本發(fā)明具體涉及一種基于果寡糖修飾的抗凍糖肽的制備方法及應(yīng)用，屬于生物、食品加工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗凍蛋白，俗稱冰結(jié)構(gòu)蛋白，又叫作熱滯蛋白，首先于1969年由devries在南極海峽的一種極地魚（trematomusborchgrevinki）的血液中發(fā)現(xiàn)?？箖龅鞍拙哂械蜏乇Ｗo(hù)活性，可以作為冷凍保護(hù)劑應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物及食品加工等領(lǐng)。如抗凍蛋白應(yīng)用于組織、細(xì)胞及微生物的低溫保存，可以顯著提高其冷凍存活率；抗凍蛋白能減少冷凍食品在低溫凍藏過程形成的冰晶及其重結(jié)晶對(duì)食品造成的品質(zhì)劣變，提高冷凍食品的穩(wěn)定性。
抗凍蛋白的抗凍活性主要來源于抗凍蛋白中的某些活性片段，并不是整個(gè)蛋白在起作用。汪少蕓等人通過酶解技術(shù)從牛皮、豬皮及魚皮等不同來源的膠原蛋白中酶解、分離出具有高抗凍活性的多肽片段。
近年來有研究發(fā)現(xiàn)重結(jié)晶抑制活性對(duì)于抗凍蛋白發(fā)揮冷凍保護(hù)作用起到了至關(guān)重要的作用，然而抗凍蛋白的熱滯活性和冰結(jié)合特性對(duì)于當(dāng)凍藏溫度低于熱滯活性溫度區(qū)間的生物材料（如細(xì)胞、血液、組織）反而起到破壞甚至致死作用，主要因?yàn)楫?dāng)凍藏溫度低于熱滯活性溫度范圍時(shí)，冰晶生長不受控制而快速轉(zhuǎn)變成針狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和解凍后細(xì)胞存活率的下降。這也是阻礙天然抗凍蛋白（或肽）作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用的主要因素。因此，近年來國際研究開始致力于開發(fā)一些具有重結(jié)晶抑制活性而沒有熱滯活性的新型抗凍蛋白，基于糖基化修飾的抗凍蛋白就是這類活性物質(zhì)的一種。例如一個(gè)由4個(gè)ser-gly-gly三肽重復(fù)的肽鏈為骨架并通過ser殘基的碳端連接一個(gè)半乳糖苷基形成的抗凍肽就發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的重結(jié)晶抑制活性而沒有熱滯活性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)糖基種類和肽鏈骨架中糖基化位置及氨基酸殘基類型對(duì)重結(jié)晶抑制活性有著顯著的影響作用，如半乳糖基修飾的抗凍肽重結(jié)晶抑制活性比甘露糖基修飾的抗凍肽強(qiáng)，而脯氨酸由于具有限制的旋轉(zhuǎn)角可使蛋白在溶液中具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此一些含脯氨酸的具有較強(qiáng)的重結(jié)晶抑制活性。
果寡糖是一種價(jià)格廉價(jià)的混合物，由果糖和低聚合度的低聚寡糖組成，而且它被列為具有特殊功能營養(yǎng)和特定功能的食品。在營養(yǎng)方面，它們是膳食纖維的來源，低能量，適合糖尿病患者，無致癌作用，而且是刺激雙歧桿菌生長的益菌素。果寡糖也能通過改善穩(wěn)定性、質(zhì)地、口感、味道等增加食物的功能性，同時(shí)也可以取代糖和脂肪。一種成功的抗凍多肽-果寡糖共聚物可能擁有更加良好的功能性質(zhì)。
因此，本發(fā)明將不同來源的抗凍多肽與果寡糖通過糖基化修飾手段，化學(xué)合成抗凍糖肽。所合成的抗凍糖肽的抗凍活性顯著高于原始抗凍多肽，可以廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存；并且該方法安全、易于控制，可以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種基于果寡糖修飾的抗凍糖肽的制備方法及應(yīng)用。添加本發(fā)明抗凍糖肽的細(xì)胞、組織、器官、微生物的冷凍存活率均顯著提高；將本發(fā)明應(yīng)用到冷凍保藏食品中，可以很好地保持冷凍食品原有品質(zhì)的穩(wěn)定性，顯著降低冷凍損傷引起的食品品質(zhì)劣變。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種基于果寡糖修飾的抗凍糖肽的制備方法，按照如下方法制備：將抗凍多肽粉和果寡糖之間按照質(zhì)量比為1:1~1:5的比例溶解于磷酸鹽緩沖液中，溶液最終濃度為5~15%（w/v），攪拌使其充分溶解；然后在60~80℃、ph為8.0~9.0條件下反應(yīng)1~2h；反應(yīng)結(jié)束后，立即放在0℃的水中冷卻以終止反應(yīng)，反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，得到所述的果寡糖修飾的抗凍糖肽凍干粉。
