專利名稱：：大蒜總皂苷的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種大蒜總皂苷的制備方法，還涉及用該方法制得的大蒜總皂苷及其藥物組合物，以及該大蒜總皂苷在制備耐缺氧藥物或食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：氧提供生物氧化所需的能源，是正常生命活動(dòng)不可或缺的重要物質(zhì)。缺氧是一類相當(dāng)常見的病理過程，不僅在大氣中氧分壓過低的情況下發(fā)生，也可在呼吸、血液、循環(huán)等系統(tǒng)疾病時(shí)由于氧供給和氧利用障礙而出現(xiàn)，從而引發(fā)心缺氧反應(yīng)(心悸、胸悶、氣促等)、腦缺氧反應(yīng)(頭暈?zāi)垦?、記憶障礙、神志不清等)及軀體缺氧反應(yīng)(機(jī)體反應(yīng)遲鈍、酸痛乏力、手腳發(fā)麻等)，最終導(dǎo)致心、腦等主要器官因供氧不足而死亡。因此，預(yù)防和治療缺氧具有十分重要的意義。大蒜在全世界普遍種植，是藥食同源植物，在人們?nèi)粘Ｉ攀持芯哂兄匾匚?。大蒜的成分?fù)雜，主要有含硫有機(jī)化合物、皂苷類、氨基酸類、酶類、脂類、糖類、維生素和微量元素等多種成分。現(xiàn)代藥理研究顯示，大蒜不但有抗菌、消炎、殺蟲等作用，還有降血脂、降血壓、抗血栓、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種功效。目前，大蒜中研究和應(yīng)用較多的是揮發(fā)油和蒜素，已有大蒜油膠嚢等保健食品面市。但大蒜皂苷類化合物的制備方法及其活性研究方面的相關(guān)報(bào)道較少，大蒜皂苷未能得到充分、有效地利用。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有缺氧防治領(lǐng)域和大蒜應(yīng)用領(lǐng)域存在的不足，充分開發(fā)利用國內(nèi)豐富的大蒜資源，研制療效顯著且毒副作用小的耐缺氧藥物或食品，以滿足臨床、軍用和民用需求，本發(fā)明的目的之一在于提供一種大蒜總皂苷的制備方3法，具有操作簡單、提取率高、產(chǎn)品質(zhì)量可控、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種大蒜總皂苷的制備方法，包括以下步驟a、取脫水蒜粉，用體積百分濃度為40%~80%的乙醇^是:取，離心，上清液回收乙醇并適當(dāng)濃縮，得4是取濃縮液；b、將步驟a所得提取濃縮液過大孔樹脂柱，先用蒸餾水洗柱，再用體積百分濃度為40%~80%的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，干燥，即得大蒜總皂苷。進(jìn)一步，所述步驟b是將提取濃縮液先用乙酸乙酯萃取，棄去乙酸乙酯萃取液，再用水飽和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收正丁醇，殘余物用水溶解后過大孔樹脂柱；進(jìn)一步，所述大孔樹脂選自D101型或AB-8型大孔樹脂；進(jìn)一步，所述步驟a使用體積百分濃度為70%的乙醇提取；進(jìn)一步，所述步驟b使用體積百分濃度為70%的乙醇洗脫。本發(fā)明的目的之二在于提供一種大蒜總皂苷，具有總皂苷含量高、耐缺氧活性好等優(yōu)點(diǎn)。為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第二方面，提供了一種大蒜總皂苷，是按照本發(fā)明所述方法制得。本發(fā)明的目的之三在于提供含有所述大蒜總皂苷的藥物組合物。為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第三方面，提供了含有所述大蒜總急苷的藥物組合物，包括但不限于將本發(fā)明的大蒜總皂苷作為藥物活性部位，和藥學(xué)上可接受的載體組成藥物組合物，或者，與其它中藥提取物或化學(xué)合成藥物和藥學(xué)上可接受的載體組成藥物組合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地確定上述藥物組合物的劑型，如片劑、膠嚢劑、丸劑、顆粒劑、口服液、注射劑、外用制劑、速釋和緩釋制劑等，并按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行制備。所得藥物4制劑可以通過任何一種便利可行的途徑施用，如口l良、靜&;K注射、皮下等途徑。優(yōu)選將大蒜總皂普制成各種口服給藥劑型。本發(fā)明的目的之四在于提供所迷大蒜總皂苷的一種應(yīng)用。為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第四方面，提供了所述大蒜總急苷在制備耐缺氧藥物中的應(yīng)用。藥理活性研究結(jié)果顯示本發(fā)明的大蒜總皂苷對常壓缺氧損傷、低壓缺氧損傷、化學(xué)性缺氧損傷和循環(huán)性缺氧損傷等均有顯著的保護(hù)作用，可以制成耐缺氧藥物，用于預(yù)防和治療常壓缺氧性損傷及低壓缺氧性損傷，保護(hù)循環(huán)性缺氧損傷和血液性缺氧損傷，以及減弱組織中毒性缺氧損傷等。