本發(fā)明涉及蛋白表達(dá)與純化領(lǐng)域，具體涉及一種核酸，一種重組質(zhì)粒，一種重組質(zhì)粒的制備方法，一種重組菌株、一種制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的方法以及相關(guān)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein，bmp)屬于轉(zhuǎn)化生長因子(tgf-β)超家族成員，由骨基質(zhì)分泌的一種疏水性蛋白。成熟肽中含有7個高度保守的半胱氨酸，它們形成三個鏈內(nèi)二硫鍵及一個鏈間二硫鍵并將兩條多肽鏈連接為二聚體，bmp家族包括bmp-1、bmp-2、bmp-4、bmp-6、bmp-7、bmp-9、bmp-12和bmp-14等，其中bmp-2具有明顯誘導(dǎo)未分化的成纖維細(xì)胞走向分化為成骨細(xì)胞的作用并能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)異位骨形成和促進(jìn)骨折愈合的功能。bmp-2蛋白在骨科領(lǐng)域中治療新鮮骨折、骨缺損、骨不連、脊柱融合、股骨頭缺血性壞死，骨形態(tài)發(fā)生蛋白與基因治療等方面具有應(yīng)用前景。目前純化的人和牛的bmp-2已經(jīng)用于臨床。它具有募集間充質(zhì)干細(xì)胞、趨化、促進(jìn)血管生成及加速骨的愈合修復(fù)，但bmp-2靠天然純化提取的量極少，難以滿足臨床需求。cn101235084a公開了一種rhbmp-2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2)成熟肽在原核生物中表達(dá)方法：刪除dsba基因信號肽第2-18個氨基酸編碼基因，保留第一個甲硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，得到的片段重組于表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒1；將骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2完整成熟肽的dna重組于重組質(zhì)粒1中dsba基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2：將重組質(zhì)粒2轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌株的菌體中，得到工程菌。經(jīng)培養(yǎng)、添加誘導(dǎo)劑使目的基因表達(dá)，破菌、分離純化得到dsbabmp-2融合蛋白，蛋白酶酶切dsba-bmp-2融合蛋白，經(jīng)分離得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽。但是該專利申請的方法較復(fù)雜，rhbmp-2成熟肽的產(chǎn)量和純度(或活性)仍有待提高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽制備方法復(fù)雜、產(chǎn)量低的缺陷，提供了一種核酸、重組質(zhì)粒及其制備方法、重組菌株、制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的方法和相關(guān)的應(yīng)用。采用本發(fā)明的方法，操作過程相對簡單，表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽產(chǎn)量高，并能保持蛋白活性。具體地，第一方面，本發(fā)明提供了一種核酸，該核酸能夠編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽，其中，所述核酸為seqidno：1所示的核酸，或者在seqidno：1的5’末端和/或3’末端連接有標(biāo)簽的核酸序列所示的核酸。第二方面，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有上述本發(fā)明提供的核酸。第三方面，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒的制備方法，該方法包括以下步驟：(1)提供或制備具有seqidno：3所示序列的核酸序列；(2)將具有seqidno：3所示序列的核酸序列和pet30a(+)載體分別使用kpni和xhoi內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并將酶切后的產(chǎn)物連接。第四方面，本發(fā)明提供了一種重組菌株，所述重組菌株含有上述本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒。第五方面，本發(fā)明提供了一種制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的方法，該方法包括：第六方面，本發(fā)明提供了上述核酸、重組質(zhì)?；蛑亟M菌株在制備用于促進(jìn)骨再生和/或骨修復(fù)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽或藥物中的應(yīng)用。