本發(fā)明涉及一種在溶劑中進(jìn)行肽合成的方法、該方法中使用的化合物和實(shí)施肽固相合成方法的裝置，所述溶劑選自由水、醇、水與醇的混合物組成的組。

背景技術(shù)：

肽是氨基酸的連接鏈，代表蛋白質(zhì)的前體。肽和蛋白質(zhì)是所有生命系統(tǒng)的基本組成部分，且涉及各種生命過(guò)程。在醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)中，它們有很多應(yīng)用。因此，對(duì)人類生命來(lái)說(shuō)，合成肽和蛋白質(zhì)的能力非常重要。

因此，肽的合成生產(chǎn)具有重要的意義。肽通過(guò)將一個(gè)氨基酸的羧基(c端)與另一個(gè)氨基酸的氨基或n端偶聯(lián)來(lái)合成。在1963年，merrifield等人介紹了肽固相合成法(spps)，旨在克服與溶液中肽組裝相關(guān)的中間純化問(wèn)題(參見(jiàn)stewart和young的文章，solidphasepeptidesynthesis(piercechemicalco.，2ded，1984)；chan和white的書(shū)籍，fmocsolidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach(oxforduniversitypress,2000))。在固相合成時(shí)，氨基酸連續(xù)偶聯(lián)以產(chǎn)生具有所需序列的肽，而c-端錨定至不溶性的聚合物載體(固相)。一旦組裝好所需的序列，就將肽從固體載體上裂解。

該合成方案需要保護(hù)進(jìn)入的氨基酸的α-氨基以避免自聚合。α-氨基官能團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基是酸不穩(wěn)定的叔丁氧羰基(boc)基團(tuán)、堿不穩(wěn)定的芴甲氧羰基(fmoc)基團(tuán)和烯丙氧羰基(alloc)基團(tuán)；在pd催化的中性條件下，在作為烯丙基系的清除劑的phsih3存在下，α-氨基官能團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基被除去。

根據(jù)上述三種α-氨基保護(hù)方案中的任一種肽固相合成法通常需要額外保護(hù)組成氨基酸的反應(yīng)性側(cè)鏈免于不想要的化學(xué)轉(zhuǎn)化。因此，必要的是，這些保護(hù)基對(duì)偶聯(lián)循環(huán)期間使用的試劑具有抗性。此外，對(duì)于α-氨基脫保護(hù)和鏈組裝的條件，生長(zhǎng)肽與固相載體的連接必須是穩(wěn)定的。

在基于fmoc的α-氨基保護(hù)的情況下，側(cè)鏈基團(tuán)應(yīng)該對(duì)用于除去fmoc部分的堿性試劑具有抗性。在組裝肽鏈后，通常采用溫和的酸性試劑除去側(cè)鏈保護(hù)基。在組裝所需的肽鏈之后，通常采用無(wú)水hf、三氟甲磺酸或三氟乙酸(tfa)裂解這些側(cè)鏈保護(hù)基。

通常在極性非質(zhì)子有機(jī)溶劑，例如二甲基甲酰胺(dmf)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲基亞砜(dmso)和二氯甲烷(dcm)，或這些有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行肽組裝程序，因?yàn)榫哂袕?qiáng)疏水性的α-氨基保護(hù)基fmoc和boc不溶解于水并且經(jīng)常用于spps中。此外，在spps中，通常使用的側(cè)鏈保護(hù)基通常是疏水性的，并且使氨基酸不溶解于水中。

應(yīng)用fmoc和boc保護(hù)的spps方法得到了廣泛使用，但需要上文提及的昂貴且有毒的有機(jī)溶劑。例如，dmf具有相當(dāng)大的健康和環(huán)境隱患，它與人類的癌癥有關(guān)，且它被懷疑會(huì)引起出生缺陷。因此，使用這些有毒溶劑需要特殊的技術(shù)設(shè)備和預(yù)防措施，例如，在通風(fēng)櫥下進(jìn)行反應(yīng)，和由高度專業(yè)化的人員進(jìn)行處理。此外，處理使用過(guò)的溶劑是存在問(wèn)題的且昂貴的。因此，使用有機(jī)溶劑的spps是昂貴的，且受限于具有用于有機(jī)化學(xué)合成的專用設(shè)備的專業(yè)化實(shí)驗(yàn)室。

因此，為了避免上文提及的問(wèn)題，基于水的肽合成方案，特別是spps，是非常令人滿意的。

為了嘗試克服這個(gè)問(wèn)題，hojo等人提出了使用水溶性保護(hù)基(chem.pharm.bull.2004,52,422-427和tetrahedronlett.2004,45,9293)。為此目的，他們開(kāi)發(fā)了幾種保護(hù)基，其中有2-(苯基(甲基)磺?；?乙氧基羰基四硫代硼酸酯(pms)、乙磺?；已趸驶?esc)和2-(4-磺基苯基磺?；?乙氧基羰基(sps)。在wo2013115813a1中，cem公司聲稱了α，β-不飽和砜在水或水體系中的脫保護(hù)及它們?cè)诨谒膕pps中的用途。

然而，上文提及的保護(hù)基具有幾個(gè)主要缺點(diǎn)：它們受限制的穩(wěn)定性(例如對(duì)于pms)，它們的中等溶解度(esc)以及它們昂貴且復(fù)雜的合成和受限制的可用性，例如，因?yàn)樗鼈兊牧蚧鶊F(tuán)發(fā)生自動(dòng)氧化(sps)，排除了半胱氨酸和甲硫氨酸。作為第二考慮因素，這些α-胺保護(hù)基不顯示出選擇性吸收、uv或熒光信號(hào)，這些選擇性吸收、uv或熒光信號(hào)可用于檢測(cè)偶聯(lián)氨基酸的量，或用于提供脫保護(hù)進(jìn)行程度的指示。與傳統(tǒng)的fmoc基團(tuán)不同，pms和esc在傳統(tǒng)的uv監(jiān)測(cè)中無(wú)法跟蹤。sps可以通過(guò)uv被監(jiān)測(cè)，但是sps的復(fù)雜和昂貴的合成往往會(huì)影響其使用。結(jié)果，這些化合物的水溶性增加不足以解決基于水的spps在整體上的問(wèn)題。

