本發(fā)明涉及在將低膜透過性化合物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或粘膜內(nèi)時有用的高分子化合物。
背景技術(shù)：
：近年來，通過將合成肽、蛋白、甚至dna、糖導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白相互作用、控制細(xì)胞內(nèi)信息傳遞、轉(zhuǎn)錄等，進(jìn)行著闡明它們的功能、誘導(dǎo)特殊的功能的嘗試。通過這樣的方法，可期待進(jìn)行至今成謎的遺傳信息的闡明、病原的闡明、或其治療方法的開發(fā)。另外，通過es細(xì)胞、ips細(xì)胞的開發(fā)，利用核酸或蛋白控制細(xì)胞功能的技術(shù)的重要性不斷增加。通常，多肽、核酸、糖等水溶性高分子量物質(zhì)由于具有高的親水性而難以通過細(xì)胞膜。因此，作為將它們導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，已知微注射法、電穿孔法、磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法、病毒載體法、膜透過性肽法等。其中，膜透過性肽法是利用膜透過性肽誘發(fā)細(xì)胞的巨胞飲的方法。作為膜透過性肽法，已知使欲導(dǎo)入細(xì)胞的目標(biāo)化合物與膜透過性肽共價鍵合、進(jìn)行導(dǎo)入的方法(例如參照專利文獻(xiàn)1及2)，或使側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子化合物與欲導(dǎo)入細(xì)胞的目標(biāo)化合物共存、僅導(dǎo)入目標(biāo)化合物的方法(例如參照專利文獻(xiàn)3及4)。使目標(biāo)化合物與膜透過性肽共價鍵合進(jìn)行導(dǎo)入的方法雖然對細(xì)胞的損害小，但需要繁雜的前處理。另一方面，使用側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子化合物的方法簡便，但以往已知的側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子化合物的水溶性高分子量物質(zhì)的導(dǎo)入效率不充分，并且因?yàn)榫哂腥醯募?xì)胞毒性而有時在使用濃度上存在限制，在提高目標(biāo)化合物的導(dǎo)入效率方面成為問題。另外，還提出了將側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子應(yīng)用于藥劑從上皮吸收的吸收促進(jìn)劑(例如參照專利文獻(xiàn)5)，但為了獲得充分的吸收促進(jìn)效果，需要以高濃度使用，在實(shí)用化時有對粘膜具有刺激性的擔(dān)憂。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：us2003/229202a1專利文獻(xiàn)2：日本特開2005-052083號公報(bào)專利文獻(xiàn)3：us2010/113559a1專利文獻(xiàn)4：日本特開2011-229495號公報(bào)專利文獻(xiàn)5：日本特開2010-100781號公報(bào)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明是鑒于上述實(shí)際情況而完成的，本發(fā)明的目的在于提供能夠?qū)⒑怂帷⒌鞍椎人苄愿叻肿恿课镔|(zhì)或藥劑以簡便的方法、高的效率導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或粘膜內(nèi)的高分子化合物及使用該高分子化合物的導(dǎo)入方法。用于解決課題的方法本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)通過使用在側(cè)鏈具有膜透過性肽的特定基團(tuán)的高分子化合物，能夠?qū)⒑怂?、蛋白等水溶性高分子量物質(zhì)或藥劑容易地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或粘膜內(nèi)，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供側(cè)鏈具有下述通式(1)或下述通式(2)表示的基團(tuán)的高分子化合物。[化學(xué)式1](式中，x1表示從中性氨基酸或ω-氨基烷酸中除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基，x2表示從膜透過性肽中除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基，x3表示羥基、氨基、碳數(shù)為1～4的烷氧基或芐氧基，a表示1～50的數(shù)。)[化學(xué)式2](式中，x4表示從中性氨基酸或ω-氨基烷酸中除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基，x5表示從膜透過性肽中除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基，x6表示氫原子、碳數(shù)為1～6的烷基、芐基、碳數(shù)為1～6的?；?、芳基磺?；蜓趸驶?、b表示1～50的數(shù)。)另外，本發(fā)明還提供一種用于將藥劑或水溶性高分子化合物等低膜透過性化合物導(dǎo)入粘膜內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入劑，其由上述高分子化合物構(gòu)成。另外，本發(fā)明還提供一種用于將低膜透過性化合物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或粘膜內(nèi)的方法，其使用上述導(dǎo)入劑。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，在側(cè)鏈具有通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)的高分子化合物即使不進(jìn)行繁雜的前處理，也能夠?qū)⒌湍ね高^性化合物以高的效率導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或粘膜內(nèi)。