(1)表達(dá)：(37±0.5℃條件下)培養(yǎng)上述本發(fā)明提供的重組菌株至od600＝0.6-0.8時，加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷至其終濃度為0.1±0.02mm，在15±0.5℃的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)13-15h；(2)純化：將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行裂解處理，將裂解處理獲得的上清液加入ni-nta純化柱中進(jìn)行吸附處理，隨后依次使用洗滌緩沖液和洗脫緩沖液分別對ni-nta純化柱進(jìn)行洗滌處理和洗脫處理，收集洗脫處理得到的洗脫液。上述的核酸、重組質(zhì)粒、重組菌株在制備用于促進(jìn)骨再生和/或骨修復(fù)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽或藥物中的應(yīng)用。采用本發(fā)明的核酸、質(zhì)?；虻鞍妆磉_(dá)純化方法，獲得了高產(chǎn)量的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽，并且所得蛋白活性好。通過使用優(yōu)選的表達(dá)載體及表達(dá)菌株，配合特定的表達(dá)和純化蛋白的條件，可以進(jìn)一步提高產(chǎn)量和活性。附圖說明圖1是實施例3制備的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽進(jìn)行sds-page凝膠電泳檢測圖；圖2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的堿性磷酸酶的酶活力測試結(jié)果圖；圖3分別是植入骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽0周、2周、4周后大鼠股骨的x光檢查結(jié)果圖；圖4是sd大鼠肌袋植入骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽后新生組織he染色結(jié)果，其中，a為術(shù)后2周的結(jié)果，↑所示為成軟骨細(xì)胞，▲所示為新生血管，所示為骨島；b為術(shù)后4周的結(jié)果，↑所示為板層骨組織。具體實施方式在本文中所披露的范圍的端點和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數(shù)值范圍來說，各個范圍的端點值之間、各個范圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開。本發(fā)明提供了一種核酸，該核酸能夠編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽，其中，所述核酸為seqidno：1所示的核酸，或者在seqidno：1的5’末端和/或3’末端連接有標(biāo)簽的核酸序列所示的核酸。seqidno：1所示的核酸序列為：caagcgaaacacaaacagcgtaaacgcctgaaaagcagctgcaaacgtcatccgctgtacgttgactttagcgacgtcggttggaacgattggattgttgcaccgccgggttatcacgcattttattgtcacggcgagtgtccgtttccgctggcagatcatctgaatagcaccaaccacgcgattgttcagaccctggttaacagcgttaacagcaaaatcccgaaagcctgctgcgttccgaccgaactgtctgctattagcatgctgtacctggacgagaacgagaaagtcgtcctgaaaaactaccaggacatggtcgtcgaaggctgcggttgtcgctga在本發(fā)明中，所述“連接有標(biāo)簽”指的使用本領(lǐng)域常見的標(biāo)簽對seqidno：1所示的核酸進(jìn)行添加修飾，便于進(jìn)行蛋白制備或純化。例如，連接有標(biāo)簽可以通過在seqidno：1所示的核酸的5’末端和/或3’末端連接下表1所示的標(biāo)簽(如poly-arg、poly-his、flag、strep-tagⅱ和c-myc中的至少一種)而獲得。所述標(biāo)簽不會影響本發(fā)明的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的活性，在實際應(yīng)用過程中，可以根據(jù)需求選擇是否添加標(biāo)簽。表1標(biāo)簽殘基數(shù)氨基酸序列poly-arg5-6(通常為5個)rrrrr(seqidno：4)poly-his2-10(通常為6個)hhhhhh(seqidno：5)flag8dykddddk(seqidno：6)strep-tagⅱ8wshpqfek(seqidno：7)c-myc10eqkliseedl(seqidno：8)本發(fā)明提供的核酸序列通?？梢杂镁酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增法、重組法、或人工合成的方法獲得。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用pcr進(jìn)行擴(kuò)增獲得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)核酸序列，就可以用重組法大批量的獲得有關(guān)氨基酸序列。通常將所得核酸序列克隆入載體，再轉(zhuǎn)入基因工程菌中，然后通過常規(guī)的方法從增殖后的宿主細(xì)胞分離得到有關(guān)核酸序列。此外，還可用公知的人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)核酸序列。