本發(fā)明的目的之五在于提供所述大蒜總皂苷的另一種應(yīng)用。為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第五方面，提供了所述大蒜總皂香在制備耐缺氧食品中的應(yīng)用?；诒景l(fā)明的大蒜總皂苷具有增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力的活性研究結(jié)果，本發(fā)明的大蒜總皂苷也可以制成耐缺氧食品，供健康人群預(yù)防保健使用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明公開了一種大蒜總皂苷的制備方法及用該方法制得的大蒜總皂苷，該制備方法具有操作簡單、提取率高、產(chǎn)品質(zhì)量可控、純度高、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)；用該方法制得的大蒜總皂苷，具有顯著的耐缺氧活性，以及安全低毒、原料來源廣泛、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，不僅可以制成各種臨床用藥物制劑，用于預(yù)防和/或治療各種缺氧性損傷疾病，還可以制成耐缺氧食品，供健康人群預(yù)防保健使用。本發(fā)明為急性高原反應(yīng)和高原病的綜合防治提供了一條新途徑，有益于保護(hù)高原部隊(duì)的戰(zhàn)斗力，具有重要的軍用價(jià)值；同時(shí)，為旅游者、深海潛水或作業(yè)者、運(yùn)動(dòng)員、重體力勞動(dòng)者、高考學(xué)生和中老年人群等提供了一種耐缺氧的新方法，具有廣泛的民用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊，可取得良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為大蒜總皂苦對小鼠常壓缺氧的保護(hù)效果；圖2為LM法沖會(huì)測大蒜總皂苷保護(hù)分化型PC12細(xì)胞缺氧損傷的時(shí)間-效應(yīng)曲線；圖3為MTT法檢測大蒜總皂苦保護(hù)分化型PC12細(xì)胞缺氧損傷的時(shí)間-效應(yīng)曲線；圖4為免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測缺氧的分化型PC12細(xì)胞形態(tài)及神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白(Tuj-l)的表達(dá)。具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例l、大蒜總皂苷的制備包括以下步驟a、取脫水蒜粉lkg，加入體積百分濃度為70%的乙醇3L,在充分?jǐn)嚢璧臈l件下浸提72小時(shí)，溫度1(TC離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇并適當(dāng)濃縮，得提取濃縮液；b、將步驟a所得提取濃縮液過D101型大孔樹脂柱，先用8倍以上柱體積的蒸餾水洗柱，再用約5倍柱體積的體積百分濃度為70%的乙醇洗脫(用紫外檢測儀檢測上樣和洗脫曲線，恒流泵控制上樣和洗脫速度)，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，殘余物冷凍干燥，即得大蒜總皂苷7.83g(淡黃色蓬松細(xì)長粉末，氣味甜)，提取率為0.783%(以脫水蒜粉計(jì))。實(shí)施例2、大蒜總皂苷的制備包括以下步驟a、取脫水蒜粉lkg，加入體積百分濃度為70%的乙醇3L,在充分?jǐn)嚢璧臈l件下浸提72小時(shí)，溫度10。C離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇并適當(dāng)濃縮，得才是耳又濃縮液；b、將步驟a所得提取濃縮液用乙酸乙酯萃取，棄去乙酸乙酯萃取液，再用水飽和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液，回收正丁醇，殘余物用水溶解后過D101型大孔樹脂柱，先用8倍以上柱體積的蒸餾水洗柱，再用約5倍柱體積的體積百分濃度為70%的乙醇洗脫(用紫外檢測儀檢測上樣和洗脫曲線，恒流泵控制上樣和洗脫速度)，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，殘余物冷凍干燥，即得大蒜總皂苷1.73g(淡黃色蓬松細(xì)長粉末，氣味甜)，提取率為0.173%(以脫水蒜粉計(jì))。實(shí)施例3、大蒜總皂苷的制備包括以下步驟a、取脫水蒜粉lkg，加入體積百分濃度為40%的乙醇3L，在充分?jǐn)嚢璧臈l件下浸提72小時(shí)，溫度10。C離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇并適當(dāng)濃縮，得才是耳又濃縮液；b、將步驟a所得^是取濃縮液過AB-8型大孔樹脂柱，先用8倍以上柱體積的蒸餾水洗柱，再用約5倍柱體積的體積百分濃度為80%的乙醇洗脫(用紫外檢測儀檢測上樣和洗脫曲線，恒流泵控制上樣和洗脫速度)，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，殘余物冷凍干燥，即得大蒜總皂苷6.21g(淡黃色蓬^^細(xì)長粉末，含甜氣味)，提取率為0.621%(以脫水蒜粉計(jì))。