具體實(shí)施方式以下，對本發(fā)明的實(shí)施方式的一個例子進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施方式。其中，本發(fā)明中，低膜透過性化合物是指生物利用度(bioavailability)低的化合物，具體而言是指生物學(xué)上的利用率(extentofbioavailability)為50％以下的化合物。生物學(xué)上的利用率可通過下式計(jì)算。生物學(xué)上的利用率(％)＝100×(通過經(jīng)口給予到達(dá)血液中的量)/(通過靜脈給予到達(dá)血液中的量)這里所說的”到達(dá)血液中的量”以被血中濃度和橫軸(時間軸)包圍的部分的面積(血藥濃度－時間曲線下面積：auc)求出。本發(fā)明的高分子化合物及使用了該化合物的本發(fā)明的導(dǎo)入劑(以下也將兩者統(tǒng)稱為本發(fā)明的高分子化合物)具有膜透過性肽殘基，能夠使低膜透過性化合物高效率地?cái)z入細(xì)胞內(nèi)。關(guān)于膜透過性肽被攝入到細(xì)胞內(nèi)的機(jī)理，通常認(rèn)為膜透過性肽通過誘發(fā)細(xì)胞的巨胞飲而被攝入，因此當(dāng)周圍存在低膜透過性化合物時，這些低膜透過性化合物與膜透過性肽一起被攝入。為本發(fā)明的高分子化合物時，在膜透過性肽殘基作用下，巨胞飲在細(xì)胞的多個部位被誘發(fā)，但本發(fā)明的高分子化合物為巨大分子，細(xì)胞難以將本發(fā)明1分子的高分子化合物從多個部位攝入。因此，當(dāng)本發(fā)明的高分子化合物的周圍存在低膜透過性化合物時，在本發(fā)明的高分子化合物作用下，低膜透過性化合物被誘發(fā)了巨胞飲的細(xì)胞偶發(fā)且持續(xù)地?cái)z入。因此認(rèn)為，并不一定需要膜透過性肽殘基與低膜透過性化合物之間的相互作用，僅通過使混合有本發(fā)明的高分子化合物和低膜透過性化合物者與細(xì)胞或粘膜接觸，即能夠?qū)⒌湍ね高^性化合物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或粘膜內(nèi)。本發(fā)明的高分子化合物為在側(cè)鏈具有通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)的接枝型的高分子化合物。本發(fā)明中，將本發(fā)明的高分子化合物的主鏈部分稱為干高分子。以下，對本發(fā)明的高分子化合物的結(jié)構(gòu)詳細(xì)地進(jìn)行說明。[通式(1)表示的基團(tuán)]通式(1)中，x1表示從中性氨基酸或ω-氨基烷酸中除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基、a表示1～50的數(shù)。作為中性氨基酸，可列舉出例如丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、羥基脯氨酸等，作為ω-氨基烷酸，可列舉出3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一烷酸等。作為x1適用的中性氨基酸，從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率提高的角度出發(fā)，優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸，更優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸，最優(yōu)選甘氨酸。a優(yōu)選為1～30的數(shù)、更優(yōu)選為1～20的數(shù)、最優(yōu)選為1～10的數(shù)。a為2～50的數(shù)時，x1可以為1種中性氨基酸殘基或ω-氨基烷酸殘基，也可以為選自這些殘基中的2種以上的組合。通式(1)中，x2表示從膜透過性肽中除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基。本發(fā)明的高分子化合物的膜透過性肽殘基可以根據(jù)細(xì)胞或粘膜、欲導(dǎo)入的低膜透過性化合物來適當(dāng)選擇，但優(yōu)選構(gòu)成膜透過性肽殘基的氨基酸中的至少1個為堿性氨基酸。另外，堿性氨基酸可以是l體或d體中的任一種，可以根據(jù)細(xì)胞或粘膜、欲導(dǎo)入的低膜透過性化合物來適當(dāng)選擇。作為堿性氨基酸，可列舉出精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、羥基賴氨酸、組氨酸等，其中優(yōu)選含胍基的氨基酸、更優(yōu)選精氨酸。由于膜透過性肽殘基中的堿性氨基酸的比例越高，低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率越高，因此堿性氨基酸與構(gòu)成膜透過性肽的總氨基酸的比例以摩爾基準(zhǔn)計(jì)優(yōu)選為50％以上、更優(yōu)選為70％以上。構(gòu)成膜透過性肽基的氨基酸中，除堿性氨基酸以外的氨基酸優(yōu)選為中性氨基酸。需要說明的是，本說明書中提及氨基酸時，只要沒有特別說明，則指α-氨基酸。構(gòu)成膜透過性肽基的氨基酸的數(shù)從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率提高的角度出發(fā)，優(yōu)選為5～30、更優(yōu)選為6～20、最優(yōu)選為7～15。