專利名稱：尿酸酶脂質(zhì)納米粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及尿酸酶脂質(zhì)納米粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
細胞內(nèi)核酸和核苷酸分解過程中所生成的嘌呤，在黃嘌呤氧化酶作 用下轉(zhuǎn)變成尿 酸。尿酸酶(Uricase，UC)可催化尿酸氧化，生成過氧化氫(H202)和尿囊素(allantion) 而排出體外。但由于人體缺乏UC，嘌呤分解代謝只能生成尿酸經(jīng)腎臟排泄。尿酸生成超過 腎臟排泄時，就會造成高尿酸血癥(血液中尿酸濃度高于0. 42mmol/L)。高尿酸血癥可引發(fā) 或加劇多種疾病惡性腫瘤化療時由于腫瘤細胞大量裂解導致的高尿酸血癥可引起代謝紊 亂和腎功能衰竭甚至死亡，即腫瘤溶解綜合征；尿酸沉積在關(guān)節(jié)內(nèi)引起痛風，沉積在腎小管 造成腎功能障礙、腎小管損傷、IgA腎病炎癥；尿酸刺激血管平滑肌細胞增殖會導致內(nèi)皮細 胞功能障礙；高尿酸血癥是動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險因素。目前高尿酸血癥的常用防治方案給予黃嘌呤氧化酶抑制劑(別嘌醇)存在下列缺 陷(1)別嘌醇可阻滯尿酸生成，但會增加腎臟排泄尿酸前體(次黃嘌呤和在尿中比尿酸更 難溶的黃嘌呤)的負荷，對于伴隨高尿酸血癥產(chǎn)生高濃度血黃嘌呤的患者而言，雪上加霜； (2)對病人體內(nèi)已存留的尿酸，用別嘌醇治療無效；(3)別嘌醇和丙磺舒類藥物都有明顯肝 腎毒性，還易引起過敏反應。尿囊素的優(yōu)良水溶性和腎臟對尿囊素的高效排泄能力使UC有可能成為治療高尿 酸血癥的理想藥物。臨床研究表明UC可快速高效降低血尿酸，且專一性高，在治療腫瘤溶 解綜合征時，UC比別嘌呤醇更安全有效。20多年前法國和意大利批準黃曲霉UC(UriC0Zyme )、本世紀初美國和歐盟批準基因重組UC(Rasburicase)用于防治腫瘤化療時產(chǎn)生的高尿 酸血癥。UC也可用于治療痛風。將UC用作降低血漿尿酸的藥物存在巨大需求。但所有的天然UC均存在內(nèi)在缺陷(1)外環(huán)境pH值對UC催化能力影響很大。UC 的最適PH值偏堿性(8. 5 9.2)，pH 7. 4 (如血漿中)時催化能力低(苛求芽孢桿菌胞內(nèi) UC僅為最適pH值時活性的20%)，pH 5 (如腎小管內(nèi))時催化能力更低。這導致UC在體 內(nèi)活性較低，治療時所需劑量較大，治療成本較高，安全性低。⑵體內(nèi)循環(huán)半衰期較短。UC 在生物體內(nèi)不穩(wěn)定，易于被蛋白酶水解失去活性。(3)易誘發(fā)機體免疫反應，產(chǎn)生免疫原性 和抗原反應。Uricozyme的嚴重過敏反應發(fā)生率為5%，使用UC還常出現(xiàn)嘔吐( 50% )、 發(fā)燒( 46% )，惡心( 27% )等不良反應。針對天然酶的缺陷，有下列研究將UC吸附、共價結(jié)合于殼聚糖或葡聚糖，將UC包 埋于羧甲基直鏈淀粉或包封于紅血球中，將UC與白蛋白交聯(lián)，將PEG化UC包封于脂質(zhì)體 中，將UC包封于海藻酸鹽微囊，將UC固定于金屬螯合珠(150 200 μ m)表面，將UC共價 結(jié)合在免疫脂質(zhì)體或普通脂質(zhì)體表面等。但是，以上各種方式都不能使UC在最適或接近最 適PH環(huán)境發(fā)揮催化活性，且大都存在酶易脫落、生物相容性較低、易引起凝血、穩(wěn)定性和特 異性不理想等缺點。