發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及親和色譜領(lǐng)域，并且更特別地涉及包含蛋白l的κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，其可用于許多類型的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段的親和色譜。本發(fā)明還涉及含有所述多肽的分離基質(zhì)和使用這樣的分離基質(zhì)的分離方法。

發(fā)明背景

免疫球蛋白和免疫球蛋白片段代表全世界生產(chǎn)或開發(fā)的最普遍的生物制藥產(chǎn)品。對于這種特定治療市場的高商業(yè)需求，以及由此的價值，已導(dǎo)致重點放在制藥公司上，以使它們各自的生產(chǎn)過程的生產(chǎn)力最大化，同時控制相關(guān)的成本。

親和色譜，通常在包含葡萄球菌蛋白a或其變體的基質(zhì)上，通常被用作在完整免疫球蛋白分子的純化中的關(guān)鍵步驟之一。蛋白a對免疫球蛋白的fc鏈的高選擇性結(jié)合提供一個對雜質(zhì)和污染物具有很高的清除作用的通用步驟。

對于抗體片段，例如fab、單鏈可變片段(scfv)、雙-特異性t-細胞銜接子(bite)、結(jié)構(gòu)域抗體等，其缺乏fc鏈但具有1、3或4子類κ輕鏈，包含源自大消化鏈球菌(peptostreptococcusmagnus)的蛋白l的基質(zhì)(b?kerstr?m,lbj?rck:j.biol.chem.264,19740-19746,1989；wkasternetal:j.biol.chem.267,12820-12825,1992；bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992和美國專利6,822,075)顯示作為提供所需的高選擇性的純化平臺的巨大前景。美國專利6,822,075中公開的蛋白l包含氨基酸序列seqidno:1加上在n-末端的另外的aven序列。

seqidno:1(蛋白l)

keetpetpetdseeevtikanlifangstqtaefkgtfekatseayayadtlkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadalkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfaeataeayryadllakengkytadledggytinirfagkkvdekpee

蛋白l基質(zhì)是可作為capto^tml從gehealthcarebio-sciencesab,sweden(captoldatafile29-0100-08ac,2014)經(jīng)商業(yè)獲得的，并可被用來分離含κ輕鏈的蛋白例如完整抗體、fab片段、scfv片段、結(jié)構(gòu)域抗體等。由健康人產(chǎn)生的約75%的抗體具有κ輕鏈，并且許多治療性單克隆抗體和抗體片段含有κ輕鏈。

任何生物處理色譜應(yīng)用需要全面注意污染物的明確去除。這樣的污染物可以是例如在色譜程序中吸附于固定相或基質(zhì)的非-洗脫的分子，例如非-期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)、細菌和病毒。從基質(zhì)除去這樣的污染物通常在首次洗脫期望的產(chǎn)物后執(zhí)行，以在后續(xù)使用之前再生基質(zhì)。這樣的除去通常涉及稱為原位清洗(cip)的程序，其中能夠從固定相洗脫污染物的試劑被使用。一類常常與色譜介質(zhì)一起使用的這樣的試劑是在基質(zhì)上通過的堿性溶液。目前最廣泛使用的清潔和消毒劑是naoh，并且理想的是以范圍從0.05至最多例如1m的濃度使用，這取決于污染的程度和性質(zhì)。然而，與例如蛋白a比較，蛋白l是一種對堿相當敏感的蛋白并且在大量的周期后僅耐受至多約15mmnaoh。這意味著另外的、不太理想的清潔溶液，例如尿素或胍鎓鹽，也可能必須使用，以確保足夠的清潔。

一項廣泛的研究較早地專注于基因工程蛋白a配體的開發(fā)，所述配體表現(xiàn)出耐堿性ph-值的改進能力。例如，wo2003/080655a1公開了具有特定的天冬酰胺突變的蛋白a結(jié)構(gòu)域是比天然蛋白顯著更加堿穩(wěn)定的。

因此，本領(lǐng)域仍有獲得含有蛋白l-衍生的配體的分離基質(zhì)的需要，所述配體具有對堿性清潔程序的改進的穩(wěn)定性。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個方面是提供具有改進的堿穩(wěn)定性的多肽。這用如在權(quán)利要求1中定義的多肽實現(xiàn)。

一個優(yōu)點是堿穩(wěn)定性比蛋白l和親本多肽有改善。一個進一步的優(yōu)點是本發(fā)明的多肽保持對蛋白l證實的對含κ輕鏈的蛋白的高選擇性結(jié)合。

本發(fā)明的第二個方面是提供一種編碼具有改進的堿穩(wěn)定性的多肽或多聚體的核酸或載體。這用如在權(quán)利要求中定義的核酸或載體實現(xiàn)。

本發(fā)明的第三個方面是提供一種能夠表達具有改進的堿穩(wěn)定性的多肽或多聚體的表達系統(tǒng)。這用如在權(quán)利要求中定義的表達系統(tǒng)實現(xiàn)。

本發(fā)明的第四個方面是提供一種能夠選擇性地結(jié)合含κ輕鏈的蛋白并表現(xiàn)出改進的堿穩(wěn)定性的分離基質(zhì)。這用如在權(quán)利要求中定義的分離基質(zhì)實現(xiàn)。

