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SPKP?XIII在制備Kv2.1通道抑制劑的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11258908閱讀:359來源:國知局
SPKP?XIII在制備Kv2.1通道抑制劑的應(yīng)用的制造方法與工藝

本發(fā)明涉及一種活性多肽在離子通道工具試劑中的用途,尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xiii(簡寫為spkp-xiii)在制備電壓門控鉀通道工具試劑-kv2.1型鉀通道抑制劑中的用途。



背景技術(shù):

電壓門控鉀通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中,是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白,其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鉀通道在動作電位的產(chǎn)生和傳播過程中的關(guān)鍵性作用,電壓門控鉀通道成為很多動植物毒素的作用靶標(biāo)。鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國際上的研究熱點。電壓門控鉀通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點。自然界的動物毒素是一類具有很高實用價值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì),不僅是有毒動物抵御天敵的有力武器,也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時也是研究離子通道的獨特“分子探針和解密器”。迄今為止,從多種動物(如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動物等)的毒液中鑒定到了很多作用于鉀通道的活性成分。它們通過與鉀通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化,如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鉀通道的分子機(jī)制,除了在理論上可深入推測鉀通道亞型之間的功能活動區(qū)別和門控活動機(jī)制外,還可以為將它們開發(fā)成治療人類相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xiii在制備電壓門控鉀通道工具試劑-kv2.1型鉀通道抑制劑的應(yīng)用,所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xiii(簡寫為spkp-xiii),其氨基酸序列為:

nh2-glucysargtrpleupheglyglycysglulysaspalaseraspcyscysgluhisleuglycysargargalalysprosertrpcysglytrpaspphethrphe-nh2,

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xiii作為單一有效活性組份用于制備kv2.1型鉀通道抑制劑。

所述的蜘蛛抑鉀肽-xiii的n端第2位半胱氨酸和第17位半胱氨酸之間,n端第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸之間,n端第16位半胱氨酸和第30位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鉀肽-xiii作為單一有效活性組分用于制備kv2.1型鉀通道抑制劑,以細(xì)胞外給藥的方式制備成kv2.1型鉀通道工具試劑。

蜘蛛抑鉀肽-xiii在制備kv2.1型鉀通道工具試劑或抑制劑時,配制細(xì)胞外給藥的劑量為5μmol/l。

蜘蛛抑鉀肽-xiii抑制kv2.1型鉀通道的作用呈現(xiàn)濃度依從性。

蜘蛛抑鉀肽-xiii對kv2.1型鉀通道的抑制呈現(xiàn)時間依從性,是一種較好的kv2.1型鉀通道工具試劑。

附圖說明

圖1是spkp-xiii對kv2.1鉀通道亞型的影響.

圖2是spkp-xiii作用于kv2.1型鉀通道的濃度-效應(yīng)關(guān)系曲線。

圖3是spkp-xiii作用于kv2.1型鉀通道的時間-效應(yīng)關(guān)系曲線。

具體實施方式

為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明,下面將通過細(xì)胞外給藥途徑,采用非洲爪蟾卵母細(xì)胞模型來說明蜘蛛抑鉀肽-xiii的kv2.1型鉀通道抑制作用。

1、實驗材料和方法

1.1通道質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取

采用promega公司的質(zhì)粒提取試劑盒(wizard?plussvminiprepsdnapurificationsystem)。

溶液的配方如下:

細(xì)胞重懸液細(xì)胞裂解液

tris-hcl(ph7.5)50mmnaoh0.2m

edta10mm1%sds

rnasea100μg/ml

中和液洗脫液

鹽酸胍4.09m乙酸鉀60mm

乙酸鉀0.759mtris-hcl(ph7.5)8.3mm

冰醋酸2.12medta0.04mm

ph為4.2加入95%乙醇,終濃度為60%乙醇

操作步驟:

?收集菌液(4℃,12000r/min,離心1min)