所述的抗凍多肽粉的原料來源于豬皮、牛皮、魚皮或魚鱗。
所述的磷酸鹽緩沖液的ph為7.6~8.0，其中kh2po4為2.6mm，k2po4為32.5mm。
所述的攪拌時(shí)間為10~20min；所述冷卻時(shí)間為15~30min。
如上所述的制備方法制得的抗凍糖肽的用途，所述的抗凍糖肽用于細(xì)胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存。
本發(fā)明所提供的技術(shù)方案具有如下優(yōu)勢(shì)：
（1）本發(fā)明所用的抗凍多肽原料來源于食品源下腳料，具有安全無毒、來源廣泛，價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)；
（2）本發(fā)明提供的抗凍糖肽合成方法高效、安全、成本低，易于控制；
（3）本發(fā)明合成的抗凍糖肽應(yīng)用廣泛，可應(yīng)用于細(xì)胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存；并且與抗凍多肽相比，其抗凍活性顯著提高；
（4）本發(fā)明中的果寡糖是一種具有特殊功能營養(yǎng)和特定功能的食品，能通過改善穩(wěn)定性、質(zhì)地、口感、味道等，增加食物的功能性，同時(shí)也可以取代糖和脂肪。適合糖尿病患者，而且是刺激雙歧桿菌生長的益菌素。
具體實(shí)施措施
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不僅僅限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1
一種基于果寡糖修飾的抗凍糖肽的制備，按照如下方法進(jìn)行：
（1）按照抗凍多肽粉（來源于豬皮）和果寡糖之間質(zhì)量比為1:2.7的比例將抗凍多肽粉和果寡糖混合，然后溶解于ph7.6的磷酸鹽緩沖液（2.6mmkh2po4，32.5mmk2po4）中，溶液最終濃度為10%（w/v），攪拌15min使其充分溶解；
（2）溶解后的抗凍多肽與果寡糖混合液在77℃、ph為8.74條件下反應(yīng)67min；反應(yīng)結(jié)束后，立即放在冰水（0℃）中冷卻20min，終止反應(yīng)，反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，得到抗凍糖肽凍干粉。
實(shí)施例2
一種基于果寡糖修飾的抗凍糖肽的制備，按照如下方法進(jìn)行：
（1）按照抗凍多肽粉（來源于牛皮）和果寡糖之間質(zhì)量比為1:1的比例將抗凍多肽粉和果寡糖混合，然后溶解于ph7.8的磷酸鹽緩沖液（2.6mmkh2po4，32.5mmk2po4）中，溶液最終濃度為5%（w/v），攪拌10min使其充分溶解；
（2）溶解后的抗凍多肽與果寡糖混合液在60℃、ph為8.0條件下反應(yīng)60min；反應(yīng)結(jié)束后，立即放在冰水（0℃）中冷卻15min，終止反應(yīng)，反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，得到抗凍糖肽凍干粉。
實(shí)施例3
一種基于果寡糖修飾的抗凍糖肽的制備，按照如下方法進(jìn)行：
（1）按照抗凍多肽粉（來源于魚皮）和果寡糖之間質(zhì)量比為1:5的比例將抗凍多肽粉和果寡糖混合，然后溶解于ph8.0的磷酸鹽緩沖液（2.6mmkh2po4，32.5mmk2po4）中，溶液最終濃度為15%（w/v），攪拌20min使其充分溶解；
（2）溶解后的抗凍多肽與果寡糖混合液在80℃、ph為9.0條件下反應(yīng)120min；反應(yīng)結(jié)束后，立即放在冰水（0℃）中冷卻30min，終止反應(yīng)，反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，得到抗凍糖肽凍干粉。
應(yīng)用例1本發(fā)明抗凍糖肽在微生物冷凍保存中的應(yīng)用