本發(fā)明的第五個方面是提供一種分離含κ輕鏈的蛋白的有效和經(jīng)濟的方法。這用如在權(quán)利要求中定義的方法實現(xiàn)。

本發(fā)明的更合適的實施方案在從屬權(quán)利要求中描述。

定義

術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在此可互換使用，并被理解為還包括抗體的片段、包含抗體或抗體片段的融合蛋白和包含抗體或抗體片段的綴合物。

術(shù)語“κ輕鏈-結(jié)合多肽”和“κ輕鏈-結(jié)合蛋白”在此分別指能夠結(jié)合抗體的1、3或4子類κ輕鏈(也稱為vκi、vκiii和vκiv，如在bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992中)的多肽或蛋白，并包括例如蛋白l，及其已維持所述結(jié)合特性的任何變體、片段或融合蛋白。

術(shù)語“含κ輕鏈的蛋白”被用作“含免疫球蛋白κ輕鏈的蛋白”的同義詞，并且在此意指包含從抗體衍生的1、3或4子類κ輕鏈(也稱為vκi、vκiii和vκiv，如在bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992中)的蛋白，并包括含有1、3或4子類κ輕鏈的任何完整抗體、抗體片段、融合蛋白、綴合物或重組蛋白。

附圖簡述

圖1顯示如在us6,822,075和wkasternetal:jbiol.chem.267,12820-12825,1992中描述的蛋白l的5個κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的比對。

圖2顯示蛋白l的不同κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的堿穩(wěn)定性。

圖3顯示蛋白l的突變κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的堿穩(wěn)定性。

圖4顯示包含4個結(jié)構(gòu)域的蛋白l配體的堿穩(wěn)定性。

圖5顯示與蛋白l比較，蛋白l的突變二聚體、四聚體和六聚體κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的堿穩(wěn)定性。

實施方案的詳細描述

一方面，本發(fā)明公開一種κ輕鏈-結(jié)合多肽，其包含大消化鏈球菌蛋白l的一個或多個結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或基本由大消化鏈球菌蛋白l的一個或多個結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，其中這些結(jié)構(gòu)域的每一個選自結(jié)構(gòu)域2、結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域4。結(jié)構(gòu)域2可具有由seqidno:3或seqidno:12定義的氨基酸序列，或它可具有與seqidno:3或12至少90%，例如至少95%的序列同源性。seqidno:12是seqidno:3的變體，具有在第31位的丙氨酸。結(jié)構(gòu)域3可具有由seqidno:4定義的氨基酸序列，或它可具有與seqidno:4至少90%，例如至少95%的序列同源性。結(jié)構(gòu)域4可具有由seqidno:5定義的氨基酸序列，或它可具有與seqidno:5至少90%，例如至少95%的序列同源性。

在多肽的一些實施方案中，每個結(jié)構(gòu)域選自結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域4，或每個結(jié)構(gòu)域是結(jié)構(gòu)域3。特別地，多肽可包含結(jié)構(gòu)域3的多聚體或基本由結(jié)構(gòu)域3的多聚體組成。

在一些實施方案中，至少兩個結(jié)構(gòu)域選自結(jié)構(gòu)域2、結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域4，或選自結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域4。

在某些實施方案中，多肽不含消化鏈球菌蛋白l的任何結(jié)構(gòu)域1。結(jié)構(gòu)域1可具有由seqidno:2定義的氨基酸序列，或它可具有與seqidno:2至少90%，例如至少95%的序列同源性。

在多肽的某些實施方案中，在一個或多個，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少在對應(yīng)于seqidno:2-5的第45位的位置的氨基酸(例如在seqidno:2-5或12的第45位的氨基酸)已突變?yōu)椴皇翘於０?、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸。?5位的氨基酸可以例如被突變?yōu)楸彼帷?/p>

在多肽的一些實施方案中，在一個或多個，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少在對應(yīng)于seqidno:2-5的第10位的位置的氨基酸(例如在seqidno:2-5或12的第10位的氨基酸)已突變?yōu)椴皇翘於０?、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸。?0位的氨基酸可以例如被突變?yōu)楣劝滨０贰?/p>

在多肽的某些實施方案中，在一個或多個，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少在對應(yīng)于seqidno:2-5的第60位的位置的氨基酸(例如在seqidno:2-5或12的第60位的氨基酸)已突變?yōu)椴皇翘於０贰⒏彼峄虬腚装彼岬陌被?。?0位的氨基酸可以例如被突變?yōu)楣劝滨０贰?/p>

特別地，一個或多個，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有選自n10q；n45a；n60q；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q的突變。

在多肽的一些實施方案中，在一個或多個，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少在對應(yīng)于seqidno:2-5的第19位的位置的氨基酸(例如在seqidno:2-5或12的第19位的氨基酸)已突變?yōu)椴皇枪劝滨０?、天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸。?9位的氨基酸可以例如被突變?yōu)楣劝彼峄虮彼?。特別地，一個或多個，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有選自q19e和q19a的突變。