因此，本發(fā)明的目的是提供一種大體上用于肽合成的水相容性反應(yīng)體系的改進(jìn)方法和裝置，特別是固相肽合成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在基于水的肽合成期間，適于在肽和/或氨基酸的官能團(tuán)上形成保護(hù)基的保護(hù)劑，其中待保護(hù)的官能團(tuán)優(yōu)選選自胺、醇、巰基(thiol)和羧基，其中保護(hù)劑包含

i.一主鏈結(jié)構(gòu)，

ii.至少一個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)和

iii.至少一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，

-其中主鏈結(jié)構(gòu)包含一部分(moiety)，所述部分選自由9-甲基芴、叔丁烷和/或苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷，優(yōu)選地，主鏈結(jié)構(gòu)由這樣的部分組成，

-其中水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)選自由so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、cn、oso3^-酯、opo3^2-酯及它們的組合組成的組，和

-其中水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到主鏈結(jié)構(gòu)上。

本發(fā)明還涉及所述化合物的用途，用于在化學(xué)反應(yīng)中保護(hù)官能團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，在基于水的肽合成期間，試劑用于在肽和/或氨基酸的官能團(tuán)上形成保護(hù)基。優(yōu)選地，待保護(hù)的官能團(tuán)優(yōu)選選自胺、醇、巰基和羧基。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)選自帶電的官能團(tuán)so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯和n(ch3)3⁺。已證明了使用帶電官能團(tuán)作為水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)有益于提高水溶性，其比不帶電的官能團(tuán)更有效。保護(hù)劑可以包含一個(gè)或多個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)，在優(yōu)選的實(shí)施例中，保護(hù)劑包含不止一個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例中，保護(hù)劑包含至少兩個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)。在其它優(yōu)選實(shí)施例中，保護(hù)劑包含1至8個(gè)、2至7個(gè)或3至4個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于水溶性增加到更大的程度，具有不止一個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)的保護(hù)劑分子可能是有益的。在實(shí)施例中，主鏈結(jié)構(gòu)是叔丁烷或苯基甲烷的一個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)可能是足夠的。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，保護(hù)劑包含全部是相同種類(特別是全部是so3^-類型)的水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)。在可選的實(shí)施例中，保護(hù)劑包含不同種類的水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)。只要水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)為so3^-，保護(hù)劑優(yōu)選包含這些官能團(tuán)中的至少2個(gè)。如果水溶性增強(qiáng)功能團(tuán)全部都是相同的種類，保護(hù)劑的合成可以更高效和更容易。

主鏈結(jié)構(gòu)包含一部分，所述部分選自由9-甲基芴、叔丁烷和/或苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷組成的組。在優(yōu)選的實(shí)施例中，主鏈結(jié)構(gòu)選自9-甲基芴和叔丁烷。

反應(yīng)基團(tuán)是合適的，即具有所需的化學(xué)反應(yīng)性，以與待保護(hù)的官能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。其優(yōu)選選自由氧羰基鹵化物、氧羰基o-琥珀酰亞胺、氧羰基氧基酯(oxycarbonyloxymaester)、氧羰基酸酐、鹵化物、氧甲基鹵化物、羥化物和巰基基團(tuán)組成的組。當(dāng)主鏈結(jié)構(gòu)為9-甲基芴時(shí)，反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選選自氧羰基鹵化物、氧羰基氧基酯和氧羰基o-琥珀酰亞胺。當(dāng)主鏈結(jié)構(gòu)為叔丁烷時(shí)，反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選選自羥化物、鹵化物、巰基、氧羰基o-琥珀酰亞胺和氧羰基酸酐。當(dāng)主鏈結(jié)構(gòu)選自苯基甲烷、二苯基甲烷和三苯基甲烷時(shí)，反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選選自鹵化物、氧甲基鹵化物和氧羰基鹵化物。

本發(fā)明中，具有9-甲基芴主鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)選保護(hù)劑可以通過(guò)以下通式1來(lái)說(shuō)明：

通式1

其中，r1至r8獨(dú)立地選自氫、so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn，條件是，r1至r8中的至少一個(gè)(優(yōu)選至少兩個(gè))選自so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r8中不是so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯或cn的，全部都是氫。

r99優(yōu)選選自由氧羰基鹵化物、氧羰基o-琥珀酰亞胺、氧羰基氧基酯、氧羰基酸酐、鹵化物、氧甲基鹵化物、羥化物和巰基基團(tuán)組成的組，其中r99優(yōu)選選自氧羰基鹵化物、氧羰基氧基酯和氧羰基o-琥珀酰亞胺。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r2和r7選自so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn，特別地，r2和r7是so3^-。優(yōu)選地，r1、r3至r6和r8都是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r3和r6選自so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn，特別地，r3和r6是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4、r5、r7和r8都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r2和r6選自so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn，特別地，r2和r6是so3^-。優(yōu)選地，r1、r3、r4、r5、r7和r8都是氫。

本發(fā)明中，具有9-甲基芴主鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)選保護(hù)劑如下表1所示。表中列出的化合物決不限制本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明，它們構(gòu)成說(shuō)明性和優(yōu)選的保護(hù)劑。

表1

本發(fā)明中，具有叔丁烷主鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)選保護(hù)劑可以用以下通式2來(lái)說(shuō)明：