作為膜透過性肽的優(yōu)選的具體例子，可列舉出7～30個精氨酸肽鍵合而成的精氨酸寡聚物、具有g(shù)rkkrrqrrrppq構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱hiv-1tat：序列號1)、具有trqarrnrrrrwrerqr構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱hiv-1rev：序列號2)、具有rrrrnrtrrnrrrvr構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱fhvcoat：序列號3)、具有trrqrtrrarrnr構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱htlv-iirex：序列號4)、具有kltraqrraaarknkrntr構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱ccmvgag：序列號5)等親水性的堿性肽；具有rqikiwfqnrrmkwkk構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱antennapedia：序列號6)、具有kmtraqrraaarrnrwtar構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱bmwgag：序列號7)、具有rqikiwfqnrrmkwkk構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱penetratin：序列號8)、具有naktrrherrrklaier構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱p22n：序列號9)、具有daatatrgrsaasrpterpraparsasrpddpvd構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱vp22：序列號10)等兩親性的堿性肽；具有g(shù)wtlnsagyllgkinlkalaalakkil構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱transportan：序列號11)、具有agyllgkinlkalaalakkil構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱tp-10：序列號12)等疏水性的堿性肽。其中，從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率優(yōu)異的角度出發(fā)，優(yōu)選親水性的堿性肽、更優(yōu)選精氨酸寡聚物。精氨酸寡聚物中，精氨酸的重復(fù)數(shù)優(yōu)選為7～20、更優(yōu)選為7～15、最優(yōu)選為7～10。通式(1)中，x3表示羥基、氨基、碳數(shù)為1～4的烷氧基或芐氧基。作為碳數(shù)為1～4的烷氧基，可列舉出甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、1-甲基丙氧基、叔丁氧基等。從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率的角度出發(fā)，作為x3，優(yōu)選羥基、氨基、叔丁氧基、芐氧基，更優(yōu)選羥基、氨基，最優(yōu)選氨基。在側(cè)鏈具有通式(1)表示的基團(tuán)的高分子化合物中，通式(1)表示的基團(tuán)多個存在時，各通式(1)表示的基團(tuán)的x1、x2、x3及a可以相同也可以不同。[通式(2)表示的基團(tuán)]通式(2)中，x4表示從中性氨基酸或ω-氨基烷酸中除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基，b表示1～50的數(shù)。作為中性氨基酸，可列舉出例如丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、羥基脯氨酸等；作為ω-氨基烷酸，可列舉出3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一烷酸等。作為適用于x4的中性氨基酸，從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率的角度和合成容易性的角度出發(fā)，優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸，更優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸，最優(yōu)選甘氨酸。b優(yōu)選為1～30的數(shù)、更優(yōu)選為1～20的數(shù)、最優(yōu)選為1～10的數(shù)。b為2～50的數(shù)時，x4可以為1種中性氨基酸殘基或ω-氨基烷酸殘基，也可以為選自這些殘基中的2種以上的組合。通式(2)中，x5表示從膜透過性肽中除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基。本發(fā)明的高分子化合物的膜透過性肽殘基可根據(jù)細(xì)胞或粘膜、欲導(dǎo)入的低膜透過性化合物來適當(dāng)選擇，優(yōu)選構(gòu)成膜透過性肽殘基的氨基酸中的至少1個為堿性氨基酸。另外，堿性氨基酸可以是l體或d體中的任一種，也可以根據(jù)細(xì)胞或粘膜、欲導(dǎo)入的低膜透過性化合物來適當(dāng)選擇。作為堿性氨基酸，可列舉出精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、羥基賴氨酸、組氨酸等，其中優(yōu)選含胍基的氨基酸、更優(yōu)選精氨酸。由于膜透過性肽殘基中的堿性氨基酸的比例越高，低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率越高，因此堿性氨基酸與構(gòu)成膜透過性肽的總氨基酸的比例以摩爾基準(zhǔn)計(jì)優(yōu)選為50％以上、更優(yōu)選為70％以上。構(gòu)成膜透過性肽基的氨基酸中，除堿性氨基酸以外的氨基酸優(yōu)選為中性氨基酸。構(gòu)成膜透過性肽基的氨基酸的數(shù)從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率提高的角度出發(fā)，優(yōu)選為5～30、更優(yōu)選為6～20、最優(yōu)選為7～15。