在多肽的某些實施方案中，一個或多個，例如全部的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有選自由seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:13和seqidno:14定義的序列的氨基酸序列。或者，一個或多個，例如全部的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有選自由seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11定義的序列的氨基酸序列。多肽還可在n-末端包含多個氨基酸殘基，所述殘基源自克隆過程或構(gòu)成來自裂解的信號傳導(dǎo)序列的殘基。另外的氨基酸殘基的數(shù)目可以例如是15個或更少，例如10個或更少，或5個或更少。作為一個特定的實例，多肽可在n-末端包含aqv序列。

seqidno:7(結(jié)構(gòu)域3,n45a突變)

pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:8(結(jié)構(gòu)域3,n10q,n45a突變)

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:9(結(jié)構(gòu)域3,n45a,n60q突變)

pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:10(結(jié)構(gòu)域3,n10q,n60q突變)

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:11(結(jié)構(gòu)域3,n10q,n45a,n60q突變)

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:12(結(jié)構(gòu)域2的變體)

pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeaaaeayryadalkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:13(結(jié)構(gòu)域3,q19a突變)

pkeevtikanliyadgktataefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:14(結(jié)構(gòu)域3,q19e突變)

pkeevtikanliyadgktetaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpee

在某些實施方案中，多肽是包含如由上文公開的任何實施方案所定義的多個突變或非-突變結(jié)構(gòu)域，或基本由如由上文公開的任何實施方案所定義的多個突變或非-突變結(jié)構(gòu)域組成的多聚體。多聚體可以例如是二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體。它可以是同源多聚體，其中多聚體中的所有單位是相同的，或它可以是異源多聚體，其中至少一個單位不同于其它的。有利地，多聚體中的所有單位，例如通過包含以上公開的突變，是堿穩(wěn)定的。結(jié)構(gòu)域可通過結(jié)構(gòu)域的c-和n-末端之間的肽鍵彼此直接連接?；蛘撸嗑垠w中的兩個或更多個單位可通過包含寡聚或多聚種類的元件，例如包含至多15或30個氨基酸，例如1-5、1-10或5-10個氨基酸的元件連接。這樣一種連接的性質(zhì)應(yīng)該優(yōu)選不會破壞結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象的穩(wěn)定性。這可例如通過避免在連接中存在半胱氨酸來實現(xiàn)。而且，所述連接還應(yīng)該優(yōu)選在堿性環(huán)境中是足夠穩(wěn)定的，不損害結(jié)構(gòu)域的特性。為此目的，如果連接不含天冬酰胺，則是有利的。如果連接不含谷氨酰胺，則可能是額外有利的。多聚體可進一步在n-末端包含多個氨基酸殘基，其源自克隆過程或構(gòu)成來自裂解的信號傳導(dǎo)序列的殘基。另外的氨基酸殘基的數(shù)目可以例如是15或更少，例如10或更少，或5或更少。作為一個特定的實例，多聚體可包含在n-末端的aqv序列。

在一些實施方案中，多聚體可包含選自以下的序列，或基本由選自以下的序列組成：seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18，例如選自seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18的序列。

seqidno:15(結(jié)構(gòu)域3,四聚體)

pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:16結(jié)構(gòu)域3(n10q,n45a,n60q)2

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:17結(jié)構(gòu)域3(n10q,n45a,n60q)4

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:18結(jié)構(gòu)域3(n10q,n45a,n60q)6

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

在某些實施方案中，如上文公開的多肽和/或多聚體還包含在c-末端或n-末端的一個或多個偶聯(lián)元件，其選自半胱氨酸殘基、多個賴氨酸殘基和多個組氨酸殘基。偶聯(lián)元件可以例如是在c-末端的單一半胱氨酸。偶聯(lián)元件可直接連接于c-或n-末端，或它/它們可通過包含至多15個氨基酸，例如1-5、1-10或5-10個氨基酸的接頭連接。這段序列(stretch)優(yōu)選在堿性環(huán)境中應(yīng)該也是足夠穩(wěn)定的，不損害突變蛋白的特性。為此目的，如果這段序列不含天冬酰胺，則是有利的。如果這段序列不含谷氨酰胺，則可能是額外有利的。具有c-或n-末端半胱氨酸的優(yōu)點是蛋白的終點偶聯(lián)可通過半胱氨酸硫醇與支持體上的親電子基團的反應(yīng)完成。這提供對于結(jié)合能力是重要的偶聯(lián)蛋白的優(yōu)越的移動性。

多肽或多聚體的堿穩(wěn)定性可通過使之偶聯(lián)于spr芯片，例如如在實施例中所述的biacorecm5傳感器芯片，并使用例如特定的含κ輕鏈的蛋白或多克隆人igg(其中大多數(shù)igg分子具有κ輕鏈)，在堿性溶液中孵育之前和之后，在特定的溫度，例如22+/-2℃下，測量芯片的κ輕鏈-結(jié)合能力來評價。孵育可例如在0.1mnaoh中進行許多個10min的周期，例如50、96或100個周期。于22+/-2℃，在0.1mnaoh中在96-100個10min的孵育周期后，基質(zhì)的結(jié)合能力可以是孵育前結(jié)合能力的至少40，例如至少50或至少55%?；蛘?，對于如上測量的特定突變體在96-100個周期后的剩余結(jié)合能力可與對親本多肽/多聚體的剩余結(jié)合能力比較。在這種情況下，對于突變體的剩余結(jié)合能力可以是親本多肽/多聚體的至少105%，例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%。

