltmb終止液，用酶標(biāo)儀在450nm測定吸光值。制作的il-4檢測用標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。il-4標(biāo)準(zhǔn)曲線是以濃度為橫坐標(biāo)(單位pg/ml)，450nm下的吸光值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行一次回歸擬合，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.0038x+0.1224，r²＝0.9979。其中x代表il-4濃度，單位為pg/ml，y代表od450下的吸光值。

2)多肽draahvkqvl的促巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子檢測

在無菌條件下取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10⁵/ml接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)組加入生物活性多肽draahvkqvl進(jìn)行培養(yǎng)，調(diào)整生物活性多肽draahvkqvl的終濃度分別為100，50，10μg/ml，與淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)36小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞因子il-4的測定。空白組不加生物活性多肽draahvkqvl，培養(yǎng)36h作為對(duì)照。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8，與空白對(duì)照組相比，隨著多肽濃度的增加，il-4的分泌量逐漸增加；當(dāng)多肽添加濃度達(dá)到50和100μg/ml時(shí)，il-4分泌量顯著大于空白組；可見生物活性多肽draahvkqvl具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的功能，并且通過對(duì)il-4細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)，起到對(duì)機(jī)體體液免疫的調(diào)節(jié)作用。

上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>浙江輝肽生命健康科技有限公司

<120>一種生物活性多肽draahvkqvl及其制備方法和應(yīng)用

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<223>生物活性多肽編碼序列

<400>2

gatagggcagcacacgtgaaacaggtgctg30

<210>3

<211>689

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>乳鐵蛋白氨基酸序列

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