近年來，人們用PEG修飾UC取得了一些進展，目前正在北美進行III期臨床試驗的Puricase是PEG化UC研究最成功的例子。PEG化UC雖然在延長酶半衰期、降低免疫原性 和抗原反應性方面較天然酶有一定優(yōu)勢，但仍存在一些缺點(1)仍然是在PH 7. 4而非UC 的最適PH值(8.5 9. 2)發(fā)揮作用，UC活性較低，PEG化后活性更低(保留的比活性為 10% 40%)。(2)即使最優(yōu)化的Puricase，靜注后的生物利用度也較天然酶低(部分原 因是酶-PEG聚合物的分子量很大)。(3)只要存在少量的大分子聚集體，PEG化UC就會產(chǎn) 生免疫原性。(4) PEG化UC技術(shù)要求高，工藝復雜，成本較高。迄今為止，介導酶的半滲透性微反應系統(tǒng)的研究主要集中在PEG化聚乳酸/羥基乙酸(PLGA)納米粒、PLGA微球、聚氰基丙烯酸異丁酯(PIBCA)納米粒和脂質(zhì)納米粒，構(gòu)建 的酶的微環(huán)境大多為中性或偏酸性，不適用于UC(見圖1)。經(jīng)查詢專利及文獻，均無人用偏堿性(pH8 9)的緩沖對構(gòu)建介導尿酸酶的半滲 透性偏堿性微反應系統(tǒng)。而且，本專利的設(shè)計思路、配方、制備方法、得到的制劑及其特性與 以前的研究均不相同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種尿酸酶脂質(zhì)納米粒及其制備方法。該制劑 針對臨床確切的需要，能克服迄今為止研發(fā)的其它尿酸酶制劑的缺點。本研究制得的尿酸 酶脂質(zhì)納米粒能明顯提高尿酸酶在體液PH7. 4時的活性，延長半衰期，無免疫原性，減少劑 量，提高穩(wěn)定性。所制得的制劑可以作為靜脈給藥的劑型應用于臨床。本發(fā)明的尿酸酶脂質(zhì)納米粒為一種膠體給藥體系，包括治療有效劑量的尿酸酶、 磷脂、膽固醇，調(diào)節(jié)PH的緩沖液，穩(wěn)定劑牛血清白蛋白，及脂質(zhì)納米粒制備所需其它附加 齊U。脂質(zhì)納米粒的粒徑為100 lOOOnm，優(yōu)選的處方為卵磷脂1份，膽固醇1份，含聚乙二 醇型長效脂質(zhì)如DSPE-PEG20000. 05份，尿酸酶為0. 3U/ml，牛血清白蛋白0. 05mg/ml,50mM 硼酸-硼砂緩沖液PH為8. 5。優(yōu)化制得的脂質(zhì)納米粒粒徑為200nm左右。本發(fā)明的尿酸 酶脂質(zhì)納米粒制備方法為將配方量卵磷脂和膽固醇溶于適量有機溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減 壓揮干有機溶劑，加入適量有機溶劑，加入含UC和BSA的50mmol/L硼酸-硼砂緩沖液緩沖 液(PH為8 9)，，水浴超聲至形成均勻的帶乳光的分散體系，繼續(xù)減壓蒸發(fā)，至凝膠狀塌陷 為乳白色的帶乳光的均勻液體時，加入適量硼酸緩沖液，繼續(xù)減壓旋轉(zhuǎn)，所得混懸液在冰箱 4°C放置24小時后，過0. 22 μ m的微孔濾膜，即得。本發(fā)明所得的脂質(zhì)納米粒粒徑小于1 μ m 的總數(shù)不得低于95%，大于1 μ m的總數(shù)不得超過3%，不得檢出大于5 μ m的納米粒。本發(fā) 明所得的脂質(zhì)納米?？赏ㄟ^Si^phadex柱層析，分離除去未包封于脂質(zhì)納米粒內(nèi)的游離酶。 優(yōu)化的配方和工藝得到的尿酸酶納米粒的平均粒徑在200nm左右，Zeta電位< _30mV，包封 率> 88%。本發(fā)明所得的脂質(zhì)納米?？伸o注用于臨床，或者采用本領(lǐng)域公認的方法制備成 粉劑和凍干劑給藥。