實(shí)施例4、大蒜總皂苷的制備包括以下步驟a、取脫水蒜粉lkg,加入體積百分濃度為80%的乙醇3L,在充分?jǐn)嚢璧臈l件下浸提72小時(shí)，溫度1(TC離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇并適當(dāng)濃縮，得^是耳又濃縮液；7b、將步驟a所得提取濃縮液用乙酸乙酯萃取，棄去乙酸乙酯萃取液，再用水飽和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液，回收正丁醇，殘余物用水溶解后過AB-8型大孔樹脂柱，先用8倍以上柱體積的蒸餾水洗柱，再用約5倍柱體積的體積百分濃度為40%的乙醇洗脫(用紫外檢測儀檢測上樣和洗脫曲線，恒流泵控制上樣和洗脫速度)，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，殘余物冷凍干燥，即得大蒜總皂苷1.13g(淡黃色蓬松細(xì)長粉末，含甜氣味)，提取率為0.113%(以脫水蒜粉計(jì))。大蒜總皂苷的質(zhì)量控制按照本發(fā)明方法制得的大蒜總皂苷已經(jīng)除去大蒜油和S-烯丙半胱氨酸、S-烯丙基巰基-L-半胱氨酸等已知活性物質(zhì)。一、定性養(yǎng)別1、化學(xué)方法將本發(fā)明的大蒜總急芬進(jìn)行發(fā)泡試-險(xiǎn)、Libermann反應(yīng)、Libermann-Burchard反應(yīng)和Salkowashis反應(yīng)，結(jié)果均呈陽性，表明本發(fā)明的大蒜總皂苷含有皂苷類化合物。2、薄層色譜法將本發(fā)明的大蒜總皂苷制成濃度為2mg/mL的水溶液進(jìn)行薄層色譜法鑒定，以氯仿-曱醇-水(10:7:2)于溫度4。C靜置分層后的下層液體為展開劑，以碘蒸氣(鑒定有機(jī)物)或香蘭素-硫酸(鑒定皂苷類化合物)為顯色劑。結(jié)果見表l，由表1可知，本發(fā)明的大蒜總皂苦含有皂苷類化合物，且實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷比實(shí)施例1制得的大蒜總皂苷純度更高。表l薄層色譜鑒定結(jié)果樣品碘顯色斑點(diǎn)(個(gè))香蘭素4充酸顯色斑點(diǎn)(個(gè))實(shí)施例1149實(shí)施例211108二、定量測定因目前大蒜皂苷類化合物無對照品銷售，故本發(fā)明人以人參皂苷Re為對照品，采用香草醛-高氯酸比色法建立了大蒜總皂苷的含量測定方法，便于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法準(zhǔn)確可靠，平均加樣回收率為98.0%USD2.35%)，重復(fù)性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。經(jīng)該方法檢測，在本發(fā)明的大蒜總皂苷中，皂苷含量以人參皂苷Re計(jì)不低于20。/。。部分批次樣品的皂苷含量測定結(jié)果見表2。表2部分批次樣品的皂苷含量測定結(jié)果(以人參皂苷Re計(jì))__急苷含量(°/。)_RSD(%,/=8)20070926(實(shí)施例1方法)26.430.1520071118(實(shí)施例1方法)29.640.1320071210(實(shí)施例2方法)42.900.1220071219(實(shí)施例2方法)44.100.10大蒜總皂苷的耐缺氧活性鑒定1、大蒜總皂苷對常壓缺氧的影響將體重18~20g的SPF級BABL/C雄性小鼠(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)隨機(jī)分組，樣品組l、2、3、4分別灌胃實(shí)施例1制得的大蒜總皂苷50、100、200、400rag/kg(體重)，樣品組5、6、7、8分別灌胃實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷25、50、100、200mg/kg，對照組1、2分別灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)8天，末次灌胃2小時(shí)后，將各小鼠分別置125mL廣口瓶中，立即蓋上瓶蓋并用凡士林封口，記錄小鼠存活時(shí)間，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)存活時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)存活時(shí)間=存活時(shí)間/(容積-小鼠體重/體積系數(shù))x100。