作為膜透過性肽的優(yōu)選的具體例子，可列舉出7～30個精氨酸肽鍵合而成的精氨酸寡聚物、具有g(shù)rkkrrqrrrppq構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱hiv-1tat：序列號1)、具有trqarrnrrrrwrerqr構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱hiv-1rev：序列號2)、具有rrrrnrtrrnrrrvr構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱fhvcoat：序列號3)、具有trrqrtrrarrnr構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱htlv-iirex：序列號4)、具有kltraqrraaarknkrntr構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱ccmvgag：序列號5)等親水性的堿性肽；具有rqikiwfqnrrmkwkk構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱antennapedia：序列號6)、具有kmtraqrraaarrnrwtar構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱bmwgag：序列號7)、具有rqikiwfqnrrmkwkk構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱penetratin：序列號8)、具有naktrrherrrklaier構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱p22n：序列號9)、具有daatatrgrsaasrpterpraparsasrpddpvd構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱vp22：序列號10)等兩親性的堿性肽；具有g(shù)wtlnsagyllgkinlkalaalakkil構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱transportan：序列號11)、具有agyllgkinlkalaalakkil構(gòu)成的氨基酸序列的肽(通稱tp-10：序列號12)等疏水性的堿性肽。其中，從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率優(yōu)異的角度出發(fā)，優(yōu)選親水性的堿性肽、更優(yōu)選精氨酸寡聚物。精氨酸寡聚物中，精氨酸的重復(fù)數(shù)優(yōu)選為7～20、更優(yōu)選為7～15、最優(yōu)選為7～10。通式(2)中，x6表示氫原子、碳數(shù)為1～6的烷基、芐基、碳數(shù)為1～6的酰基、芳基磺?；蜓趸驶?。作為碳數(shù)為1～6的烷基，可列舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、仲戊基、叔戊基、己基、仲己基等。作為碳數(shù)為1～6的?；?，可列舉出甲酰基、乙酰基、丙?；?、丁?；?、戊?；?、己?；?。作為芳基磺?；闪信e出對甲苯磺?；?、2-硝基苯磺?；?、三氟乙?；?。作為氧基羰基，可列舉出例如叔丁氧基羰基、芐氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、烯丙基氧基羰基等。從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率的角度出發(fā)，作為x6，優(yōu)選乙?；?、氫原子、甲基、三氟乙酰基，更優(yōu)選乙?；湓?，最優(yōu)選乙?；?。在側(cè)鏈具有通式(2)表示的基團(tuán)的高分子化合物中，通式(2)表示的基團(tuán)多個存在時，各通式(2)表示的基團(tuán)的x4、x5、x6及b可以相同也可以不同。[干高分子]本發(fā)明的接枝型高分子的干高分子沒有特殊限定，從與細(xì)胞或蛋白等水溶性高分子量物質(zhì)的親和性優(yōu)異的角度出發(fā)，優(yōu)選為親水性高分子。這里，親水性高分子是指水溶性高分子或在水中溶脹的高分子。本發(fā)明中，水溶性高分子是指常壓下在25℃的水中以0.1質(zhì)量％以上的量均勻溶解的高分子。作為親水性高分子，可列舉出例如瓜耳膠、瓊脂糖、甘露聚糖、葡甘聚糖、聚葡萄糖、木質(zhì)素、甲殼素、殼聚糖、交叉膠、普魯蘭多糖、硫酸軟骨素、纖維素、半纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、淀粉、陽離子淀粉、糊精的多糖類或多糖類的改性物；白蛋白、酪蛋白、明膠、聚谷氨酰胺酸、聚賴氨酸等水溶性蛋白或水溶性多肽；聚(甲基)丙烯酸、聚(丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基)丙烯酰胺、聚n-乙烯基乙酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(2-氨基乙基(甲基)丙烯酸酯)、(甲基)丙烯酸/丙烯酰胺共聚物、(甲基)丙烯酸/n-異丙基丙烯酰胺共聚物、(甲基)丙烯酸/n-乙烯基乙酰胺共聚物、(甲基)丙烯酸/馬來酸共聚物、(甲基)丙烯酸/富馬酸共聚物、亞乙基/馬來酸共聚物、異丁烯/馬來酸共聚物、苯乙烯/馬來酸共聚物、烷基乙烯基醚/馬來酸共聚物、烷基乙烯基醚/富馬酸共聚物等乙烯基系親水性高分子；水溶性聚氨酯等。從膜透過性肽基在干高分子上的接枝化變得容易的角度出發(fā)，作為干高分子，為在側(cè)鏈具有通式(1)表示的基團(tuán)的高分子化合物時，本發(fā)明的高分子化合物優(yōu)選具有羧基的高分子、更優(yōu)選具有羧基的親水性高分子，進(jìn)一步優(yōu)選具有羧基的單體與不具有羧基的單體的共聚物，最優(yōu)選(甲基)丙烯酸/n-乙烯基乙酰胺共聚物。另外，為在側(cè)鏈具有通式(2)表示的基團(tuán)的高分子化合物時，優(yōu)選具有氨基的高分子、更優(yōu)選具有氨基的親水性高分子、最優(yōu)選殼聚糖。其中，具有氨基或羧基是指，只要屬于在側(cè)鏈具有通式(1)或(2)表示的基團(tuán)之前的干高分子即可。干高分子具有羧基時，具有羧基的單體單元的數(shù)與構(gòu)成的干高分子的單體單元的數(shù)的比例以從易于獲得作為本發(fā)明的高分子化合物優(yōu)選的化合物的觀點(diǎn)等出發(fā)，優(yōu)選為5～80％、更優(yōu)選為10～60％。干高分子具有氨基時，具有氨基的單體單元的數(shù)與構(gòu)成的干高分子的單體單元的數(shù)的比例從易于獲得作為本發(fā)明的高分子化合物優(yōu)選的干高分子的觀點(diǎn)等出發(fā)，優(yōu)選為5～100％、更優(yōu)選為10～100％。