在介質(zhì)pH7. 4條件下，本發(fā)明制得的脂質(zhì)納米粒(制備時用pH為8. 5的硼酸緩沖 液)介導的同樣劑量的UC將尿酸從高濃度(0. 6mM)降至正常水平(0. 24mM)，所用時間較天 然UC明顯減少，降至其它尿酸低水平，脂質(zhì)納米粒介導的UC所需時間也明顯低于天然UC。 本研究制得的尿酸酶脂質(zhì)納米粒能明顯提高尿酸酶在體液PH7. 4的活性(制劑介導的UC 保留的活性可達天然酶在最適PH時的活性的80 150%，苛求芽孢桿菌胞內(nèi)UC僅為最適 PH值時的20%，PEG化UC在體液pH7. 4時保留的活性為10% 40% )，無免疫原性(采用皮下注射含UC的完全弗氏佐劑乳液制備兔抗血清，將尿酸酶脂質(zhì)納米粒與不同量的抗血 清液37°c下孵育30min后考察抗原性，尿酸酶脂質(zhì)納米粒與抗血清未起反應，同樣劑量的 天然酶免疫原性較強)。加入了聚乙二醇型長效脂質(zhì)制備的尿酸酶脂質(zhì)納米粒，可明顯延 長尿酸酶在體內(nèi)的半衰期(從天然酶的4小時延長至18. 5小時)。尿酸酶脂質(zhì)納米粒對 血管無刺激性(選擇健康昆明種小鼠20只，尾靜脈注射0. 2ml尿酸酶脂質(zhì)納米粒，給藥后 1小時，給藥小鼠無任何異常行為，無刺激性反應，小鼠活動和飲食不受影響)。尿酸酶脂質(zhì) 納米粒無凝血、無紅細胞凝集作用(大耳白家兔一只，心臟取血，制備成2%紅細胞懸液于 各試管，再分別加入不同量的受試藥液和生理鹽水作樣品管、陽性對照管僅加入生理鹽水、 陽性對照管僅加入去離子水，置于37°C恒溫箱內(nèi)，每隔20分鐘觀察一次，共觀察6小時。加 入脂質(zhì)納米粒的各管，與陰性對照管的上清液均未出現(xiàn)透明紅色和紅棕色絮狀沉淀物，陽 性對照管完全溶血)。本專利首次用偏堿性(pH8 9)的緩沖液構(gòu)建介導尿酸酶的半滲透性脂質(zhì)納米粒 微反應系統(tǒng)，已用熒光探針測定該納米粒介導尿酸酶的微環(huán)境偏堿性，不同于常規(guī)脂質(zhì)納 米粒的微環(huán)境偏酸性或中性。制備得到的尿酸酶脂質(zhì)納米?？梢院芎帽Ａ裟蛩崦傅幕钚?， 無免疫原性，減少劑量，提高穩(wěn)定性，加入長效脂質(zhì)制備的脂質(zhì)納米粒明顯延長尿酸酶體內(nèi) 半衰期。


圖1在介質(zhì)pH7. 4條件下，本發(fā)明的尿酸酶脂質(zhì)納米粒和天然酶降低尿酸(體系 開始的尿酸濃度為0.60mmol/L)的情況。制劑1為本發(fā)明制得的尿酸酶脂質(zhì)納米粒制劑 (制備時用PH為9的硼酸-硼砂緩沖液)降低尿酸(體系開始的尿酸濃度為0. eOmmol/ L)的情況，制劑2為天然尿酸酶的PBS緩沖液制劑(pH為7. 4)降低尿酸(體系開始的尿 酸濃度為0.60mmol/L)的情況，制劑3為天然尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為9)(降低 尿酸(體系開始的尿酸濃度為0.60mmol/L)的情況測定方法60 μ L樣品(制劑)中加入 6mL0. 60mmol/L的尿酸PBS (pH為7. 4)，混勻，37°C恒溫振蕩，不同時間點取樣。時間點0、 0. 083h、0. 167h、15min-0. 25h、0. 5h、0. 75h、lh、2h、4h、8h、12h、16h、24h。測定尿酸的濃度， 以時間為橫坐標，體系中剩余尿酸的百分數(shù)為縱坐標作圖。)圖2為本發(fā)明的尿酸酶脂質(zhì)納米粒的電鏡照片圖3為本發(fā)明的尿酸酶脂質(zhì)納米粒的粒徑分布圖4為本發(fā)明的尿酸酶脂質(zhì)納米粒的Zeta電位圖5為FITC熒光探針標準曲線(發(fā)射波長為522nm)。