結(jié)果見表3、表4和圖1，由表3可知，實(shí)施例1制得的大蒜總皂苷當(dāng)劑量為100mg/kg時(shí)，小鼠的標(biāo)準(zhǔn)存活時(shí)間與對照組比較有顯著性差異，且隨著大蒜總皂苷劑量的增大，與對照組的差異更加明顯；由表4和圖1可知，實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷當(dāng)劑量為50mg/kg時(shí)，小鼠的標(biāo)準(zhǔn)存活時(shí)間即與對照組差異顯著；表明本發(fā)明的大蒜總皂苷可以顯著提高BABL/C小鼠對常壓缺氧的耐受性，還提示實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷比實(shí)施例1制得的大蒜總皂苷純度更高，耐缺氧效果更好。表3實(shí)施例1制得的大蒜總皂苷對小鼠常壓缺氧的影響組別小鼠(只)劑量(mg/kg)灌胃體積(mL/kg)標(biāo)準(zhǔn)存活時(shí)間(min,x±sd)對照組17/1014.9±1.2樣品組17501015.2±2.0樣品組271001018.9±2.5*樣品組372001019.7±2.6*樣品組474001020.8±3.0#*與對照組1比較，p復(fù)05;并與對照組1比較，p<0.01。表4實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷對小鼠常壓缺氧的影響組別小鼠(只)劑量(mg/kg)灌胃體積(mL/kg)標(biāo)準(zhǔn)存活時(shí)間(min，x±sd)對照組27/1014.3±0.9樣品組57251014.6±1.2樣品組67501018.0±2.6*樣品組771001019.3±2.7#樣品組872001020.0±1.4#*與對照組2比較,p<0,05;#與對照組2比較，p<0.01。2、大蒜總皂苷對低壓缺氧的影響將體重18~20g的SPF級BABL/C雄性小鼠隨機(jī)分組，樣品組灌胃實(shí)施例1制得的大蒜總皂香200mg/kg(體積10mL/kg)，平原對照組和缺氧對照組分別灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)8天，末次灌胃1小時(shí)后，平原對照組小鼠在常規(guī)條件下飼養(yǎng)，樣品組和缺氧對照組小鼠置低壓氧倉中在模擬海拔高度7700米減壓7小時(shí)，減壓完畢后立即斷頸處死各組小鼠，取其大腦、心肌和肝臟組織置液氮中保存；將凍存組織解凍后勻漿，分別采用總抗氧化能力(T-AOC)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒(購自南京建成生物工程研究所)測定各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)。結(jié)果見表5,由表5可知，樣品組大腦、心M^和肝臟組織的T-A0C均較缺氧對照組提高，肝臟的MDA含量較缺氧對照組減少而SOD含量較缺氧對照組顯著增加，大腦的CAT含量顯著高于平原對照組和缺氧對照組，表明本發(fā)明的大蒜總皂苷可以明顯提高急性低壓缺氧BABL/C小鼠的抗氧化應(yīng)激能力，從而對低壓缺氧損傷起到保護(hù)作用。表5大蒜總皂普對低壓缺氧小鼠抗氣化應(yīng)激能力的影響(；±sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*與缺氧對照組比較，p<0.05;"與缺氧對照組比較，p<0.01;#與平原對照組比較，p<0.05;##與平原對照組比較，p<0.01。3、大蒜總皂苷對化學(xué)性缺氧的影響將體重18~20g的SPF級BABL/C雄性小鼠隨機(jī)分組，樣品組灌胃實(shí)施例1制得的大蒜總皂苷200mg/kg,對照組灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)8天，末次灌胃2小時(shí)后，各組小鼠腹腔注射質(zhì)量百分濃度為2%的亞硝酸鈉溶液240mg/kg，記錄小鼠存活時(shí)間。結(jié)果見表6，由表6可知，本發(fā)明的大蒜總皂香可以明顯提高BABL/C小鼠中毒性缺氧后的存活時(shí)間。表6大蒜總急芬對小鼠化學(xué)性缺氧的影響小鼠劑量灌胃體積存活時(shí)間組別(只)(mg/kg)(mL/kg)(min,x±sd)對照組9/1015.4±8.1樣品組92001025.7±5.3**與對照組比較，p<0,05。4、大蒜總皂苷對循環(huán)性缺氧的影響將體重18~20g的SPF級BABL/C雄性小鼠隨機(jī)分組，樣品組灌胃實(shí)施例1制得的大蒜總皂苷200mg/kg，對照組灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)8天,末次灌胃2小時(shí)后，快速剪斷小鼠頭部，記錄小鼠斷頭后張口呼吸時(shí)間。結(jié)果見表7，由表7可知，本發(fā)明的大蒜總皂苦可以延長BABL/C小鼠斷頭缺氧試驗(yàn)的張口呼吸時(shí)間，可以增加腦對氧的利用率。表7大蒜總兔苷對小鼠循環(huán)性缺氧的影響組別小鼠劑量灌胃體積張口呼吸時(shí)間(只)(mg/icg)(mL/kg)(min,x±sd)對照組9/1016.25±1.75樣品組92001018.63±1.41**與對照組比較，p<0.05。