按照如下方法進(jìn)行：
試驗(yàn)處理：a.空白對(duì)照（去離子水），b.果寡糖，c.未進(jìn)行糖基化修飾的抗凍多肽，d.實(shí)施例1制備的抗凍糖肽。
試驗(yàn)方法：
（1）制備種子液：取保存的嗜熱鏈球菌在m17液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，37℃，180r/min培養(yǎng)一夜，od值約為1.3。
（2）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)菌液：取50μl的種子液在盛有4mlm17液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)4h，此時(shí)菌液的od值約為1.2。
（3）將實(shí)驗(yàn)菌液用滅菌去離子水稀釋100倍，取100μl的稀釋菌液轉(zhuǎn)移到2ml的塑料冷凍管中，與900μl的抗凍保護(hù)劑混合，渦旋混合器混勻。
（4）取樣品混合液50μl在4ml的m17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7h，檢測(cè)600nm處的od值。取完后的樣品放入-24℃冷凍處理24h后，37℃水浴解凍10min，再次取50μl接種培養(yǎng)測(cè)定7h的od值。
此條件下的od值與乳酸菌的相對(duì)含量符合如下關(guān)系式：
y=0.2152ln(x)+0.0594，r2=0.9972(2-1)
式中y為樣品中活菌的相對(duì)含量，x為7h培養(yǎng)菌液的od值。計(jì)算出冷凍前后樣品中菌的相對(duì)含量c0和c后，菌的存活率用公式（2-2）計(jì)算：
c0，冷凍前樣品中菌的相對(duì)含量（%）；c，冷凍24小時(shí)后樣品中菌的相對(duì)含量（%）。計(jì)算冷凍處理樣品的菌存活率，來檢測(cè)添加劑的抗凍活性。
結(jié)果見表1，果寡糖（處理b）和抗凍多肽（處理c）對(duì)嗜熱鏈球菌均有一定的抗凍保護(hù)效果，本發(fā)明基于果寡糖修飾的抗凍糖肽修飾物（處理d）的冷凍存活率高達(dá)95.7%，顯著高于單一的果寡糖（51.2%）和抗凍多肽（66.5%）。說明本發(fā)明的基于果寡糖修飾的抗凍糖肽具有很好的抗凍功能，對(duì)微生物的冷凍保藏具有很好的低溫保護(hù)作用。
表1本發(fā)明抗凍糖肽對(duì)對(duì)微生物冷凍保護(hù)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果
應(yīng)用例2本發(fā)明抗凍糖肽在豬卵母細(xì)胞冷凍保存中的應(yīng)用
豬卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑基本配方，每100份中含：葡萄糖3份、檸檬酸鈉1份、青霉素8萬單位。
試驗(yàn)處理：在實(shí)施實(shí)例4中的豬卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑基本配方上，分別添加去離子水、果寡糖、抗凍多肽、實(shí)施例1制備的抗凍糖肽，將其相應(yīng)命名為保護(hù)劑a、b、c、d，以保護(hù)劑a為對(duì)照組。
試驗(yàn)方法：
（1）裝管：從廢棄的豬卵巢中獲取卵母細(xì)胞，洗凈，移入裝有冷凍保護(hù)劑的凍存管中平衡15min。
（2）凍存：將平衡后裝有卵母細(xì)胞的凍存管放入冷凍降溫盒中（降溫速率2℃/min），降溫至-80℃后放入液氮罐中保存。
（3）結(jié)果鑒定：解凍后進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)算存活率，結(jié)果見表2。
表2本發(fā)明抗凍糖肽對(duì)卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果
從表2可以看出，本發(fā)明的基于果寡糖修飾的抗凍糖肽具有很好的抗凍功能，對(duì)卵母細(xì)胞的超低溫保藏具有很好的保護(hù)作用。
應(yīng)用例3本發(fā)明抗凍糖肽在冷凍土豆面團(tuán)制品中的應(yīng)用
一種耐低溫冷藏的冷凍土豆面團(tuán)所用的原料及配方如下：中筋面粉100份、新鮮土豆120份、高活性干酵母2份、實(shí)施例1制備的抗凍糖肽4份、蒸餾水80份。
試驗(yàn)方法：