本發(fā)明還公開一種包含消化鏈球菌蛋白l的至少一個突變結(jié)合結(jié)構(gòu)域的κ輕鏈-結(jié)合多肽，其中由seqidno:2-6或12定義的，或與seqidno:2-6或12具有至少95%或98%的序列同源性的親本結(jié)構(gòu)域的至少一個天冬酰胺殘基已經(jīng)突變?yōu)榱硪粋€并非天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸殘基。多肽可包含至少突變n45a和/或突變n60q。在特定的實施方案中，所述突變選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q。相對于親本多肽的堿穩(wěn)定性可被改進和如上文所公開進行測定。

在一些實施方案中，多肽包含多個突變結(jié)合結(jié)構(gòu)域或基本由多個突變結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，例如2、3、4、5或6結(jié)構(gòu)域，其中每個結(jié)構(gòu)域包含突變n10q,n45a和n60q的至少一個，例如n45a和/或n60q。特別地，在每個結(jié)構(gòu)域中的突變可選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q。結(jié)構(gòu)域可任選地通過包含至多15個氨基酸的元件彼此連接。

在第二方面，本發(fā)明公開編碼依據(jù)以上公開的任何實施方案的多肽或多聚體的核酸。因此，本發(fā)明涵蓋本核酸序列的所有形式，例如編碼多肽或多聚體的rna和dna。本發(fā)明涵蓋載體，例如質(zhì)粒，其除了編碼序列，還包含用于表達依據(jù)本發(fā)明的多肽或多聚體所需的信號序列。在一個實施方案中，載體包含編碼依據(jù)本發(fā)明的多聚體的核酸，其中編碼各個單位的獨立的核酸可具有同源或異源的dna序列。

在第三方面，本發(fā)明公開一種表達系統(tǒng)，其包含如上公開的核酸或載體。表達系統(tǒng)可以例如是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性原核宿主細胞系統(tǒng)，例如芽孢桿菌(bacillussp)或大腸桿菌(escherichiacoli)，其已被修飾為表達本發(fā)明的多肽或多聚體。在可供選擇的實施方案中，表達系統(tǒng)是真核宿主細胞系統(tǒng)，例如酵母，例如巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)或釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

在第四方面，本發(fā)明公開一種分離基質(zhì)，其中依據(jù)以上公開的任何實施方案的多個多肽或多聚體已經(jīng)偶聯(lián)于固體支持體。這樣一種基質(zhì)可用來分離含κ輕鏈的蛋白，并且由于多肽/多聚體的改進的堿穩(wěn)定性，基質(zhì)將耐受在清潔期間的高堿性的條件，這對于在生物處理分離背景下的長期重復(fù)使用是至關(guān)重要的?；|(zhì)的堿穩(wěn)定性可通過于特定的溫度下，例如22+/-2℃，在堿性溶液中孵育之前和之后，使用例如特定的含κ輕鏈的蛋白或多克隆人igg測量κ輕鏈-結(jié)合能力來評價。孵育可例如在0.1mnaoh中進行一定數(shù)目的15min周期，例如100、200或300個周期。于22+/-2℃，在0.1mnaoh中經(jīng)100個15min孵育周期后，基質(zhì)的結(jié)合能力可以是孵育前結(jié)合能力的至少80，例如至少85、至少90或至少95%?；蛘撸跤稍?.1mnaoh中進行多個4h的周期，例如6個周期(提供24h的總孵育時間)。于22+/-2℃，在0.1mnaoh中經(jīng)24h的總孵育時間后，基質(zhì)的結(jié)合能力可以是孵育前結(jié)合能力的至少80，例如至少85，至少90或至少95%。

如技術(shù)人員應(yīng)該理解的，表達的多肽或多聚體在被固定到支持體之前，應(yīng)被純化至合適的程度。這樣的純化方法是本領(lǐng)域熟知的，且基于蛋白的配體固定于支持體容易使用標準方法進行。合適的方法和支持體將在下文更詳細地討論。

依據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)的固體支持體可以是任何合適的熟知的種類。常規(guī)親和分離基質(zhì)通常具有有機性質(zhì)并基于親水性表面暴露于所用的水性介質(zhì)(即暴露在它們的外表面上和(如果存在)也在內(nèi)表面上的羥基(-oh)、羧基(-cooh)、甲酰胺基(-conh2，可能呈現(xiàn)為n-取代的形式)、氨基(-nh2，可能呈現(xiàn)為取代的形式)、寡-或聚乙烯氧基)的聚合物。固體支持體可適合為多孔的?？紫堵士梢员硎緸閗av或kd值(特定尺寸的探針分子可獲得的孔體積的分數(shù))，其通過逆尺寸排阻色譜，例如依據(jù)在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法測量。按照定義，kd和kav值二者總是在0-1范圍內(nèi)。kav值可有利地為0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用mw110kda的葡聚糖作為探針分子測量的。其優(yōu)點是支持體具有大分數(shù)的孔，其能夠容納本發(fā)明的多肽/多聚體和結(jié)合于多肽/多聚體的免疫球蛋白并提供免疫球蛋白朝向結(jié)合位點和離開結(jié)合位點的質(zhì)量輸運。