通式2

其中r1選自so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn。在優(yōu)選實(shí)施例中，r1是so3^-。r99優(yōu)選選自由氧羰基鹵化物、氧羰基o-琥珀酰亞胺、氧羰基酸酐、鹵化物、氧甲基鹵化物、羥化物和巰基基團(tuán)組成的組，其中更優(yōu)選地，r99選自羥化物、鹵化物、巰基、氧羰基o-琥珀酰亞胺和氧羰基酸酐。

本發(fā)明中，具有叔丁烷主鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)選保護(hù)劑如下表2所示。表中列出的化合物決不限制本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明，它們構(gòu)成說(shuō)明性和優(yōu)選的保護(hù)劑。

表2

本發(fā)明中，具有苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷主鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)選保護(hù)劑可以分別用以下通式3、4或5來(lái)說(shuō)明：

通式3

其中，r1至r5獨(dú)立地選自氫、so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn，條件是，r1至r5中的至少一個(gè)(優(yōu)選至少兩個(gè))選自so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r5中不是so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯或cn的，全部都是氫。

r99優(yōu)選選自由氧羰基鹵化物、氧羰基氧基酯、氧羰基o-琥珀酰亞胺、氧羰基酸酐、鹵化物、氧甲基鹵化物、羥化物和巰基組成的組，其中更優(yōu)選地，r99選自鹵化物、氧甲基鹵化物和氧羰基鹵化物。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3選自so3^-、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、oso3^-酯、opo3^2-酯和cn，特別地，r3是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4和r5都是氫。

通式4

其中，r1至r10獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r10中的至少一個(gè)(優(yōu)選至少兩個(gè))選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r10中不是so3^-、po3^2-、n(ch3)2、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

r99優(yōu)選選自由氧羰基鹵化物、氧羰基氧基酯、氧羰基o-琥珀酰亞胺、氧羰基酸酐、鹵化物、氧甲基鹵化物、羥化物和巰基基團(tuán)組成的組，其中更優(yōu)選地，r99選自鹵化物、氧甲基鹵化物和氧羰基鹵化物。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3和r8選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3和r8選自so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9和r10都是氫。

通式5

其中，r1至r15獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r15中的至少一個(gè)(優(yōu)選至少兩個(gè)、最優(yōu)選的是至少三個(gè))選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r15中不是so3^-、po3^2-、n(ch3)2、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

r99優(yōu)選選自由氧羰基鹵化物、氧羰基氧基酯、氧羰基o-琥珀酰亞胺、氧羰基酸酐、鹵化物、氧甲基鹵化物、羥化物和巰基基團(tuán)組成的組，其中更優(yōu)選地，r99選自鹵化物、氧甲基鹵化物和氧羰基鹵化物。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)r3、r8和r13是so3^-時(shí)，r99不是鹵化物。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)r3、r8和r13是so3^-時(shí)，r99不是氯化物。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r99優(yōu)選選自由氧羰基鹵化物、氧羰基氧基酯、氧羰基o-琥珀酰亞胺、氧羰基酸酐、氧甲基鹵化物、羥化物和巰基基團(tuán)組成的組。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，r99不是鹵化物，尤其不是氯化物。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3、r8和r13選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3、r8和r13是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9至r12、r14和r15都是氫。

本發(fā)明中，具有苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷主鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)選保護(hù)劑如下表3所示。表中列出的化合物決不限制本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明，它們構(gòu)成說(shuō)明性和優(yōu)選的保護(hù)劑。

表3

本發(fā)明還涉及用于保護(hù)化學(xué)反應(yīng)中官能團(tuán)的保護(hù)劑的用途。優(yōu)選地，官能團(tuán)存在于氨基酸、肽或蛋白質(zhì)上，所述化學(xué)反應(yīng)是在溶劑中的肽或蛋白質(zhì)合成，所述溶劑選自水、醇，或水和醇的混合物。

方法

本發(fā)明涉及一種肽合成方法，其包括以下步驟：使第一氨基酸或第一肽與α-胺受保護(hù)的第二氨基酸或第二肽在溶劑中反應(yīng)，所述溶劑選自由水、醇，和水與醇的混合物組成的組，并采用脫保護(hù)溶液除去α-胺保護(hù)基，其特征在于，α-胺保護(hù)基是本文所描述的其中一種保護(hù)劑與第二氨基酸或第二肽的α-胺官能團(tuán)的反應(yīng)產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施例中，α-胺保護(hù)基是以下式6至式10中的至少一種。在每種情況下，以下通式所示的氮屬于受保護(hù)的氨基：

通式6

其中，r1至r15獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r15中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，最優(yōu)選的是r1至r15中的至少三個(gè)選自so3^-、po3^2-、n(ch3)2、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r15中不是so3^-、po3^2-、n(ch3)2、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3、r8和r13選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3、r8和r13是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9至r12、r14和r15是氫。

通式7

其中r1至r8獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r8中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r8中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r2和r7選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r2和r7是so3^-。優(yōu)選地，r1、r3至r6和r8是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r3和r6選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3和r6是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4、r5、r7和r8是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r2和r6選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r2和r6是so3^-。優(yōu)選地，r1、r3、r4、r5、r7和r8是氫。

通式8

其中，r1至r5獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r5中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r5中不是so3^-、po3^2-、n(ch3)2、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4和r5是氫。

通式9

其中，r1至r10獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r10中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r10中不是so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3和r8選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3和r8選自so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9和r10是氫。

通式10

其中r1選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選實(shí)施例中，r1是so3^-。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，α-胺保護(hù)基是9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基或叔丁基-(2-磺酸酯)氧羰基(sboc)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“smoc”表示9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基或9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基。