?棄上清,用濾紙吸干殘留在管壁的溶液,加入250μl細(xì)胞重懸液,充分混勻

?加入250μl細(xì)胞裂解液,溫和上下顛倒4次混勻,放置5min

?加入350μl中和液,溫和顛倒4次混勻

?12000r/min離心10min

?吸上清至離心柱中,12000r/min離心1min,棄下清

?往離心柱中加入750μl洗脫液,靜置2min,12000r/min離心

1min,棄下清

?重復(fù)第七步,加入250μl洗脫液,12000r/min離心1min棄下

?離心柱風(fēng)干后轉(zhuǎn)移到干凈滅菌的1.5mlep管上,加入50μl去

核酸酶水

?10000r/min離心30s,所得的質(zhì)粒dna可進(jìn)行實驗或-20℃保

1.2電壓鉗實驗活性檢測

取成年雌性非洲爪蟾,放入碎冰內(nèi)麻醉約30min?;蛘咴谧钢車芤海s400ml)中加入0.5g麻醉劑(3-氨基苯酸乙烷基酯),爪蟾1hr后會處于麻醉狀態(tài)。將處于麻醉狀態(tài)的爪蟾放在冰上,腹部朝上,用鑷子和手術(shù)刀在其腹部劃開一長約1.0~1.5cm的口,拉出子宮瓣,剪取2-3葉放入無鈣nd96溶液中。將子宮放回腹部,分層縫合傷口后,將爪蟾放在冰上恢復(fù),待其蘇醒后放回池中。將取出的卵葉用系線鑷初步分散成10-20個細(xì)胞一團(tuán)。然后轉(zhuǎn)入50ml離心管中,加入含有膠原酶的無鈣nd96溶液,膠原酶終濃度為1mg/ml。在25℃,60rpm下酶解大約50min,直至80%以上的細(xì)胞已經(jīng)去除濾泡膜及微血管后則可停止酶解。酶解完畢,用無鈣的nd96多次洗滌細(xì)胞,洗去殘留的膠原酶。然后,挑選個體比較大、動植物極分明的細(xì)胞轉(zhuǎn)入or2溶液在18℃培養(yǎng)。溶液配方:nd96(inmm):nacl96、kcl2、cacl2-2h2o1.8、mgcl2-6h2o1、hepes-naoh5。用naoh調(diào)ph至7.5。or2(inmm):nacl82.5、kcl2.5、cacl2-2h2o1、mgcl2-6h2o1、na2hpo4-12h2o1、hepes5。用naoh調(diào)ph至7.5。使用前加入青霉素(10萬單位/l)。

電壓鉗實驗:通過顯微注射系統(tǒng)(wpi,german)將mrna注入挑選好的卵母細(xì)胞,每次注射體積約為20-50nl,從黑色的動物極一側(cè)注入。之后,放入18℃低溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~4天,每天更換一次新鮮的or2培養(yǎng)液。雙電極桿電壓鉗記錄在室溫(18~22℃)下進(jìn)行。玻璃電極經(jīng)一步拉制而成,灌注3mkcl后電阻為0.5-1.5mω。將細(xì)胞放入細(xì)胞槽中,用or2溶液灌流。然后將兩個玻璃電極分別插入細(xì)胞。將細(xì)胞鉗制在-80mv,給予去極化脈沖刺激。所用放大器為turbotec-03x(npielectronic,germany)。數(shù)據(jù)采集濾波為2khz。參比電極用ag/agcl電極與浴槽相連。刺激脈沖控制和電流信號記錄采用cellworks數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(npi公司,germany)。線性漏電流和電容電流不予刪除。數(shù)據(jù)分析采用sigmaplot軟件進(jìn)行。所有毒素直接用or2溶液溶解并配制成目的濃度。

2、實驗結(jié)果與分析

2.1spkp-xiii對kv2.1型電壓門控鉀通道的影響

我們檢測了spkp-xiii對表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞上的鉀通道kv2.1通道的作用。瞬時外向鉀通道kv2.1電流以去極化方式誘導(dǎo):將細(xì)胞膜電位鉗制在-90mv,以200ms的時程給予一測試電壓+20mv,每隔5s重復(fù)一次。實驗結(jié)果表明,1μmspkp-xiii能抑制80%的kv2.1通道電流(如圖1)。spkp-xiii對kv2.1電流的抑制效應(yīng)具有濃度依從性,濃度依從性抑制效應(yīng)見圖2,經(jīng)過hill方程擬合后,得到spkp-xiii抑制kv2.1通道的半數(shù)有效抑制濃度ic50值為470nm。spkp-xiii對kv2.1電流的抑制具有時間依從性,在測試電壓+20mv下,加入3μmspkp-xiii能夠快速抑制kv2.1電流,抑制時間常數(shù)為60s,這種抑制完全可逆,毒素洗脫以后電流恢復(fù)的時間常數(shù)為92s(見圖3)。

sequencelisting

<110>長沙沁才生物科技有限公司

<120>蜘蛛抑鉀肽-xiii

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<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>33

<212>prt

<213>廣西纓毛蛛

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glucysargtrpleupheglyglycysglulysaspalaserasp

151015

cyscysgluhisleuglycysargargalalysprosertrpcys

16202530

glytrpaspphethrphe

3135

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