測得pH為8. 5的硼酸-硼 砂緩沖液構(gòu)建的脂質(zhì)納米粒的熒光強度Fem的比值(λ 495/409)為12. 76，從FITC熒光探 針標準曲線可知，本發(fā)明構(gòu)建的尿酸酶脂質(zhì)納米粒微環(huán)境為8.0左右，為偏堿性。為了進一步說明本發(fā)明及其優(yōu)點，給出了下列特定的實施例，應理解這些實施例 僅有于具體說明而不是作為本發(fā)明范圍的限制。實施例1 配方卵磷脂0. 8份，膽固醇0. 8份，DSPE-PEG20000. 07份，尿酸酶、牛血清白蛋白 適量(使制得制劑中含量為0. 3U/ml，牛血清白蛋白0. 05mg/ml)，50mMTris緩沖液pH為8。 制備方法為將配方量卵磷脂和膽固醇溶于IOml乙醚中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓揮干氯仿，加入15ml乙醚，加入含UC和BSA的50mmol/L硼酸-硼砂緩沖液緩沖液，，水浴超聲至形成均勻 的帶乳光的分散體系，繼續(xù)減壓蒸發(fā)，至凝膠狀塌陷為乳白色的帶乳光的均勻液體時，加入 適量硼酸緩沖液，繼續(xù)減壓旋轉(zhuǎn)，所得混懸液在冰箱4°C放置24小時后，過0. 22 μ m的微孔 濾膜，即得。實施例2 配方卵磷脂1. 5份，膽固醇1份，DSPE-PEG50000. 05份，尿酸酶、牛血清白蛋白適 量(使制得制劑中含量為0. 2U/ml，牛血清白蛋白0. 08mg/ml)，10mM硼酸-硼砂緩沖液(pH 為8. 5)。制備方法為將配方量 卵磷脂和膽固醇溶于20ml氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓揮干氯 仿，加入30ml乙醚，加入含UC和BSA的50mmol/L硼酸-硼砂緩沖液，其余操作同實施例1。實施例3 配方卵磷脂2份，膽固醇2份，DSPE-PEG20000.05份，尿酸酶、牛血清白蛋白適量 (使制得制劑中含量為0. lU/ml，牛血清白蛋白0. lmg/ml)，IOOmMBicine緩沖液(pH為9)。 制備方法為將配方量卵磷脂和膽固醇溶于30ml乙醚中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓揮干，加入適量 乙醚，加入含UC和BSA的lOOmmol/LBicine緩沖液，其余操作同實施例1。實施例4 配方卵磷脂1份，膽固醇1份，DSPE-PEG50000. 06份，尿酸酶、牛血清白蛋白適量 (使制得制劑中含量為0. 5U/ml，牛血清白蛋白0. 15mg/ml),50mMTris緩沖液(pH為8. 5)。 制備方法為將配方量卵磷脂和膽固醇溶于50ml氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓揮干氯仿，加入 適量乙醚，加入含UC和BSA的50mmol/LTriS緩沖液，其余操作同實施例1。實施例5 配方卵磷脂1. 2份，膽固醇2. 8份，DSPE-PEG20000. 05份，尿酸酶、牛血清白蛋白 適量(使制得制劑中含量為0. 8U/ml，牛血清白蛋白0. 15mg/ml)，50mM硼酸-硼砂緩沖液 (pH為8. 5)。制備方法為將配方量卵磷脂和膽固醇溶于50ml氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓揮 干氯仿，加入適量乙醚，加入含UC和BSA的50mmol/L硼酸-硼砂緩沖液，其余操作同實施 例1。實施例6 配方卵磷脂3份，膽固醇1.5份，尿酸酶、牛血清白蛋白適量(使制得制劑中含量 為lU/ml，牛血清白蛋白0. lmg/ml), 30mMBicine緩沖液(pH為8. 5)。制備方法為將配方 量卵磷脂和膽固醇溶于15ml氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓揮干氯仿，加入8ml乙醚，加入含UC 和BSA的30mmOl/LBicine緩沖液，其余操作同實施例1。