與現(xiàn)有技術(shù)中的受保護(hù)的氨基酸或肽相比，根據(jù)本發(fā)明的受保護(hù)的氨基酸和肽，尤其是smoc和sboc保護(hù)的氨基酸，其結(jié)構(gòu)更易溶解于水中，尤其是fmoc和boc保護(hù)的氨基酸。原因是，本發(fā)明將水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)加入到保護(hù)劑中，尤其是磺基(so3^-)基團(tuán)。因此，本發(fā)明的其中一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是利用以其受保護(hù)形式溶解于水的氨基酸和/或肽，以及僅使用水、僅使用醇或僅使用水-醇混合物用于肽合成的能力，即不使用其它溶解增強(qiáng)添加劑且不需要使用有毒溶劑。在含溶劑的無(wú)毒的水和/或醇中進(jìn)行的肽合成提供了用于制藥和生物應(yīng)用的各種優(yōu)點(diǎn)。

優(yōu)選的溶劑是水，以及水-醇混合物，水是最優(yōu)選的溶劑。優(yōu)選的醇是甲醇、乙醇、異丙醇、2-丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、叔丁醇或其混合物。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“以其受保護(hù)形式溶解于水”是指組合物具有在水性溶劑體系中進(jìn)行所需反應(yīng)所必需的溶解度的程度。如在任何組合物的情況下，術(shù)語(yǔ)“溶解”并不意味著任何或所有量的無(wú)限溶解度。

適合使用于本發(fā)明的脫保護(hù)溶液優(yōu)選包含酸或堿，優(yōu)選是水溶性的酸或堿，即酸和/或堿優(yōu)選是水溶性的。優(yōu)選的酸是磷酸、鹽酸或三氟乙酸。優(yōu)選的堿是胺和氨。優(yōu)選的脫保護(hù)溶液是胺和/或氨水溶液。堿的使用量達(dá)到使官能團(tuán)脫保護(hù)所必需的程度。某些有機(jī)堿的溶解度可能會(huì)限制可以溶解于水、醇，或水與醇混合物中的量。合適的堿是具有一溶解度的堿，該溶解度允許溶解足夠量以在所選擇的溶劑中進(jìn)行脫保護(hù)。

用于脫保護(hù)sboc基團(tuán)的脫保護(hù)溶液優(yōu)選包含水溶性酸，例如磷酸、鹽酸或三氟乙酸。

用于脫保護(hù)smoc基團(tuán)的脫保護(hù)溶液優(yōu)選包含水溶性堿，例如胺或氨。水溶性堿的使用量達(dá)到使肽脫保護(hù)所必需的程度。某些有機(jī)堿的溶解度可能會(huì)限制可以溶解于水、醇，或水與醇混合物中的量。合適的堿是具有一溶解度的堿，該溶解度允許溶解足夠量以在所選擇的溶劑中進(jìn)行脫保護(hù)。

應(yīng)當(dāng)理解的是，在脫保護(hù)后，可以使用其它氨基酸或其它肽重復(fù)反應(yīng)和脫保護(hù)步驟，其中所述其它氨基酸和/或其它肽的α-氨基優(yōu)選采用根據(jù)本發(fā)明的保護(hù)基保護(hù)，尤其是smoc基團(tuán)或sboc基團(tuán)，直到獲得所需的靶肽。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，采用側(cè)鏈保護(hù)基保護(hù)所述第一氨基酸或第一肽和/或所述第二氨基酸或第二肽的任何反應(yīng)性側(cè)鏈官能團(tuán)，其優(yōu)選包含至少一個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)。側(cè)鏈保護(hù)基可以包含磺酸基或磺酸酯。該方法優(yōu)選包含除去側(cè)鏈保護(hù)基的步驟。側(cè)鏈保護(hù)基的水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)為側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸或肽提供水溶性。合適的側(cè)鏈保護(hù)基是上述其中一種保護(hù)劑與氨基酸或肽的相應(yīng)側(cè)鏈官能團(tuán)的反應(yīng)產(chǎn)物。

關(guān)于側(cè)鏈保護(hù)基，優(yōu)選的胺保護(hù)基是以下式11至式15所示的那些胺保護(hù)基，其中氮屬于受保護(hù)的氨基。

通式11

其中，r1至r15獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r15中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，最優(yōu)選的是r1至r15中至少三個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r15中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3、r8和r13選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3、r8和r13是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9至r12、r14和r15是氫。

通式12

其中r1至r8獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r8中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r8中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r2和r7選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r2和r7是so3^-。優(yōu)選地，r1、r3至r6和r8是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3和r6選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3和r6是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4、r5、r7和r8是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r2和r6選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r2和r6是so3^-。優(yōu)選地，r1、r3、r4、r5、r7和r8是氫。

通式13

其中r1至r5獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r5中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r5中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4和r5是氫。

通式14

其中r1至r10獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r10中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r10中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3和r8選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3和r8選自so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9和r10是氫。

通式15

其中r1選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選實(shí)施例中，r1是so3^-。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，側(cè)鏈胺保護(hù)基選自9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基、三(4-磺苯基)甲基(sulfotrt)、叔丁基-(2-磺酸基)氧羰基(sboc)和4-磺基-芐氧羰基(sulfocbz)。

優(yōu)選的醇保護(hù)基如以下式16至式19所示：

通式16

其中，r1至r5獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r5中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r5中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4和r5是氫。

通式17

其中，r1至r5獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r5中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r5中不是so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4和r5是氫。

通式18

其中r1選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選實(shí)施例中，r1是so3^-。

通式19

其中，r1至r15獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r15中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，最優(yōu)選的是r1至r15中的至少三個(gè)，選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r15中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3、r8和r13選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3、r8和r13是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9至r12、r14和r15是氫。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，醇保護(hù)基選自4-磺芐基(bzs)、4-磺基-芐氧基甲基(boms)、三(4-磺苯基)甲基(sulfotrt)和叔丁基-1-磺酸酯基(tbus)。

優(yōu)選的巰基保護(hù)基如式20和式21所示：

通式20

其中，r1至r15獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r15中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，最優(yōu)選的是r1至r15中的至少三個(gè)，選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選實(shí)施例中，r1至r15中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3、r8和r13選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3、r8和r13是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9至r12、r14和r15是氫。