其中，上述具有氨基或羧基的單元的比例優(yōu)選屬于在側(cè)鏈具有通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)的前述的干高分子。[本發(fā)明的高分子化合物]本發(fā)明的高分子化合物的特征在于在側(cè)鏈具有通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)。本發(fā)明的高分子化合物中的通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)的比例太低和太高時，由于低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率降低，因此本發(fā)明的高分子化合物中的通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)的數(shù)相對于構(gòu)成的干高分子的單體單元(為多糖類或多糖類的改性物時為單糖單元，為水溶性蛋白或水溶性多肽時為氨基酸單元)的數(shù)，優(yōu)選為0.001～0.9、更優(yōu)選為0.005～0.8、最優(yōu)選為0.01～0.7。本發(fā)明的高分子化合物太小時，本發(fā)明的高分子化合物易于被攝入細(xì)胞內(nèi)，太大時，欲導(dǎo)入的低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率降低，因此本發(fā)明的高分子化合物的重均分子量優(yōu)選為10萬～5000萬、更優(yōu)選為20萬～3000萬、最優(yōu)選為30萬～1000萬。其中，本發(fā)明中，重均分子量是指使用水系溶劑進(jìn)行g(shù)pc分析時的重均分子量，當(dāng)干高分子為多糖類或多糖類的改性物或水溶性蛋白時，是指以普魯蘭多糖換算的重均分子量，當(dāng)干高分子為乙烯基系親水性高分子時，是指以聚乙二醇(peg)或聚氧乙烯(peo)換算的重均分子量。本發(fā)明的高分子化合物與以往已知的在側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子化合物相比，低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率高。推測這可能是由于，以往已知的在側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子化合物(例如參照日本特開2010-100781號公報(bào))中，膜透過性肽與干高分子直接鍵合，而本發(fā)明的高分子化合物中，膜透過性肽與干高分子介由下述通式(1a)或下述通式(2a)表示的基團(tuán)鍵合，由此膜透過性肽殘基的自由度提高。另外，本發(fā)明的高分子化合物中，通過介由下述通式(1a)或下述通式(2a)表示的基團(tuán)，干聚合物的具有膜透過性肽的基團(tuán)的取代與以往已知的在側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子化合物相比，具有在更溫和的條件下、以高的取代率進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)。[化學(xué)式3](式中，x1和a與通式(1)中的含義相同。)[化學(xué)式4](式中，x4和b與通式(2)中的含義相同。)[本發(fā)明的高分子化合物的制造方法]制造本發(fā)明的高分子化合物的方法沒有特殊限定，可以通過將具有通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)的聚合性單體聚合來制造，也可以通過將通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)導(dǎo)入干高分子來制造，從制造容易性的角度出發(fā)，優(yōu)選通過將通式(1)或通式(2)表示的基團(tuán)導(dǎo)入干高分子來制造。干高分子為具有羧基的親水性高分子時，可通過使下述通式(1b)表示的肽化合物的氨基與羧基進(jìn)行肽反應(yīng)來得到。羧基與氨基的反應(yīng)可使用公知的方法，可列舉出例如將羧基用n-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行琥珀酰亞胺酯化后，使氨基反應(yīng)的方法等。另外，干高分子為具有氨基的親水性高分子時，可通過使下述通式(2b)表示的肽化合物的羧基與氨基發(fā)生肽反應(yīng)來得到。通過該方法，作為干高分子的側(cè)鏈，可以介由酰胺鍵最簡單地導(dǎo)入通式(1)或(2)表示的基團(tuán)。但是，通式(1)或(2)表示的基團(tuán)的固定方法并不限定于該法，可以使用通常已知的化學(xué)反應(yīng)來進(jìn)行固定化。[化學(xué)式5](式中，x1、x2、x3和a與通式(1)中的含義相同。)[化學(xué)式6](式中，x4、x5、x6和b與通式(2)中的含義相同。)[低膜透過性化合物]本發(fā)明的高分子化合物通過作為用于將低膜透過性化合物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或粘膜內(nèi)的導(dǎo)入劑使用，能夠?qū)敫鞣N低膜透過性化合物。作為這樣的低膜透過性化合物，可列舉出例如胰島素及胰島素分泌促進(jìn)劑(例如exendin-4、glp-1)等肽-蛋白性藥物、甾體激素、非甾體系鎮(zhèn)痛抗炎癥劑、鎮(zhèn)定劑、抗高血壓藥、缺血性心臟疾病治療藥、抗組胺藥、抗哮喘藥、抗帕金森藥、腦循環(huán)改善藥、制吐劑、抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗凝血藥、抗痛風(fēng)藥、抗真菌藥、抗癡呆藥、干燥綜合征(syndrome)治療藥、麻藥性鎮(zhèn)痛藥、β阻斷藥、β1激動劑、β2激動劑、副交感神經(jīng)激動劑、抗腫瘤藥、利尿藥、抗血栓藥、組胺h1受體拮抗藥、組胺h2受體拮抗藥、抗過敏藥、戒煙輔助藥、維生素等藥物；脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及它們的類似物或衍生物(例如肽核酸(pna)、硫代磷酸酯dna等)等核酸化合物；酶、抗體、糖蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等肽化合物；普魯蘭多糖、支鏈淀粉、糖淀粉、糖原、環(huán)糊精、葡聚糖、羥乙基葡聚糖、甘露聚糖、纖維素、淀粉、海藻酸、甲殼素、殼聚糖、透明質(zhì)酸等多糖衍生物及它們的衍生物等。