本發(fā)明的核酸所編碼的bmp-2成熟肽的氨基酸序列如seqidno：2所示：qakhkqrkrlkssckrhplyvdfsdvgwndwivappgyhafychgecpfpladhlnstnhaivqtlvnsvnskipkaccvptelsaismlyldenekvvlknyqdmvvegcgcr(seqidno：2)本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有上述本發(fā)明提供的能夠編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的核酸。在本發(fā)明中，所述重組質(zhì)粒中所使用的質(zhì)粒優(yōu)選為pet30a(+)質(zhì)粒(可以商購獲得)。所述重組質(zhì)?？刹捎媚軌蛟谳d體多克隆位點具有切割位點的各種核酸內(nèi)切酶(例如對于pet30a(+)，可用xholi、noti、eagi、hindiii、ecori、bamhi、ncoi、kpni、bgiii和ndei等)進(jìn)行酶切獲得線性質(zhì)粒，與采用相同核酸內(nèi)切酶切割的基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒。本發(fā)明優(yōu)選采用xholi和kpni對pet30a(+)進(jìn)行雙酶切。所述重組質(zhì)粒為在pet30a(+)載體的kpni和xhoi酶切位點之間插入上述本發(fā)明提供的核酸而得到的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒的制備方法，該方法包括以下步驟：(1)提供或制備具有seqidno：3所示序列的核酸序列；(2)將具有seqidno：3所示序列的核酸序列和pet30a(+)載體分別使用kpni和xhoi內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并將酶切后的產(chǎn)物連接。seqidno：3所示序列(含seqidno：1所示序列(劃線部分)，即編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的核酸序列)為：cgccatatggacgacgacgacaagcaagcgaaacacaaacagcgtaaacgcctgaaaagcagctgcaaacgtcatccgctgtacgttgactttagcgacgtcggttggaacgattggattgttgcaccgccgggttatcacgcattttattgtcacggcgagtgtccgtttccgctggcagatcatctgaatagcaccaaccacgcgattgttcagaccctggttaacagcgttaacagcaaaatcccgaaagcctgctgcgttccgaccgaactgtctgctattagcatgctgtacctggacgagaacgagaaagtcgtcctgaaaaactaccaggacatggtcgtcgaaggctgcggttgtcgctgaggatccgcg本發(fā)明還提供了一種重組菌株，所述重組菌株含有上述本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒。本發(fā)明可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞(菌株)中從而得到重組菌株，如氯化鈣法化學(xué)轉(zhuǎn)化、高壓電擊轉(zhuǎn)化，優(yōu)選氯化鈣法化學(xué)轉(zhuǎn)化。所述宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌，例如用于保存重組質(zhì)粒的大腸桿菌dh5α菌株和/或top10菌株，用于表達(dá)的大腸桿菌origami2菌株。優(yōu)選地，所述重組菌株為重組大腸桿菌origami2，也即以大腸桿菌origami2作為宿主細(xì)胞可以得到bmp-2成熟肽表達(dá)效果更好地重組菌株。本發(fā)明還提供了一種制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的方法，該方法包括：(1)表達(dá)：(37±0.5℃條件下)培養(yǎng)本發(fā)明的重組菌株至od600＝0.6-0.8時，加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷至其終濃度為0.1±0.02mm，在15±0.5℃的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)13-15h；(2)純化：將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行裂解處理，將裂解處理獲得的上清液加入ni-nta純化柱中進(jìn)行吸附處理，隨后依次使用洗滌緩沖液和洗脫緩沖液分別對ni-nta純化柱進(jìn)行洗滌處理和洗脫處理，收集洗脫處理得到的洗脫液。本發(fā)明對步驟(1)中的培養(yǎng)條件沒有特別的限定，可以采用常規(guī)條件。例如，所述培養(yǎng)溫度可以為37±0.5℃，培養(yǎng)基可以為lb培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速可以為150-250rpm。本發(fā)明優(yōu)選在裂解處理之前通過離心除去培養(yǎng)基，條件可以包括：溫度為2-6℃，轉(zhuǎn)速為6000-8000g，時間為8-12min。優(yōu)選還包括使用pbs緩沖液重懸之后再次離心。