通式21

其中r1選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選實(shí)施例中，r1是so3^-。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，巰基保護(hù)基選自三(4-磺苯基)甲基(sulfotrt)和1-磺基-2-甲基-2-丙硫醇基(stbus)。

優(yōu)選的羧基保護(hù)基是下式22至式25所示的那些保護(hù)基：

通式22

其中，r1至r15獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r15中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，最優(yōu)選的是r1至r15中的至少三個(gè)，選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r15中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r3、r8和r13選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3、r8和r13是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4至r7、r9至r12、r14和r15是氫。

通式23

其中r1選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選實(shí)施例中，r1是so3^-。

通式24

其中，r1至r5獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r5中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r5中不是so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r3選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4和r5是氫。

通式25

其中，r1至r5獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r5中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r5中不是so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r3選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4和r5是氫。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，羧基保護(hù)基選自4-磺芐基(bzs)、4-磺基-芐氧基甲基(boms)、三(4-磺苯基)甲基(sulfotrt)和叔丁基-1-磺酸酯基(tbus)。

以下是最優(yōu)選的保護(hù)基的概覽。

在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施例中，該方法是固相肽合成的改進(jìn)，其中所述第一氨基酸或第一肽的c-端錨定于不溶性載體，其優(yōu)選是聚合的。通過(guò)使用不溶性載體，將生長(zhǎng)肽的中間純化工作最小化。每個(gè)反應(yīng)步驟之后，通過(guò)在溶劑中洗滌錨定的肽可以容易地進(jìn)行純化，所述溶劑優(yōu)選選自水、醇，以及水與醇的混合物。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包含當(dāng)肽完整時(shí)，采用裂解組合物從聚合物載體上裂解所得到的肽的步驟。

合適的裂解組合物和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，采用酸，如三氟乙酸和氫氟酸(hf)進(jìn)行裂解步驟。優(yōu)選地，適合用于從聚合物載體上裂解所需肽的酸會(huì)同時(shí)除去連接到靶肽的氨基酸上的側(cè)鏈保護(hù)基。

優(yōu)選地，在清除劑組合物(例如水、苯酚、dtt、三乙基硅烷和苯甲醚)的存在下進(jìn)行裂解，其保護(hù)肽在裂解步驟期間和之后免于發(fā)生不希望的副反應(yīng)。技術(shù)人員可以針對(duì)存在的保護(hù)基選擇合適的清除劑。

可以通過(guò)過(guò)濾將裂解的肽與裂解的載體(例如樹(shù)脂)分離，然后可以通過(guò)常規(guī)步驟，例如蒸發(fā)或溶劑驅(qū)動(dòng)的沉淀從濾液中回收肽。

在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施例中，α-胺保護(hù)基包含熒光結(jié)構(gòu)，尤其是9-甲基芴主鏈結(jié)構(gòu)，該方法還包含通過(guò)測(cè)量熒光來(lái)監(jiān)測(cè)肽鍵形成程度和/或監(jiān)測(cè)去除α-胺保護(hù)基的程度，所述熒光由與第一氨基酸或第一肽偶聯(lián)的α-胺保護(hù)基產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施例中，包含9-甲基芴主鏈結(jié)構(gòu)的保護(hù)基是9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基或9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基。

在固相肽合成中，在采用uv光照射載體后，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度的變化和測(cè)量由熒光保護(hù)基產(chǎn)生的熒光來(lái)監(jiān)測(cè)肽鍵的形成程度和/或監(jiān)測(cè)熒光保護(hù)基(例如smoc)的去除程度，所述熒光保護(hù)基通過(guò)第一氨基酸或第一肽與不溶性載體材料偶聯(lián)。

令人驚奇地觀察到，含有9-甲基芴的保護(hù)基，例如9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基和9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基，具有固有的熒光性質(zhì)。這些保護(hù)基的熒光性質(zhì)在脫保護(hù)和偶聯(lián)反應(yīng)中的任一個(gè)或兩者完成之后提供了監(jiān)測(cè)的機(jī)會(huì)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例中，保護(hù)劑和相應(yīng)的保護(hù)基含有兩個(gè)或更多個(gè)連接到芳香族芴基環(huán)系上的磺基，所述芳香族芴基環(huán)系例如9-(3,6-二磺基)芴基甲氧基-羰基和9-(2,7-二磺基)芴基甲氧基-羰基。在這些化合物中，與在spps期間逐步組裝肽期間使用的常用試劑相比，連接到芳香族芴基環(huán)系上的兩個(gè)或多個(gè)磺基(so3^-)基團(tuán)是獨(dú)特的。這些化合物，例如smoc，可以通過(guò)其固有的熒光來(lái)監(jiān)測(cè)，以便確定在每個(gè)反應(yīng)步驟的終點(diǎn)所存在的化合物的量。

可以使用載體上的熒光基團(tuán)(例如smoc)的證據(jù)來(lái)確定熒光地受保護(hù)的氨基酸的成功偶聯(lián)，以便決定是否必須重復(fù)偶聯(lián)步驟以基本上完成肽鍵的形成。同樣地，載體上的熒光基團(tuán)的證據(jù)可用于確定在脫保護(hù)步驟的終點(diǎn)的熒光基團(tuán)的不完全去除，以便確定是否必須重復(fù)脫保護(hù)步驟以基本上完成熒光保護(hù)基的去除。