權(quán)利要求
一種尿酸酶脂質(zhì)納米粒，其特征在于制劑中尿酸酶含量為0.1～1U/mL，牛血清白蛋白為0.02～0.15mg/ml，制備制劑所用的緩沖液pH為8～9，離子強度為10～100mM，其余組分重量配比為磷脂成分為1～3份，膽固醇為1～3份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿酸酶脂質(zhì)納米粒，其特征在于制備制劑所用的緩沖液可以 是硼酸_硼砂砂緩沖液、Tris緩沖液、Bicine緩沖液，離子強度為10 lOOmM，pH值范圍 在8 9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿酸酶脂質(zhì)納米粒，其特征在于制備制劑所用的磷脂可以是 注射用卵磷脂、豆磷脂、合成磷脂包括聚乙二醇型長效脂質(zhì)如DSPE-PEG2000，DSPE-PEG5000 的一種或幾種。磷脂成分為1 3份，聚乙二醇型長效脂質(zhì)成分為0. 02 0. 2份，膽固醇 為1 3份。
4.一種尿酸酶脂質(zhì)納米粒的制備方法，其特征在于將配方量卵磷脂和膽固醇溶于適 量氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去有機溶劑，加入適量乙醚，加入溶有UC和BSA的緩沖液(緩 沖液PH為8 9. 5)，水浴超聲至形成均勻的帶乳光的分散體系，繼續(xù)減壓蒸發(fā)，至凝膠狀塌 陷為乳白色的帶乳光的均勻液體時，加入適量緩沖液，繼續(xù)減壓旋轉(zhuǎn)，所得制劑在冰箱4°C 放置24小時后，過0. 22 μ m的微孔濾膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的尿酸酶脂質(zhì)納米粒的制備方法，其特征在于所述有機 溶劑為氯仿、甲醇、乙醚或兩種的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的的配方和制備方法得到的尿酸酶脂質(zhì)納米粒，其特征在 于平均粒徑小于1 μ m, Zeta電位小于_20，優(yōu)選配方和制備工藝的平均粒徑為200nm左 右，Zeta電位小于-30，脂質(zhì)納米粒介導酶的微環(huán)境偏堿性，體液pH7. 4時，比較于天然尿酸 酶，尿酸酶脂質(zhì)納米粒的催化活性明顯增加，半衰期明顯延長，免疫原性大大下降。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種尿酸酶脂質(zhì)納米粒的配方及制備工藝。其中尿酸酶的含量為0.1U/ml～1U/ml，其余為脂質(zhì)納米粒的藥用輔料或附加劑。該制劑可用于治療特征為循環(huán)尿酸水平增加的不同疾病，包括但不限于高尿酸血癥和腫瘤崩解綜合癥。
文檔編號A61K47/42GK101816630SQ200910103269
公開日2010年9月1日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者廖飛, 張景勍, 王娜, 董志, 趙春景, 邱宗蔭 申請人:重慶醫(yī)科大學