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，在步驟(2)中，所述裂解處理包括：將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞產(chǎn)物與裂解緩沖液接觸，隨后進(jìn)行超聲處理。所述裂解處理的條件可以包括：溫度為2-6℃，時間為15-25min。優(yōu)選地，所述裂解緩沖液含有100mmnacl和20mmtris，ph為8。可以采用常規(guī)的超聲方式進(jìn)行超聲處理，優(yōu)選地，所述超聲處理為間歇式處理，例如，所述超聲處理的條件可以包括：超聲波破碎10±1s，停20±1s，共7-10min。在本發(fā)明中，所述吸附處理的條件可以包括：溫度為2-6℃，時間為0.1-2小時。在本發(fā)明中，所述洗滌處理的條件可以包括：溫度為2-6℃，次數(shù)為2-5。優(yōu)選地，所述洗滌緩沖液含有：500mmnacl、20mmtris和100mm咪唑，ph為8。在本發(fā)明中，所述洗脫處理的溫度可以為2-6℃。優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液含有：500mmnacl、20mmtris和500mm咪唑，ph為8。根據(jù)本發(fā)明，洗脫處理得到的蛋白洗脫液可以通過sds-page進(jìn)行檢測，bradford法測定蛋白的濃度，根據(jù)濃度用濃縮管對洗脫液進(jìn)行濃縮。經(jīng)無菌過濾后，-20℃保存。本發(fā)明還提供了上述核酸、重組質(zhì)?；蛑亟M菌株在制備用于治療促進(jìn)骨再生和/或骨修復(fù)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽或藥物中的應(yīng)用。使用本發(fā)明的核酸、重組質(zhì)?；蛑亟M菌株能夠制備高產(chǎn)量、高純度、具有高骨再生和/或骨修復(fù)活性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽，適于推廣應(yīng)用。以下將通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實施例中：核酸序列由華大基因合成。kpni、xhoi內(nèi)切酶、t4連接酶和taqdna聚合酶均購自寶生物工程有限公司，貨號分別為1618、1635、6022和r001a。凝膠回收試劑盒購自omega公司，貨號d2500。質(zhì)粒提取試劑盒購自omega公司，貨號為d6943。大腸桿菌origami2感受態(tài)細(xì)胞購自millipore公司，貨號為71346。ni-nta純化柱購自ge公司，貨號為17-5268-01。小鼠成肌細(xì)胞c2c12購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號為cl-0044。堿性磷酸酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，貨號為a059。實施例1本實施例用于說明本發(fā)明重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法(1)雙酶切載體pet30a(+)的酶切體系目的片段酶切體系注：目的片段為seqidno：3所示序列的核酸。將上述酶切體系各組分加入離心管中并渦旋混合均勻，置于37℃水浴3h。然后將載體酶切體系和目的片段酶切體系加入1重量％瓊脂糖凝電泳中進(jìn)行分離，在紫外光下，切割符合要求的電泳條帶。使用凝膠回收試劑盒回收條帶。(2)酶切產(chǎn)物連接將各組分加入體系中，渦旋混勻，16℃下水浴16h。實施例2本實施例用于說明重組菌株的構(gòu)建(1)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化取100μl感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌top10加入到ep管中，然后加入10μl連接產(chǎn)物，用移液器輕輕混勻，冰上放置30min，轉(zhuǎn)入42℃中水浴30s，立即轉(zhuǎn)至冰上冷卻2min。取500μl的lb培養(yǎng)基加入其中，37℃，150r培養(yǎng)1.5h。取50μl菌液涂布在含有卡拉霉素(50μg/ml)的lb平板上，37℃培養(yǎng)14h，有單個的菌落出現(xiàn)。(2)陽性克隆鑒定挑取單菌，加入到10μlddh2o中，移液槍輕輕混勻后進(jìn)行pcr檢測。pcr體系如下：上游引物序列(seqidno：9)：5’-caagcaagcgaaacacaaacag-3’下游引物序列(seqidno：10)：3’-ctcagcgacaaccgcagcctt-5’pcr反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)5min；95℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。取5μl的pcr產(chǎn)物與10×loadingbuffer混勻，在1重量％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外光下驗證目的條帶存在。挑選有目的條帶存在的菌株轉(zhuǎn)入10mllb培養(yǎng)基中，37℃，250r培養(yǎng)12h，取樣600μl樣品加入400μl甘油，混勻密封后保存在-80℃超低溫冰箱中。另取5ml菌液利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒送上海英俊公司測序。