通常，第一氨基酸或第一肽與α-胺保護(hù)的第二氨基酸或第二肽反應(yīng)的偶聯(lián)步驟包含添加入偶聯(lián)劑。

本發(fā)明還涉及適合使用于本發(fā)明方法的偶聯(lián)劑。典型的偶聯(lián)劑選自由碳二亞胺和三唑組成的組。優(yōu)選的碳二亞胺是二異丙基碳二亞胺(dic)、二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)、2-(((乙基亞氨基)亞甲基)氨基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(esc)和2,2'-(亞甲基雙(氮雜亞基))雙(2-甲基丙烷-1-磺酸酯)(2,2’-(methanediylidenebis(azanylylidene))bis(2-methylpropane-1-suofonate))(dsc)。優(yōu)選的三唑是o-苯并三唑基-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、2-(1h-苯并三唑-]-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)、boc-組氨酸(甲苯磺酰)；b01'和b01'-cl、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯(pybob)和1-羥基苯并三唑(hobt)。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，偶聯(lián)劑包含磺酸基?；撬峄黾恿伺悸?lián)劑在含水的溶劑中的溶解度，并允許后續(xù)通過(guò)陰離子交換來(lái)分離偶聯(lián)劑。

優(yōu)選的偶聯(lián)劑是下式26至式30所示的偶聯(lián)劑：

通式26

其中r1優(yōu)選選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r1是so3^-。r2優(yōu)選選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r2是so3^-。r1和r2可以相同或不同。

通式27

其中r1選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r1是so3^-。r66優(yōu)選選自短鏈烷基，優(yōu)選的是c1至c8烷基，更優(yōu)選的是c1至c4烷基。

通式28

其中r1選自so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r1是so3^-。

通式29

其中r1選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r1是so3^-。

通式30

其中，r1至r4獨(dú)立地選自氫、so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，條件是，r1至r4中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn。在優(yōu)選的實(shí)施例中，r1至r4中不是so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺或cn的，全部都是氫。

在優(yōu)選實(shí)施例中，r3選自so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-、n(ch3)2、n(ch3)3⁺和cn，特別地，r3是so3^-。優(yōu)選地，r1、r2、r4和r5是氫。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，r50選自一個(gè)或多個(gè)羥基或下述式30.1至30.4中給出的其中一個(gè)取代基，其中b表示通式30的結(jié)構(gòu)：

通式30.1

通式30.2

通式30.3

通式30.4

特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑選自由2-(((乙基亞氨基)亞甲基)氨基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(esc)、2,2'-(亞甲基雙(氮雜亞基))雙(2-甲基丙烷-1-磺酸酯)(dsc)和2-((((3-(二甲基氨基)丙基)亞氨基)亞甲基)氨基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(mpsc)組成的組，以及是n-羥基磺基琥珀酰亞胺(sulfo-nhs)和2-(2-氰基-2-(羥基亞氨基)乙酰氧基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(cyms)。

其中r選自c1至c8烷基，優(yōu)選是c1至c4烷基。

通式31(esc)

通式32(dsc)

通式33(mpsc)

通式34(cyms)

偶聯(lián)步驟還可以包含加入封端劑。所描述的封端劑及其在肽合成方法中用于封端游離胺的用途形成本發(fā)明的獨(dú)立部分。封端劑可用于本發(fā)明的方法中，但它們也可用于肽合成的其它方法中。封端劑有益于促進(jìn)所得產(chǎn)品組合物的簡(jiǎn)單、安全和經(jīng)濟(jì)有效的純化。封端劑允許在偶聯(lián)步驟之后封端游離胺，以防止副產(chǎn)物的形成，其中封端劑包含

i.一主鏈結(jié)構(gòu)，

ii.至少一個(gè)水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)和

iii.至少一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，

-其中主鏈結(jié)構(gòu)包含一部分，所述部分選自短鏈烷基，優(yōu)選是c1至c8烷基、環(huán)烷基鏈或芳香族化合物，更優(yōu)選的是c1至c4烷基或芐基，

-其中所述水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)選自由so3^-、po3^2-、oso3^-酯、opo3^2-酯、n(ch3)2、n(ch3)3⁺、cn及其組合組成的組，以及

-其中水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到主鏈結(jié)構(gòu)上。

反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選選自由羧酸、羧酸鹵化物、羧酸o-琥珀酰亞胺、羧酸氧甲酯(carboxylicacidoxymaester)、羧酸酐、鹵化物和巰基基團(tuán)組成的組。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明，在肽合成方法中添加入封端劑。在可選的實(shí)施例中，封端劑在肽合成的另一方法中加入，該另一方法包括以下步驟：使第一氨基酸或第一肽與α-胺受保護(hù)的第二氨基酸或第二肽在溶劑中反應(yīng)，以及采用脫保護(hù)溶液去除α-胺保護(hù)基，其特征在于，將封端劑添加到反應(yīng)混合物中，用于封端游離胺。封端劑選自上述的那些封端劑。反應(yīng)完成后，使反應(yīng)混合物通過(guò)親和層析柱，以純化反應(yīng)混合物。親和層析柱優(yōu)選選自陰離子或陽(yáng)離子交換柱。

在偶聯(lián)后，水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)使純化容易。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，封端劑包含磺基。

優(yōu)選的封端劑是2-磺基乙酸或4-磺基苯甲酸。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法還包括至少一個(gè)沖洗步驟，所述沖洗步驟使用選自由水、醇，和水與醇的混合物組成的組的溶劑，以及收集在沖洗步驟中獲得的廢液的步驟，將廢液與親和層析柱接觸，優(yōu)選固體陰離子和/或陽(yáng)離子交換載體，從而保留廢棄化合物中的水溶性增強(qiáng)官能團(tuán)，尤其是帶電官能團(tuán)，例如so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-和n(ch3)3⁺。使用陰離子交換載體除去含有至少一個(gè)磺基的化合物是特別有效的。隨后，可以通過(guò)再生親和層析柱，優(yōu)選是固體陰離子和/或陽(yáng)離子交換載體來(lái)收集廢棄化合物，并處理?；蛘?，可以處理親和層析柱，優(yōu)選是含有廢棄化合物的陰離子和/或陽(yáng)離子交換載體材料。