本發(fā)明的高分子化合物適用的細(xì)胞可以為動物、植物、細(xì)菌等中的任意細(xì)胞，從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率的角度出發(fā)，優(yōu)選人等哺乳類的細(xì)胞。本發(fā)明的高分子化合物適用的粘膜從低膜透過性化合物的導(dǎo)入效率的角度出發(fā)，也優(yōu)選人等哺乳類的細(xì)胞。[細(xì)胞]通過使用本發(fā)明的高分子化合物，可將低膜透過性化合物導(dǎo)入各種細(xì)胞內(nèi)，還可將低膜透過性化合物導(dǎo)入分散在培養(yǎng)液(也稱為液體培養(yǎng)基)等中的細(xì)胞、粘附在固定培養(yǎng)基等中的細(xì)胞、生物體組織的細(xì)胞等任意細(xì)胞。細(xì)胞大致分為形成組織細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等粘附系的細(xì)胞、和血細(xì)胞等游離系的細(xì)胞。對于游離系的細(xì)胞，無法應(yīng)用微注射法或電穿孔法而可以應(yīng)用磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法、病毒載體法等，但它們并不是可滿足導(dǎo)入效率的方法。本發(fā)明的導(dǎo)入方法不僅能夠?qū)⒌湍ね高^性化合物以高的導(dǎo)入效率導(dǎo)入粘附系的細(xì)胞、而且能夠?qū)胗坞x系的細(xì)胞。[導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法]使用本發(fā)明的高分子化合物將低膜透過性化合物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時，可以使含有本發(fā)明的高分子化合物和低膜透過性化合物的水性溶液或水性分散液與細(xì)胞接觸，不需要如使用了病毒載體法或膜透過性肽的以往的導(dǎo)入方法那樣繁雜的前處理，而能夠?qū)?xì)胞的不太產(chǎn)生不良影響地將低膜透過性化合物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。作為使本發(fā)明的高分子化合物和低膜透過性化合物溶解或分散、制成含有它們的水性溶液或水性分散液的水性介質(zhì)，除了蒸餾水、細(xì)胞培養(yǎng)通常使用的培養(yǎng)液以外，可列舉出生理鹽水、5質(zhì)量％葡萄糖水溶液等等滲水，從對細(xì)胞的影響小的角度出發(fā)，優(yōu)選培養(yǎng)液、生理鹽水及5質(zhì)量％葡萄糖水溶液。將細(xì)胞懸浮在水性溶液或水性分散液中時，可以使細(xì)胞懸浮在含有低膜透過性化合物和本發(fā)明的高分子化合物的水性溶液或水性分散液中，也可以根據(jù)需要，將含有這3者的懸浮液攪拌、振蕩。另外，由于細(xì)胞粘附在固體培養(yǎng)基等上或細(xì)胞組織大等理由，無法使細(xì)胞懸浮在水性溶液或水性分散液中時，可以將細(xì)胞浸漬到含有低膜透過性化合物和本發(fā)明的高分子化合物的水性溶液或水性分散液中。將低膜透過性化合物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時，本發(fā)明的高分子化合物的使用濃度沒有特殊限定，優(yōu)選在水性溶液或水性分散液中為0.1μg/ml～10mg/ml。另外，所導(dǎo)入的低膜透過性化合物的濃度也沒有特殊限定，優(yōu)選在水性溶液或水性分散液中為0.5μg/ml～10mg/ml。此外，將細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液或生理鹽水中時的細(xì)胞濃度也沒有限定，優(yōu)選在水性溶液或水性分散液中為1萬～200萬個細(xì)胞/ml。使本發(fā)明的高分子化合物、欲導(dǎo)入的低膜透過性化合物及細(xì)胞這3者共存的時間沒有特殊限定，優(yōu)選為30分鐘～24小時。[粘膜]通過將本發(fā)明的高分子化合物用于粘膜內(nèi)，能夠?qū)⒌湍ね高^性化合物導(dǎo)入各種粘膜內(nèi)。作為粘膜，可列舉出鼻粘膜、口腔粘膜、陰道粘膜、直腸粘膜、眼粘膜、胃粘膜、腸道粘膜等。由于以往的側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子化合物對粘膜的刺激性大，因此例如用于鼻粘膜時，有時會發(fā)癢，但使用本發(fā)明的高分子化合物時該發(fā)癢癥狀減輕。[導(dǎo)入粘膜內(nèi)的方法]使用本發(fā)明的高分子化合物將低膜透過性化合物導(dǎo)入粘膜內(nèi)時，可以使本發(fā)明的高分子化合物與低膜透過性化合物的混合物粘附在粘膜上，只要是該混合物不易從粘膜剝離的劑型，則劑型沒有限定。優(yōu)選的劑型因粘膜的不同而不同，可列舉出例如丸劑、片劑、錠片(troche)、貼劑、栓劑、糊劑等。本發(fā)明的高分子化合物與低膜透過性化合物的混合物根據(jù)劑型，可選擇液狀、乳狀、懸浮狀、凝膠狀、粉末狀、固態(tài)狀等形狀。低膜透過性化合物根據(jù)目的，可以僅導(dǎo)入1種，也可以將2種以上組合。另外，根據(jù)需要，還可以并用賦形劑、乳化劑、分散劑、凝膠化劑、保濕劑等。[小突起陣列的利用]本發(fā)明的高分子化合物無法將低膜透過性化合物經(jīng)由皮膚導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但通過利用小突起陣列(在片材上配置有微細(xì)的突起的藥劑遞送部件。例如us2005025778a1、日本特開2008-006178等)，能夠?qū)⒌湍ね高^性化合物導(dǎo)入皮膚下的細(xì)胞內(nèi)。例如通過將表面涂布有本發(fā)明的高分子化合物與低膜透過性化合物的混合物的小突起陣列、或具有含有本發(fā)明的高分子化合物與低膜透過性化合物的混合物的小突起的小突起陣列貼到皮膚表面，使微細(xì)的突起穿透皮膚，使本發(fā)明的高分子化合物和低膜透過性化合物浸透到皮膚下，由此能夠?qū)⒌湍ね高^性化合物導(dǎo)入皮膚下的細(xì)胞內(nèi)。實(shí)施例以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。