多肽或多聚體可經(jīng)由常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)，利用例如存在于配體中的硫醇基、氨基和/或羧基，附接于支持體。雙環(huán)氧化物(bisepoxides)、表氯醇、cnbr、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)等是熟知的偶聯(lián)試劑。在支持體和多肽/多聚體之間，可引入一種稱為間隔區(qū)的分子，其改善多肽/多聚體的可利用性并促進多肽/多聚體化學偶聯(lián)于支持體。合適的間隔區(qū)可例如通過用表氯醇、丁二醇二環(huán)氧化物、烯丙基縮水甘油醚等激活支持體來引入。或者，多肽/多聚體可通過非-共價鍵合，例如物理吸附或生物特異性吸附附接于支持體。

在一些實施方案中，基質(zhì)包含5-20，例如5-15mg/ml、5-11mg/ml或8-11mg/ml的偶聯(lián)于支持體的多肽或多聚體。偶聯(lián)的多肽/多聚體的量可受在偶聯(lián)過程中所用的多肽/多聚體的濃度，受所用的偶聯(lián)條件和/或受所用支持體的孔結(jié)構(gòu)的控制。作為一般規(guī)則，基質(zhì)的絕對結(jié)合能力隨著偶聯(lián)多肽/多聚體的量增加而增加，至少達到其中孔變得受偶聯(lián)的多肽/多聚體顯著限制的點。每mg偶聯(lián)的多肽/多聚體的相對結(jié)合能力將在高偶聯(lián)水平上降低，導(dǎo)致在以上指定范圍內(nèi)的成本效益最優(yōu)化。

在一些實施方案中，多肽經(jīng)由多點附接偶聯(lián)于支持體。這可通過使用這樣的偶聯(lián)條件，即多肽中的多個反應(yīng)性基團與支持體中的反應(yīng)性基團反應(yīng)來適當?shù)赝瓿伞５湫偷?，多點附接可涉及序列中氨基酸殘基的幾個內(nèi)在反應(yīng)性基團，例如賴氨酸中的胺，與支持體上的反應(yīng)性基團，例如環(huán)氧化物、氰酸酯(例如來自cnbr激活)、琥珀酰亞胺酯(例如來自nhs激活)等反應(yīng)。然而，也可能是有意在多肽的不同位置引入反應(yīng)性基團以影響偶聯(lián)特性。為經(jīng)由賴氨酸提供多點偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)適當?shù)卦谄渲泻艽笠徊糠仲嚢彼岵烦尸F(xiàn)非-質(zhì)子化親核狀態(tài)的ph，例如在高于8.0，例如10以上的ph下進行。

在某些實施方案中，多肽或多聚體通過硫醚鍵偶聯(lián)于支持體。執(zhí)行這樣的偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域熟知的并由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用標準技術(shù)和設(shè)備容易地進行。硫醚鍵是撓性和穩(wěn)定的，且一般適用于親和色譜。特別是當硫醚鍵經(jīng)由多肽或多聚體上的末端或接近-末端的半胱氨酸殘基時，偶聯(lián)的多肽/多聚體的移動性增加，這提供了改善的結(jié)合能力和結(jié)合動力學。在一些實施方案中，多肽/多聚體經(jīng)由如上所述的蛋白上提供的c-末端半胱氨酸偶聯(lián)。這允許半胱氨酸硫醇有效偶聯(lián)于支持體上的親電子基團，例如環(huán)氧化物基團、鹵代醇基團等，導(dǎo)致硫醚橋偶聯(lián)。多肽/多聚體可例如經(jīng)由單點附接(例如經(jīng)由單一半胱氨酸)或經(jīng)由直接的多點附接，使用例如接近多肽/多聚體的末端的多個賴氨酸或其它偶聯(lián)基團偶聯(lián)。

在某些實施方案中，支持體包含多羥基聚合物，例如多糖。多糖的例子包括例如葡聚糖、淀粉、纖維素、支鏈淀粉、瓊脂、瓊脂糖等。多糖是固有親水性的，具有較低程度的非特異性相互作用，它們提供高含量的反應(yīng)性(可激活的)羥基且它們對用于生物處理的堿性清潔溶液一般是穩(wěn)定的。

在一些實施方案中，支持體包含瓊脂或瓊脂糖。用于本發(fā)明的支持體可依據(jù)標準方法，例如逆懸浮凝膠化(inversesuspensiongelation)(shjertén:biochimbiophysacta79(2),393-398(1964)容易地制備。或者，堿性基質(zhì)是可市售獲得的產(chǎn)品，例如以sepharose?ff(gehealthcare)商品名出售的交聯(lián)的瓊脂糖珠。在對于大規(guī)模分離是特別有利的一個實施方案中，已使用在us6602990或us7396467(通過引用以其整體結(jié)合到本文中)中描述的方法，使支持體適應(yīng)于增加其剛性，因而使基質(zhì)更適合于高流速。