沖洗步驟通常在偶聯(lián)步驟之后和脫保護(hù)步驟之后進(jìn)行。陰離子和/或陽(yáng)離子交換步驟允許除去所有含磺基的化合物，例如未反應(yīng)或裂解的保護(hù)基和試劑，例如，如本文所述的來(lái)自沖洗溶液的偶聯(lián)劑和封端劑。廢棄化合物保留在陰離子或陽(yáng)離子交換柱上，得到純化的溶劑。保留的化合物可以與陰離子交換材料或陽(yáng)離子交換材料一起處理，也可以在洗脫之后處理，且只需處理最少量的化學(xué)廢棄物。

在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例中，所述方法還包括在裂解步驟之后的純化步驟，其中將含有脫保護(hù)的和裂解的靶蛋白或肽的溶液與親和層析柱接觸，優(yōu)選固體陰離子和/或陽(yáng)離子交換載體，從而保留廢棄化合物例如包含磺基的廢棄化合物，并收集純化的靶蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施例中，廢棄化合物包含至少一個(gè)作為保護(hù)基和其它試劑的一部分的磺基。由于有含磺基保護(hù)基和含磺基試劑，可以通過(guò)親和層析柱(優(yōu)選是離子交換方法)基本上除去在溶劑中的偶聯(lián)、脫保護(hù)和裂解反應(yīng)期間產(chǎn)生的過(guò)量化學(xué)物質(zhì)和副產(chǎn)物，所述溶劑選自水、醇，和水與醇的混合物組成的組。當(dāng)然，這也適用于其它帶電官能團(tuán)。只有靶肽才能夠穿過(guò)離子交換柱，而肽副產(chǎn)物、保護(hù)基殘留物和過(guò)量的試劑保留在柱上。在柱再生后，僅有最少量的化學(xué)廢棄物必需處理。這是使用帶電官能團(tuán)，例如so3^-、oso3^-酯、opo3^2-酯、po3^2-和n(ch3)3⁺的有益效果。但是，即使使用一個(gè)或多個(gè)不帶電的官能團(tuán)，該方法仍然可以在水中進(jìn)行，從而減少?gòu)U棄化學(xué)品的量(與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比)。

本發(fā)明的優(yōu)選方面涉及保護(hù)劑，所述保護(hù)劑選自由9-(3,6-二磺基)芴基甲氧基-羰基鹵化物(smoc鹵化物)、9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基n-羥基琥珀酰亞胺(smoc-nhs)、9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基o-琥珀酰亞胺(smocosu)、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基鹵化物(smoc鹵化物)、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基n-羥基琥珀酰亞胺(smoc-nhs)、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基o-琥珀酰亞胺(smocosu)、三(4-磺苯基)甲基鹵化物(sulfotrt鹵化物)、叔丁基-(2-磺酸酯)氧羰基酸酐(sboc2o)、叔丁基-(2-磺酸酯)氧羰基o-琥珀酰亞胺(sboc-osu)、4-磺基-羰基芐氧基鹵化物(sulfocbz鹵化物)、2-羥基-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(tbus)、2-溴-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(tbus)、2-巰基-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(stbus)、4-磺基芐基鹵化物(bzs鹵化物)和4-磺基-芐氧基甲基鹵化物(boms鹵化物)組成的組。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的鹵化物是氯化物和溴化物。上述化合物是用于在有機(jī)化學(xué)的化學(xué)反應(yīng)中保護(hù)官能團(tuán)的有用試劑，例如，所述官能團(tuán)是胺基、醇基、巰基或羧基。

本發(fā)明的另一方面涉及修飾的氨基酸、肽及其鹽，其包含保護(hù)基，所述保護(hù)基選自由上述通式6至通式25所示的那些保護(hù)基組成的組，更優(yōu)地，選自由上述通式6至通式10所示的那些保護(hù)基組成的組。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，這些保護(hù)基包括9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基、三(4-磺苯基)甲基(sulfotrt)、叔丁基-(2-磺酸基)氧羰基(sboc)、4-磺基-芐氧羰基(sulfocbz)、叔丁基-1-磺酸酯基(tbus)、1-磺基-2-甲基-2-丙硫醇基(stbus)、4-磺芐基(bzs)和4-磺基-芐氧基甲基(boms)。

本發(fā)明的另一方面涉及一種用于實(shí)施肽的固相合成方法的裝置。所述裝置包括反應(yīng)器和熒光計(jì)，所述反應(yīng)器用于接收不溶性(例如聚合物)載體材料，所述熒光計(jì)布置用于監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度變化，所述熒光強(qiáng)度變化由與不溶性載體材料偶聯(lián)的保護(hù)基產(chǎn)生。由于本發(fā)明的保護(hù)劑(例如smoc)的固有熒光，不溶性載體材料的熒光強(qiáng)度的定量分析提供了關(guān)于在上述提及的spps方法中的偶聯(lián)反應(yīng)或脫保護(hù)反應(yīng)進(jìn)度的信息。將熒光計(jì)集成到肽合成裝置中可以使自動(dòng)化合成加速。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，該裝置還包括至少一個(gè)固體陰離子和/或陽(yáng)離子交換載體，其設(shè)置用于分離廢棄化合物。固體陰離子和/或陽(yáng)離子交換載體可以設(shè)置在產(chǎn)物流內(nèi)，以將靶蛋白與廢棄化合物(例如，含磺基的肽副產(chǎn)物、保護(hù)基殘留物和過(guò)量的試劑)分離。替代地或此外，可以在廢物流內(nèi)設(shè)置固體陰離子交換載體，以便在偶聯(lián)和脫保護(hù)步驟后，將獲得的沖洗溶液與廢棄化合物(例如，過(guò)量的試劑和副產(chǎn)物)分離。

通過(guò)圖例，參照附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中圖1是根據(jù)本發(fā)明的裝置的示意圖。