其中，只要沒有特殊限定，實(shí)施例中的“份”、“％”是指以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)的單位。<實(shí)施例1>在離子交換水1kg中溶解n-乙烯基乙酰胺/丙烯酸鈉共聚物(商品名：ge160-105、昭和電工公司制)10g，加入強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(商品名：amberlyst15dry、organo公司制)10g，攪拌2小時后，將離子交換樹脂濾除，將濾液濃縮，進(jìn)行冷凍干燥，得到n-乙烯基乙酰胺/丙烯酸共聚物(以下記為ge160-105h)8.6g。在二甲基甲酰胺(dmf)15ml中溶解500mg的ge160-105h。將該溶液冷卻至0℃，添加溶解在5ml的dmf中的1.1g的n-羥基琥珀酰亞胺，進(jìn)而添加溶解在5ml的dmf中的1.96g的二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)，在室溫(25℃)下攪拌24小時進(jìn)行反應(yīng)。將所析出的固體通過過濾濾除，將濾液緩慢滴加到500ml的乙腈中，通過再沉淀，得到琥珀酰亞胺酯化ge160-105(以下記為ge160-105osu)620mg。將20mg的ge160-105osu溶解到0.2ml的dmf中，將通式(1b)中a為4、x1為從甘氨酸除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基、x2為從八精氨酸除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基、x3為氨基的化合物(rssynthesis公司制、商品名：h-(gly)4-(d-arg)8-nh2(純度：90％)，tfasalt)148mg溶解到dmf0.8ml中進(jìn)行混合，在60℃下攪拌24小時，進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，將反應(yīng)溶液加入纖維素透析管(無縫纖維素管，和光純藥公司制)，將管的兩口綁住后，用離子交換水進(jìn)行2日透析。之后，將管的內(nèi)容物進(jìn)行冷凍干燥，得到62mg的實(shí)施例1的高分子化合物。實(shí)施例1的高分子化合物為通式(1)中的x1為從甘氨酸除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基、x2為從八精氨酸除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基、x3為氨基、a為4的化合物。實(shí)施例1的高分子化合物的重均分子量為160萬，從nmr的積分值可知具有下述結(jié)構(gòu)。其中，式中，gly表示甘氨酸殘基、arg表示精氨酸殘基、x：y：z＝70：1：29。[化學(xué)式7]<實(shí)施例2>除了將實(shí)施例1中的h-(gly)4-(d-arg)8-nh2的用量從148mg變更為50mg以外，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，得到54mg的實(shí)施例2的高分子化合物。實(shí)施例2的高分子化合物為通式(1)中的x1為從甘氨酸除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基、x2為從八精氨酸除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基，x3為氨基、a為4的化合物。實(shí)施例2的高分子化合物的重均分子量為160萬，從nmr的積分值可知具有下述結(jié)構(gòu)。其中，式中，gly表示甘氨酸殘基、arg表示精氨酸殘基、x：y：z＝70：15：15。[化學(xué)式8]<實(shí)施例3>將通式(2b)中b為4、x4為從甘氨酸除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基、x5為從八精氨酸除去末端氨基和末端羧基而得到的殘基、x6為乙酰基的化合物(rssynthesis公司制、商品名：ho-(gly)4-(d-arg)8-coch3(純度：90％))150mg溶解到0.5ml的dmf中。添加132mg的n-羥基琥珀酰亞胺后，添加溶解在dmf0.3ml中的230mg的dcc。進(jìn)而添加重均分子量為約10萬的殼聚糖的dmf溶液(100mg/ml)，在室溫(25℃)下攪拌24小時。將反應(yīng)溶液加入纖維素透析管(無縫纖維素管，和光純藥公司制)中，將管的兩口綁住后，用離子交換水進(jìn)行2日透析。之后，對管的內(nèi)容物進(jìn)行冷凍干燥，得到32mg的實(shí)施例2的高分子化合物。實(shí)施例3的高分子化合物的重均分子量為11萬，從nmr的積分值可知具有下述結(jié)構(gòu)。其中，式中，gly表示甘氨酸殘基、arg表示精氨酸殘基、x：y＝80：20。[化學(xué)式9]<比較例1>除了代替h-(gly)4-(d-arg)8-nh2的dmf溶液、使用八精氨酸的末端羧基經(jīng)酰胺化的化合物(glbiochem公司制、商品名：rrrrrrrr-nh2，[r＝d-arg]tfasalt)的dmso溶液(350mg/ml)0.5ml以外，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，得到32mg的比較例1的高分子化合物。比較例1的高分子化合物的重均分子量為160萬，從nmr的積分值可知具有下述結(jié)構(gòu)。其中，式中，arg表示精氨酸殘基、x：y：z＝70：15：15。[化學(xué)式10]<比較例2>按照us2010113559a1的制造例，使用重均分子量為約10萬的殼聚糖，制造比較例2的高分子化合物。比較例2的高分子化合物為具有下述結(jié)構(gòu)的化合物。其中，式中，arg表示精氨酸殘基、x：y＝80：20。[化學(xué)式11]<細(xì)胞>cho細(xì)胞：中國倉鼠卵巣由來細(xì)胞<培養(yǎng)基>ham'sf12培養(yǎng)基(商品名、和光公司制)opti-mem培養(yǎng)基(商品名、lifetechnologies公司制)<試劑>胰蛋白酶/edta溶液：0.25％的胰蛋白酶、1mmol/l的edta水溶液<低膜透過性化合物>fitc-bsa：熒光素標(biāo)記-牛血清白蛋白(sigma-aldrich公司制)<導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的效率>向24孔平板的各孔中播種cho細(xì)胞的ham'sf12培養(yǎng)基懸浮液(2×105個細(xì)胞/ml)500μl，用二氧化碳孵育箱前培養(yǎng)24小時。