(1)土豆泥制備：將新鮮土豆洗凈瀝干，按比例稱取瀝干的土豆，放入高溫蒸汽鍋中蒸煮30min,去皮，放入組織搗碎機(jī)中搗成土豆泥，冷卻至室溫備用；
(2)酵母活化：稱取所需干酵母粉于37℃蒸餾水中活化20min；
(3)面團(tuán)調(diào)制：將實(shí)施例1制備的抗凍糖肽按所需比例添加到活化處理后的酵母液中溶解，再將土豆泥及面粉一同倒入和面機(jī)中充分?jǐn)嚢?，揉面至面團(tuán)表面光滑不黏手；
(4)分割：將揉好的面團(tuán)分割成劑量為20g左右的面團(tuán)坯子；
(5)整形：將面團(tuán)坯子搓圓用保鮮膜包裹；
(6)速凍：將包裹好的面團(tuán)坯子置于-80℃冰箱速凍60min；
(7)凍藏：將速凍后的面團(tuán)坯置于-20℃冰箱中凍藏；
(8)解凍：將冷凍面團(tuán)置于溫度為35℃，相對(duì)濕度為85%的恒溫箱中解凍30min；
(9)一次發(fā)酵：解凍好的面團(tuán)置于溫度為37℃，相對(duì)濕度為85%的恒溫箱中發(fā)酵100min；
(10)揉面：將一次發(fā)酵好的面團(tuán)用壓面機(jī)壓10遍；
(11)整形：將壓好的面整成所需的饅頭形狀；
(12)二次發(fā)酵：整好型后的面團(tuán)置于溫度為37℃，相對(duì)濕度為85%的恒溫箱中醒發(fā)30min；
(13)蒸制：將發(fā)酵好的饅頭坯子置于蒸籠中大火蒸煮30min；等待5min后開鍋取出。
添加本發(fā)明抗凍糖肽的冷凍面團(tuán)制作饅頭所需醒發(fā)時(shí)間短，蒸制而得的饅頭比容大，饅頭心部呈海綿狀，口感細(xì)膩有彈性，與用新鮮面團(tuán)制作的饅頭品質(zhì)相近。
應(yīng)用例4本發(fā)明抗凍糖肽在冷凍魚糜制品中的應(yīng)用
一種耐低溫冷藏的冷凍魚糜制品所用的原料及配方如下：魚漿60份、大豆分離蛋白、實(shí)施例1制備的抗凍糖肽5份、明膠30份、豬脊膘20份、淀粉8份、大蒜0.4份、味琳1.5份、白糖3份、食用鹽3份、味精0.3份，余量為冰水。
試驗(yàn)方法：
（1）解凍：將魚漿解凍至可斬碎，但中心部位仍有部分碎冰為宜的半解凍狀態(tài)；
（2）斬拌：將解凍后的魚漿與豬脊膘、大蒜、味琳、白糖、食用鹽、味精和冰水在斬拌機(jī)中斬拌，期間待料溫達(dá)到15℃以上添加淀粉，繼續(xù)斬拌，出漿溫度為20℃；
（3）將大豆分離蛋白打成乳液狀后，與實(shí)施例1制備的抗凍糖肽一同加入斬拌機(jī)內(nèi)，中速斬拌均勻；
（4）成型：所述成型采用的成型模具，包括機(jī)座，所述機(jī)座上設(shè)有魚糜螺旋進(jìn)料機(jī)構(gòu)，料槽道上方均設(shè)有轉(zhuǎn)動(dòng)的推料撥板、壓輥及熱接合裝置的上下部熱接合輥，所述引導(dǎo)部設(shè)置在框架的一側(cè)，將通過壓輥機(jī)將魚糜壓成片狀，再經(jīng)過捆束機(jī)將魚糜片卷成櫻花狀。
（5）蒸煮：先低溫水煮：將成型后的生魚丸制品送入低溫水煮機(jī)內(nèi)進(jìn)行低溫水煮，水煮溫度為40℃，水煮時(shí)間為15min；接著高溫水煮：將低溫水煮后的魚丸制品送入高溫水煮機(jī)內(nèi)進(jìn)行高溫水煮，水煮溫度為95℃，水煮時(shí)間為4min；最后將高溫水煮后的魚丸制品送入高溫蒸煮機(jī)內(nèi)進(jìn)行高溫蒸煮，蒸煮溫度為121℃，蒸煮時(shí)間為15min。
（6）冷卻：所述冷卻的工藝如下：將高溫蒸煮后的魚丸制品送入冷卻機(jī)上，使魚丸制品的溫度降低至室溫。
（7）速凍：所述速凍的工藝如下：將冷卻后的魚丸制品送入速凍機(jī)內(nèi)，速凍機(jī)庫溫低于-30℃，凍結(jié)完成后魚丸制品中心溫度低于-18℃。
（8）包裝：對(duì)檢驗(yàn)合格的產(chǎn)品進(jìn)行包裝，包裝好的產(chǎn)品經(jīng)過金屬探測(cè)器的檢測(cè)產(chǎn)品中是否混有金屬物質(zhì)；
（9）入庫：將裝箱合格的產(chǎn)品放在-18℃以下的冷藏庫冷藏。
在冷凍魚糜制品中添加本發(fā)明抗凍糖肽能有效抑制由于凍藏引發(fā)的品質(zhì)略變、凝膠性能降低、風(fēng)味不佳等問題；抗凍糖肽能改善肉制品品質(zhì)，同時(shí)使魚糜制品營養(yǎng)更豐富，更受消費(fèi)者青睞。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施實(shí)例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。