5、體外鑒定大蒜總皂苷的耐缺氧活性(1)乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(LDH)用濃度為50ng/^L的神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)(CRL-1721，購自ATCC公司)分化7~9天；將分化型PC12細(xì)胞先用含有實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷和低血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時(shí)，再用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基在氧氣濃度為20mL/L的條件下缺氧培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置陰性對照(培養(yǎng)基中未加入實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷)和陽性對照(培養(yǎng)基中加入濃度為50ng/mL的NGF);釆用LDH試劑盒(購自Roche公司)分別于缺氧0、24、48和72小時(shí)測定培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)的LDH，計(jì)算LDH釋放率(％)并繪制時(shí)間-效應(yīng)曲線。結(jié)果見表8和圖2,由表8可知，本發(fā)明的大蒜總皂苷可以顯著減少缺氧條件下分化型PC12細(xì)胞的LDH釋放率，且劑量與效應(yīng)呈正相關(guān)；由圖2可知，本發(fā)明的大蒜總皂苷對PC12細(xì)胞的缺氧保護(hù)作用具有時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。表8LDH實(shí)驗(yàn)測定大蒜總皂苷對PC12細(xì)胞的缺氧^f呆護(hù)作用(缺氧48小時(shí))__濃度(ng/mL)_LDH釋放率(0/0,5±sd)陽性對照組/65.8±3.6樣品組10.157.0±2.0*樣品組21.050.5±6.0*#樣品組310.045.3±1.7*&*與陽性對照組比較，p<0.01;#與樣品組1比較，p<0.05;&與樣品組2比較，p<0.05。(2)細(xì)胞增殖活性實(shí)'險(xiǎn)(MTT)分化型PC12細(xì)胞的制備、樣品(實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷)預(yù)處理方法和缺氧培養(yǎng)方法，以及對照組的設(shè)置均與LDH實(shí)驗(yàn)相同，分別于缺氧0、24、48和72小時(shí)，小心吸凈96孔板中的培養(yǎng)上清，每孔加入MTT10jiL,培養(yǎng)3.5小時(shí)，再加入二甲亞石風(fēng)150^L，振蕩10分鐘，最后在波長490nm處測定0D值(以630nm為參考波長)，并計(jì)算活細(xì)胞提高率(％):活細(xì)胞提高率(％)=(樣品組0D值-陰性對照組0D值)/陰性對照組0D值x100。結(jié)果見表9和圖3，由表9可知，本發(fā)明的大蒜總皂苷可以顯著增加缺氧條件下分化型PC12細(xì)胞的存活率，且劑量與效應(yīng)呈正相關(guān)；由圖3可知，本發(fā)明的大蒜總皂苷對PC12細(xì)胞的缺氧保護(hù)作用具有時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。表9MTT實(shí)驗(yàn)測定大蒜總皂苷對PC12細(xì)胞的缺氧保護(hù)作用(缺氧48小時(shí))組別濃度(ng/mL)活細(xì)胞提高率(％,S土sd)樣品組10.121.3±7*樣品組21.026.8士9*樣品組310.030.4±6**與其它樣品組比較，p<0.05。(3)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測分化型PC12細(xì)胞的制備、樣品(實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷)預(yù)處理方法和缺氧培養(yǎng)方法，以及陰性對照組的設(shè)置均與LDH實(shí)驗(yàn)相同，取缺氧24小時(shí)的分化型PC12細(xì)胞，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞形態(tài)以及Tuj-l蛋白的表達(dá)。