在某些實施方案中，支持體，例如多糖或瓊脂糖支持體被交聯(lián)，例如用羥烷基醚交聯(lián)。產(chǎn)生這樣的交聯(lián)的交聯(lián)劑可以是例如表鹵代醇像表氯醇、雙環(huán)氧化物像丁二醇二縮水甘油醚、烯丙基化劑像烯丙基鹵化物或烯丙基縮水甘油醚。交聯(lián)對于支持體的剛性是有益的并改善化學穩(wěn)定性。羥烷基醚交聯(lián)是堿穩(wěn)定的，且不引起顯著的非特異性吸附。

或者，固體支持體基于合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚羥基烷基丙烯酸酯、聚羥基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物的情況下，例如基于二乙烯基和單乙烯基-取代的苯的基質(zhì)，基質(zhì)的表面常常被親水化，以使如上定義的親水性基團暴露于周圍的水性液體。這樣的聚合物依據(jù)標準方法，見例如“styrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerization”(rarshady:chimicael'industria70(9),70-75(1988))容易地生產(chǎn)?；蛘?，使用可市售獲得的產(chǎn)品，例如source?(gehealthcare)。在另一個替代中，依據(jù)本發(fā)明的固體支持體包含無機性質(zhì)的支持體，例如二氧化硅、氧化鋯等。

在再另一個實施方案中，固體支持體呈現(xiàn)為另一種形式例如表面、芯片、毛細管，或濾器(如膜或深過濾基質(zhì))。

關(guān)于依據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)的形狀，在一個實施方案中，基質(zhì)呈現(xiàn)為多孔整料的形式。在可供選擇的實施方案中，基質(zhì)以可以是多孔或無孔的串珠或粒子形式呈現(xiàn)。以串珠或粒子形式呈現(xiàn)的基質(zhì)可用作填充床或以懸浮的形式使用。懸浮的形式包括稱為膨脹床的那些和純粹的懸浮液，其中顆粒或珠自由移動。在整料、填充床和膨脹床的情況下，分離程序通常遵循具有濃度梯度的常規(guī)色譜。在純粹的懸浮液的情況下，應(yīng)使用分批的模式。

在第六方面，本發(fā)明公開一種分離含κ輕鏈的蛋白的方法，其中如以上公開的分離基質(zhì)被使用。

在一些實施方案中，該方法包含以下步驟：

a)使包含含κ輕鏈的蛋白的液體樣品與如以上公開的分離基質(zhì)接觸，

b)用洗滌液洗滌所述分離基質(zhì)，

c)用洗脫液從分離基質(zhì)洗脫含κ輕鏈的蛋白，和

d)用清潔液清潔分離基質(zhì)。

該方法還可包含以下步驟：在步驟a)之前，提供依據(jù)上文描述的任何實施方案的親和分離基質(zhì)和提供包含含κ輕鏈的蛋白和至少一種其它物質(zhì)的溶液作為液體樣品，以及在步驟c)之后，回收洗脫液和任選地使洗脫液經(jīng)歷進一步的分離步驟，例如通過陰離子或陽離子交換色譜、多峰色譜和/或疏水相互作用色譜。液體樣品的合適的組成，洗滌液體和洗脫液，以及執(zhí)行分離的一般條件是親和色譜領(lǐng)域且特別是蛋白l色譜領(lǐng)域熟知的。包含含κ輕鏈的蛋白和至少一種其它物質(zhì)的液體樣品可包含宿主細胞蛋白(hcp)，例如中國倉鼠卵巢(cho)細胞、大腸桿菌或酵母細胞蛋白。cho細胞和大腸桿菌蛋白的含量可通過針對這些蛋白質(zhì)的免疫測定法便利地測定，如得自cygnustechnologies的chohcp或大腸桿菌hcpelisa試劑盒。宿主細胞蛋白或cho細胞/大腸桿菌/酵母蛋白可在步驟b)期間被解除吸附。

洗脫可通過使用用來從蛋白l介質(zhì)洗脫的任何合適的溶液進行。這可以例如是具有ph4或更低，例如ph2.5-4或2.8-3.5的溶液或緩沖液。在一些實施方案中，洗脫緩沖液或洗脫緩沖液梯度包含至少一種單-、二-或三官能的羧酸或這樣的羧酸的鹽。在某些實施方案中，洗脫緩沖液或洗脫緩沖液梯度包含至少一個選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽和甲酸鹽的陰離子種類。

在一些實施方案中，清潔液是堿性的，例如具有12-14的ph。這樣的溶液提供基質(zhì)的有效清潔，特別是在區(qū)間的上端。

在某些實施方案中，清潔液包含0.01-1.0mnaoh或koh，例如0.05-1.0或0.05-0.1mnaoh或koh。本發(fā)明的多肽的高穩(wěn)定性使得使用這樣的比較強的堿性溶液成為可能。

在一些實施方案中，步驟a)-d)重復(fù)至少10次，例如至少50次或50-200次。這對過程經(jīng)濟是重要的，因為基質(zhì)可重復(fù)利用多次。

實施例

蛋白的突變發(fā)生

從在us6822075(seqidno:1)中公開的，含有4個κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白l設(shè)計單體構(gòu)建體。這些被編號為1、2、3和4，從n-末端開始(圖1)。dna片段購自dna合成公司(dna2.0)。4個單體構(gòu)建體在pjexpress201克隆載體中制備，每個具有n-末端半胱氨酸。對構(gòu)建體的概述，見seqidno:2、4、5、12。