利用dnaman軟件分析測序結(jié)果，與bmp-2基因序列比對，選擇完全正確的質(zhì)粒命名為pet30a(+)-bmp2。(3)表達(dá)菌株的構(gòu)建將pet30a(+)-bmp2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌origami2感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化過程同上。取50μl培養(yǎng)的菌液涂布在含有卡拉霉素(50μg/ml)及氯霉素(34μg/l)的lb平板上，37℃培養(yǎng)14h，有白色的單個菌落出現(xiàn)。實施例3本實施例用于說明本發(fā)明提供的制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的方法(1)取含有pet30a(+)-bmp2的origami2菌落加入10ml含有卡拉霉素的lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15h。分別取1ml菌液轉(zhuǎn)入100ml含卡拉霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)od600＝0.6時，加入iptg至終濃度為0.1mm，15℃，220rpm誘導(dǎo)14h。(2)將步驟(1)得到的菌液全部裝入50ml離心管中，4℃下8000g離心10min，除去上清后加入10ml預(yù)冷的pbs緩沖液重懸，4℃，8000g離心10min，棄上清，盡量除去殘留的液體。(3)在管中加入20ml裂解緩沖液(100mmnacl，20mmtris，ph8.0)，4℃，100r反應(yīng)20min，超聲波破碎10s，停20s，共8min，11000r離心15min，取上清。(4)把上清加入到有1mlni-nta的純化柱中，待上清全部流出后，加入4ml洗滌緩沖液(500mmnacl，20mmtris，100mm咪唑，ph8.0)，重復(fù)4次，然后加入4ml洗脫緩沖液(500mmnacl，20mmtris，500mm咪唑，ph8.0)，收集洗脫液。(5)將純化后的洗脫液收集混合，并對蛋白進(jìn)行sds-page檢測，bradford法測定純化蛋白的濃度，根據(jù)濃度用濃縮管對洗脫液進(jìn)行濃縮。經(jīng)無菌過濾后，-20℃保存。實施例4本實施例用于說明本發(fā)明制備的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽(rhbmp-2)的性能測試將實施例3制備的骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽進(jìn)行sds-page凝膠電泳檢測，如圖1所示。采用bradford法測定骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的表達(dá)產(chǎn)量達(dá)到1mg/l，純度達(dá)到85％。對小鼠成肌細(xì)胞c2c12進(jìn)行培養(yǎng)，按每孔1×105個細(xì)胞接種于含10％胎牛血清(fbs)的dmem培養(yǎng)基的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于5％的二氧化碳培養(yǎng)箱種37℃培養(yǎng)24h后，向各孔中加入濃度分別為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的rhbmp-2，選擇pbs作為空白對照。誘導(dǎo)培養(yǎng)4d后，收集細(xì)胞，用pbs緩沖液洗滌2次后，利用堿性磷酸酶檢測試劑盒測定酶活力，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算akp活力，結(jié)果如圖2所示。堿性磷酸酶活性檢測顯示加入不同濃度的rhbmp-2均高于空白對照組，有顯著性差異(p＜0.05)，rhbmp-2具有成骨活性良好。sd大鼠肌袋rhbmp-2異位成骨動物實驗：將合成的rhbmp-2蛋白凍干埋入大鼠的股四頭肌內(nèi)，手術(shù)過程如下：7重量％水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，成功后備皮，常規(guī)消毒鋪巾，選取sd大鼠右大腿后方中上側(cè)，作一切口長約1cm，分離筋膜后暴露股四頭肌，在肌肉上鈍性分離，沿肌纖維方向做一長、深均0.5cm的肌袋(勿穿破肌肉)，植入rhbmp-2蛋白(1μg)，縫合肌袋及皮膚，標(biāo)記。左側(cè)大腿為空白對照組。術(shù)后青霉素20萬u腹腔內(nèi)注射，連續(xù)三天。0、2、4周時x光檢查(結(jié)果如圖3所示)，植入2周和4周進(jìn)行病理組織切片he染色(結(jié)果如圖4所示)。圖3和圖4表明植入本發(fā)明的rhbmp-2顯示出明確異位成骨，效果良好。以上實驗結(jié)果表明，使用seqidno：1所示的核酸轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株大腸桿菌origami2能夠以較高產(chǎn)量和純度表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽。進(jìn)一步地，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：使用其它常規(guī)表達(dá)菌株(如大腸桿菌rosetta-gami2)表達(dá)的bmp-2成熟肽產(chǎn)量較少，而且純化的時候存在難以去除的雜蛋白，致使最終產(chǎn)物純度不高。