結(jié)果見圖4,其中，A為陰性對照組，B為大蒜總皂苷組，a為異^fu氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的軸突成束和延伸蛋白-1(FEZ-1)(綠色熒光)，b為四曱基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標(biāo)記的Tuj-1(紅色熒光)，c為4、6-二脒基-2-苯基吲咪(DAPI)標(biāo)記的細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)，d為a、b、c的合并；由圖4可知，本發(fā)明的大蒜總皂苷可以使缺氧并剝奪了NGF的分化型PC12細(xì)胞繼續(xù)分化，擁有較多和較長的突起；可以使神經(jīng)元標(biāo)志蛋白Tuj-l表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)了耐缺氧活性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的大蒜總皂苷具有顯著的耐缺氧活性，可以作為藥物活性部位，單獨(dú)使用，或者和藥學(xué)上可接受的載體組成藥物組合物，或者與其它中藥提取物和/或化學(xué)合成藥物和藥學(xué)上可接受的載體組成藥物組合物，并按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制成各種臨床用耐缺氧藥物；還可以用于制備耐缺氧食品，作為膳食補(bǔ)充劑。實(shí)施例5、大蒜總皂香片的制備取實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷100g，與淀粉100g和糊精100g混勻，加入體積百分濃度為30%的乙醇制成軟材，過14目篩制成濕顆粒，溫度5(TC干燥，干顆粒過12目篩整粒，再加入硬脂酸鎂混勻，壓片，即得大蒜總皂苷片，共制成1000片，每片含大蒜總皂苷100mg。實(shí)施例6、大蒜總皂苷膠嚢的制備取實(shí)施例2制得的大蒜總皂苦150mg,直接裝入1粒膠嚢中，即得大蒜總皂苷膠囊，每粒含大蒜總皂苷150mg。實(shí)施例7、大蒜總皂苷注射液的制備取實(shí)施例2制得的大蒜總皂苷50g，用質(zhì)量百分濃度為10%的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0~7.5,過濾，加入氯化鈉80g，再加入注射用水定容至總體積為1000mL,過濾，分裝，灌封，滅菌，即得大蒜總皂苷注射液，濃度為50mg/mL。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1、一種大蒜總皂苷的制備方法，其特征在于包括以下步驟a、取脫水蒜粉，用體積百分濃度為40％～80％的乙醇提取，離心，上清液回收乙醇并適當(dāng)濃縮，得提取濃縮液；b、將步驟a所得提取濃縮液過大孔樹脂柱，先用蒸餾水洗柱，再用體積百分濃度為40％～80％的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，干燥，即得大蒜總皂苷。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的大蒜總急普的制備方法，其特征在于所述步驟b是將提取濃縮液先用乙酸乙酯萃取，棄去乙酸乙酯萃取液，再用水飽和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收正丁醇，殘余物用水溶解后過大孔樹脂柱。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大蒜總皂苷的制備方法，其特征在于所述大孔樹脂選自D1G1型或AB-8型大孔樹脂。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大蒜總急苷的制備方法，其特征在于所述步驟a使用體積百分濃度為70%的乙醇提取。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大蒜總皂苷的制備方法，其特征在于所述步驟b使用體積百分濃度為70%的乙醇洗脫。6、按照權(quán)利要求1所述的制備方法制得的大蒜總皂芬。7、含有權(quán)利要求6所述的大蒜總皂苷的藥物組合物。8、權(quán)利要求6所述的大蒜總皂苷在制備耐缺氧藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求6所述的大蒜總皂苷在制備耐缺氧食品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種大蒜總皂苷的制備方法和用該方法制得的產(chǎn)品，以及大蒜總皂苷在制備耐缺氧藥物或食品中的應(yīng)用；將脫水蒜粉用體積百分濃度為40％～80％的乙醇提取，提取液濃縮后過大孔樹脂柱，收集體積百分濃度為40％～80％的乙醇洗脫液，回收溶劑，干燥，即得大蒜總皂苷；該制備方法具有操作簡單、提取率高、產(chǎn)品質(zhì)量可控、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)；用該方法制得的大蒜總皂苷具有顯著的耐缺氧活性，并且安全低毒、原料來源廣泛、成本低廉，可以制成耐缺氧藥物或食品，應(yīng)用前景廣闊。文檔編號A61K36/88GK101474383SQ20091010313公開日2009年7月8日申請日期2009年1月23日優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日發(fā)明者紅羅,高鈺琪申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)