除去上清的培養(yǎng)基后，添加fitc-bsa的opti-mem培養(yǎng)基溶液(10μg/ml)250μl，進(jìn)而添加實(shí)施例1～3的高分子化合物、或比較例1～2的高分子化合物的opti-mem培養(yǎng)基溶液(100μg/ml)250μl，用二氧化碳孵育箱培養(yǎng)1小時。除去上清的培養(yǎng)基溶液，用磷酸緩沖生理鹽水500μl洗滌2次，然后添加胰蛋白酶/edta溶液100μl，將經(jīng)培養(yǎng)的cho細(xì)胞從平板剝離、使其分散。接著，添加0.08％臺盼藍(lán)溶液100μl、使細(xì)胞懸浮，回收到微量管中。使回收的細(xì)胞懸浮液從細(xì)胞濾網(wǎng)(cellstrainer)通過，用流式細(xì)胞儀測定mfi(平均熒光強(qiáng)度)。另外，將未使用高分子化合物者作為空白。將結(jié)果示于表1。表1mfi實(shí)施例1181實(shí)施例2157實(shí)施例3129比較例1127比較例242.4空白5.64細(xì)胞外的fitc-bsa在臺盼藍(lán)作用下失活而不發(fā)出熒光，僅導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的fitc-bsa發(fā)出熒光。mfi表示單位細(xì)胞的每1個的熒光強(qiáng)度的平均值，因此mfi的值越大，則表示水溶性高分子化合物fitc-bsa越被攝入到細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)表1的結(jié)果可知，實(shí)施例1～3的高分子化合物的水溶性高分子量物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率高。序列表<110>學(xué)校法人常翔學(xué)園；株式會社艾迪科<120>側(cè)鏈具有膜透過性肽的高分子化合物<130>a1507<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>13<212>prt<213>artificialsequence<220><223>hydrophilicbasicpeptide<400>1glyarglyslysargargglnargargargproprogln1510<210>2<211>17<212>prt<213>artificialsequence<220><223>hydrophilicbasicpeptide<400>2thrargglnalaargargasnargargargargtrparggluarggln151015arg<210>3<211>15<212>prt<213>artificialsequence<220><223>hydrophilicbasicpeptide<400>3argargargargasnargthrargargasnargargargvalarg151015<210>4<211>13<212>prt<213>artificialsequence<220><223>hydrophilicbasicpeptide<400>4thrargargglnargthrargargalaargargasnarg1510<210>5<211>19<212>prt<213>artificialsequence<220><223>hydrophilicbasicpeptide<400>5lysleuthrargalaglnargargalaalaalaarglysasnlysarg151015asnthrarg<210>6<211>16<212>prt<213>artificialsequence<220><223>amphiphilicbasicpeptide<400>6argglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplyslys151015<210>7<211>19<212>prt<213>artificialsequence<220><223>amphiphilicbasicpeptide<400>7lysmetthrargalaglnargargalaalaalaargargasnargtrp151015thralaarg<210>8<211>16<212>prt<213>artificialsequence<220><223>amphiphilicbasicpeptide<400>8argglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplyslys151015<210>9<211>17<212>prt<213>artificialsequence<220><223>amphiphilicbasicpeptide<400>9asnalalysthrargarghisgluargargarglysleualaileglu151015arg<210>10<211>34<212>prt<213>artificialsequence<220><223>amphiphilicbasicpeptide<400>10aspalaalathralathrargglyargseralaalaserargprothr151015gluargproargalaproalaargseralaserargproaspasppro202530valasp<210>11<211>27<212>prt<213>artificialsequence<220><223>hydrophobicbasicpeptide<400>11glytrpthrleuasnseralaglytyrleuleuglylysileasnleu151015lysalaleualaalaleualalyslysileleu2025<210>12<211>21<212>prt<213>artificialsequence<220><223>hydrophobicbasicpeptide<400>12alaglytyrleuleuglylysileasnleulysalaleualaalaleu151015alalyslysileleu20當(dāng)前第1頁12