因此，使用優(yōu)選的大腸桿菌origami2作為表達(dá)菌株比使用其它常規(guī)表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化seqidno：1所示的核酸時，骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的產(chǎn)量和純度進(jìn)一步提高。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于此。在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，包括各個技術(shù)特征以任何其它的合適方式進(jìn)行組合，這些簡單變型和組合同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院<120>核酸和重組質(zhì)粒及其制備方法和應(yīng)用<130><160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>345<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>1caagcgaaacacaaacagcgtaaacgcctgaaaagcagctgcaaacgtcatccgctgtac60gttgactttagcgacgtcggttggaacgattggattgttgcaccgccgggttatcacgca120ttttattgtcacggcgagtgtccgtttccgctggcagatcatctgaatagcaccaaccac180gcgattgttcagaccctggttaacagcgttaacagcaaaatcccgaaagcctgctgcgtt240ccgaccgaactgtctgctattagcatgctgtacctggacgagaacgagaaagtcgtcctg300aaaaactaccaggacatggtcgtcgaaggctgcggttgtcgctga345<210>2<211>114<212>prt<213>bmp-2成熟肽<400>2glnalalyshislysglnarglysargleulyssersercyslysarg151015hisproleutyrvalasppheseraspvalglytrpasnasptrpile202530valalaproproglytyrhisalaphetyrcyshisglyglucyspro354045pheproleualaasphisleuasnserthrasnhisalailevalgln505560thrleuvalasnservalasnserlysileprolysalacyscysval65707580prothrgluleuseralailesermetleutyrleuaspgluasnglu859095lysvalvalleulysasntyrglnaspmetvalvalgluglycysgly100105110cysarg<210>3<211>378<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>3cgccatatggacgacgacgacaagcaagcgaaacacaaacagcgtaaacgcctgaaaagc60agctgcaaacgtcatccgctgtacgttgactttagcgacgtcggttggaacgattggatt120gttgcaccgccgggttatcacgcattttattgtcacggcgagtgtccgtttccgctggca180gatcatctgaatagcaccaaccacgcgattgttcagaccctggttaacagcgttaacagc240aaaatcccgaaagcctgctgcgttccgaccgaactgtctgctattagcatgctgtacctg300gacgagaacgagaaagtcgtcctgaaaaactaccaggacatggtcgtcgaaggctgcggt360tgtcgctgaggatccgcg378<210>4<211>5<212>prt<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>4argargargargarg15<210>5<211>6<212>prt<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>5hishishishishishis15<210>6<211>8<212>prt<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>6asptyrlysaspaspaspasplys15<210>7<211>8<212>prt<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>7trpserhisproglnpheglulys15<210>8<211>10<212>prt<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>8gluglnlysleuileserglugluaspleu1510<210>9<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>9caagcaagcgaaacacaaacag22<210>10<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>10ctcagcgacaaccgcagcctt21當(dāng)前第1頁12