構(gòu)建體被亞克隆至表達載體pgo，其含有大腸桿菌gap啟動子和用于靶蛋白的周質(zhì)定位的ompa信號肽序列。編碼4個結(jié)構(gòu)域的序列通過用含有分別在5’側(cè)和3’側(cè)上的fspi和psti的限制性內(nèi)切酶識別位點的寡核苷酸擴增來制備。制備的編碼每個結(jié)構(gòu)域的dna片段用fspi和psti(newenglandbiolabs)消化。單獨地，表達載體用fspi和psti消化來制備，通過瓊脂糖凝膠電泳純化并回收。將兩者混合并用quick連接試劑盒(newenglandbiolabs)連接。用熱休克方法，將表達每個結(jié)構(gòu)域的連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至化學感受態(tài)大腸桿菌k12株。

結(jié)構(gòu)域3中的氨基酸n10、n45、q19和n60的進一步的突變在lac操縱子控制機制下，在含有t5啟動子的表達載體pjexpress401(dna2.0)中制備(seqidno:7-11,13-14)。設(shè)計含有和不含ompa信號肽，但無c-末端半胱氨酸的構(gòu)建體。

結(jié)構(gòu)域3的四聚體，含n45、n10和n60突變的結(jié)構(gòu)域3的二聚體、四聚體和六聚體也在含有和不含c-末端半胱氨酸的pjexpress401中制備(seqidno:15-18)。

構(gòu)建體表達和純化

于37℃，在裝有補充有25mg/l卡那霉素的lb-肉湯(10g蛋白胨、5g酵母提取物、5gnacl)的搖瓶中培養(yǎng)大腸桿菌k12重組細胞，直至600nm的光學密度達到0.8。在此點，蛋白表達用1mm的最終濃度的異丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷(vwrinternational)誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后，溫度下降至30℃并將培養(yǎng)物培養(yǎng)5小時。停止培養(yǎng)并將細胞以4000xg離心15分鐘，棄去上清液。使細胞再次懸浮于含磷酸緩沖鹽水(pbs)的1/10培養(yǎng)體積中并使用脈沖聲波降解法超聲處理2分鐘的有效時間。經(jīng)超聲處理的樣品通過以6000xg離心30分鐘從細胞碎片澄清，接著用具有0.2μm孔徑的膜微濾。

純化的配體用lc-ms分析以確定純度并確定分子量對應(yīng)于期望值(基于氨基酸序列)。

實施例1

表1中列出的純化的單體配體(在非-突變單一結(jié)構(gòu)域的情況下，還包含在c末端的半胱氨酸和在n-末端的aqv序列)，使用gehealthcare的胺偶聯(lián)試劑盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亞胺偶聯(lián))，以足以在biacore儀器(gehealthcare,sweden)中給出約1000ru的信號強度的量，在biacorecm5傳感器芯片(gehealthcare,sweden)上固定化。為跟蹤固定化表面的igg結(jié)合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流過芯片并記錄信號強度。然后表面經(jīng)原位清洗(cip)，即于室溫(22+/-2℃)下，用100mmnaoh沖洗10分鐘。重復(fù)96個周期并在每個周期后按igg結(jié)合能力(信號強度)的相對損失，跟蹤固定化配體的堿穩(wěn)定性。對于非-突變結(jié)構(gòu)域的結(jié)果示于圖2中并表明結(jié)構(gòu)域1具有比其它結(jié)構(gòu)域明顯更低的堿穩(wěn)定性，和結(jié)構(gòu)域3具有最高的堿穩(wěn)定性。對于結(jié)構(gòu)域3的單一-結(jié)構(gòu)域天冬酰胺突變體的結(jié)果示于圖3并表明與親本結(jié)構(gòu)域3(其被用作與突變平行的參比)比較，所有突變體的堿穩(wěn)定性改進。

表1

實施例2

表2中列出的純化的多結(jié)構(gòu)域配體，使用gehealthcare的胺偶聯(lián)試劑盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亞胺偶聯(lián))，以足以在biacore儀器(gehealthcare,sweden)中給出約1000ru的信號強度的量，在biacorecm5傳感器芯片(gehealthcare,sweden)上固定化。蛋白l在n-末端具有另外的aihnra序列。為跟蹤固定化表面的igg結(jié)合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流過芯片并記錄信號強度。然后表面經(jīng)原位清洗(cip)，即于室溫(22+/-2℃)下，用100mmnaoh沖洗10分鐘。重復(fù)96個周期并在每個周期后按igg結(jié)合能力(信號強度)的相對損失，跟蹤固定化配體的堿穩(wěn)定性。結(jié)果示于表2和圖4中并表明與蛋白l(其作為參比平行運行)比較，四聚體結(jié)構(gòu)域3具有改進的堿穩(wěn)定性。

表2

實施例3

使表3中列出的純化的多結(jié)構(gòu)域配體在biacorecm5傳感器芯片上固定化，并通過用于實施例2的方法評價。配體的名稱末端的-cys表明，配體除了由seqidno:16-18定義的序列外，還具有c-末端半胱氨酸。結(jié)果示于表3和圖5并表明與蛋白l(其作為參比平行運行)比較，所有的突變結(jié)構(gòu)域3二聚體、四聚體和六聚體具有改進的堿穩(wěn)定性。

表3

實施例4

表4的純化的二聚體、四聚體和六聚體配體使用下面描述的方法在瓊脂糖珠上固定化并對能力進行評價。結(jié)果示于表4。

表4

激活

所用的基礎(chǔ)基質(zhì)是依據(jù)us6602990的方法制備的85微米(體積-加權(quán)的)中值直徑的剛性交聯(lián)瓊脂糖珠，且對于mw110kda的葡聚糖具有對應(yīng)于逆凝膠過濾色譜kav值0.70的孔徑(依據(jù)在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法)。

于25℃，將25ml(g)排干的基礎(chǔ)基質(zhì)、10.0ml蒸餾水和2.02gnaoh在帶有機械攪拌器的100ml燒瓶中混合10min。加入4.0ml表氯醇并進行反應(yīng)2小時。激活的凝膠用10個凝膠沉降體積(gv)的水洗滌。

偶聯(lián)

激活的凝膠用5gv0.2m磷酸鹽/1mmedtaph11.5(偶聯(lián)緩沖液)洗滌。將15ml凝膠+13mg配體/ml凝膠(5.0ml)+5.5ml偶聯(lián)緩沖液+4.7g硫酸鈉在50ml燒瓶中混合并于30℃攪拌18.5h。ph經(jīng)測量為10.8。

固定后，凝膠用蒸餾水洗滌3xgv，然后用0.1m磷酸鹽/1mmedtaph8.5洗滌5xgv。將凝膠+1gv{0.1m磷酸鹽/1mmedta/7.5%硫代甘油ph8.5}混合并于45℃，在燒瓶中攪拌2小時又20分鐘。然后凝膠用1xgv0.1mhac和1xgv{0.1mtris/0.15mnaclph8.5}交替洗滌，然后用蒸餾水洗滌(6xgv)。將凝膠樣品送至外部實驗室用于氨基酸分析并從總氨基酸含量計算配體含量(mg/ml凝膠)。所用的偶聯(lián)方案提供多點偶聯(lián)，每個結(jié)構(gòu)域的數(shù)個賴氨酸附接于凝膠。

2ml樹脂被填充于tricorn?5100柱中。

蛋白

a)從木瓜蛋白酶-消化的iggmab制備的純化的fab，在平衡緩沖液中稀釋至1mg/ml。

b)從熱-處理的大腸桿菌上清液制備的純化的dab，在平衡緩沖液中稀釋至1mg/ml。dab僅含有κ輕鏈，而無任何抗原-結(jié)合位點。

平衡緩沖液

apb磷酸鹽緩沖液20mm+0.15mnacl，ph7,4(medicago)

吸附緩沖液

apb磷酸鹽緩沖液20mm+0.15mnacl，ph7.4(medicago)

洗脫緩沖液

25mm檸檬酸鹽ph2.5

穿透能力用?ktaexplorer10系統(tǒng)，以4分鐘的滯留時間測定。然后使平衡緩沖液通過旁路柱，直到獲得穩(wěn)定的基線。這在自動歸零之前進行。將樣品施加于柱直至獲得100%uv信號。然后，再次應(yīng)用平衡緩沖液直至獲得穩(wěn)定的基線。

將樣品裝載于柱直至達到uv信號85%的最大吸光度。然后用平衡緩沖液洗滌柱并以0.5ml/min的流速(ph2.5)洗脫。

為計算在10%時的穿透能力，采用以下方程。那是裝載到柱中直至柱流出液中的fab/dab濃度是進料中fab/dab濃度的10%的fab/dab的量。

a100%=100%uv信號；

asub=來自非-結(jié)合蛋白的吸光度貢獻；

a(v)=給定的應(yīng)用體積的吸光度；

vc=柱體積；

vapp=直至10%穿透的應(yīng)用體積；

vsys=系統(tǒng)死體積；

c0=進料濃度。

計算10%穿透的動態(tài)結(jié)合能力(dbc)并對曲線的表現(xiàn)進行研究。還關(guān)于結(jié)合、洗脫和cip峰，對曲線進行了研究。對10和80%穿透，計算動態(tài)結(jié)合能力(dbc)。

本書面說明書使用實施例來公開本發(fā)明，包括最佳模式，并且還能使本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員實踐本發(fā)明，包括制造和使用任何設(shè)備或系統(tǒng)并執(zhí)行任何結(jié)合的方法。本發(fā)明的可專利性范圍由權(quán)利要求書限定，并且可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)想的其它實施例。如果這樣的其它實施例具有與權(quán)利要求書的文字語言相同的結(jié)構(gòu)要素，或如果它們包括與權(quán)利要求書的文字語言無實質(zhì)性差異的等同結(jié)構(gòu)要素，則打算使這樣的其它實施例落入權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文中提及所有專利和專利申請通過引用以其整體結(jié)合到本文中，如同它們單獨結(jié)合到本文中一樣。