圖1示意性地示出了用于實(shí)施如上文所描述的優(yōu)選方法的自動(dòng)固相肽合成儀裝置的整體布局。該裝置包括含有錨定至不溶性聚合物載體的第一氨基酸或第一肽的反應(yīng)器1，包括用于提供偶聯(lián)劑、封端劑、裂解劑等的多個(gè)貯器的試劑容器2、溶劑容器3和包括用于提供受保護(hù)的氨基酸和/或肽的多個(gè)貯器的氨基酸和/或肽容器4。

反應(yīng)器1和容器2、容器3、容器4通過(guò)管和閥連接，以這種設(shè)置方式使得指定量的指定試劑、氨基酸和/或肽可以按照指定的順序，在控制構(gòu)件(未示出)的控制下，以常規(guī)的方式輸送到反應(yīng)器1中。

該裝置包括熒光計(jì)5，其設(shè)置用于測(cè)量監(jiān)測(cè)反應(yīng)器1的內(nèi)容物的熒光強(qiáng)度的變化。應(yīng)當(dāng)理解的是，或者，反應(yīng)器1可以包括集成的熒光計(jì)5。

反應(yīng)器配備有用于在每個(gè)沖洗步驟之后除去廢物流的廢液出口6和用于在裂解步驟之后除去產(chǎn)物流的產(chǎn)物出口7。廢液出口6通過(guò)廢料管8連接至腔室9和第一離子交換柱10，在腔室9中，調(diào)節(jié)廢物流的ph以用于后續(xù)分離。產(chǎn)物出口7通過(guò)產(chǎn)物管11連接到第二離子交換柱12。

離子交換柱10、11設(shè)置用于保留隨后必須處理的磺化廢棄化合物，例如副產(chǎn)物、過(guò)量的試劑和保護(hù)基殘留物。來(lái)自第一離子交換柱10的純化溶劑流可以導(dǎo)入下水道系統(tǒng)或再循環(huán)。來(lái)自第二離子交換柱12的純化產(chǎn)物流用于獲得靶蛋白。

采用以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但不受限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例：

實(shí)施例1：9-(3，6-二磺基)芴甲氧基羰基氯(smoc-cl)的合成

采用20ml濃硫酸處理2g(7.73mmol)fmoc-氯。反應(yīng)混合物停止反應(yīng)后，得到2.96g(7.07mmol，91.4％)淺黃色固體狀的粗smoc-氯。

smoc-氯的分析數(shù)據(jù)：

¹hnmr(500mhz，d2o)δ＝7.80(s，2h)，7.69(d，j＝7.9hz，2h)，7.48(d，j＝7.8hz，2h)，3.84(d，j＝4.8hz，2h)，3.45(t，j＝4.7hz，1h).

¹³cnmr(126mhz，d2o)δ＝145.57，142.54，141.65，125.16，121.61，120.90，62.54，49.65.

實(shí)施例2：9-(2，7-二磺基)芴甲氧基羰基氯(smoc-cl)的合成

采用20ml濃硫酸處理2g(7.73mmol)fmoc-氯并加熱至100℃。采用naoh(ph9.5)中和硫酸，減壓除去溶劑，采用nmr分析確認(rèn)了目標(biāo)中間體的形成。將中間體再次溶解于20％硫酸水溶液中，攪拌6小時(shí)，形成9-(2，7-二磺基)芴基甲醇。采用naoh(ph6.7)中和硫酸，減壓除去溶劑。將1.2eq.碳酰氯(phosgene)的溶液在25mldcm中冷卻至0℃，并在攪拌下緩慢加入9-(2，7-二磺基)芴基甲醇(carpinoandhan，thejournaloforganicchemistry1972，37，(22)，3404-3409)。將溶液在冰浴中攪拌1小時(shí)，然后在冰浴溫度下靜置4小時(shí)。減壓除去溶劑和過(guò)量的碳酰氯，得到相應(yīng)的產(chǎn)物。

nmr中間體：

¹hnmr(300mhz，d2o)δ：6.09(s，2h)，7.23-7.40(m，2h)，7.72(s，2h)，7.95(d，j＝6.2hz，2h).

¹³cnmr(75mhz，d2o)δ：142.61，132.99，131.74，130.23，129.28，127.22，125.57，124.69.

9-(2，7-二磺基)-芴甲氧基羰基氯的lc-apci-ms：

采用lc-apci-ms計(jì)算c15h9clo22·m/z：256.03。測(cè)量的m/z：256.94[m-h-2xso3]^-。

實(shí)施例3：smoc-gly-oh(smoc-甘氨酸)的合成

采用30ml濃硫酸處理2.5g(8.41mmol)fmoc-甘氨酸。反應(yīng)混合物停止反應(yīng)后，得到3.7g(8.09mmol，96.2％)淺黃色粉末狀的粗smoc-甘氨酸。

smoc-甘氨酸的分析數(shù)據(jù)：

采用lc-apci-ms計(jì)算c17h14no10s2^-m/z：456.01。測(cè)量的m/z：455.85[m-h]^-。

¹hnmr(500mhz，d2o)δ＝8.01(s，2h)，7.87(d，j＝7.ghz，2h)，7.79(d，j＝8.0hz，2h)，5.95(s，nh)，4.41(d，j＝6.2hz，2h)，4.01(t，j＝6.2hz，1h)，3.67(s，2h).

¹³cnmr(126mhz，d2o)δ＝158.21，144.94，142.41，141.88，125.51，122.09，121.09，65.75，46.95，44.39.

實(shí)施例4：smoc-l-ala-oh(smoc-丙氨酸)的合成

采用30ml濃硫酸處理2.5g(8.03mmol)fmoc-l-丙氨酸。反應(yīng)混合物停止反應(yīng)后，得到3.8g(7.64mmol，95.1％)白色粉末狀的粗smoc-l-丙氨酸。

(dd，2h)，5.94(s，nh)，3.95(m，oh+2h)，3.85(q，j＝7.4hz，1h)，2.93(t，j＝1.64hz，1h)，1.01(d，j＝7.3hz，3h).

¹³cnmr(126mhz，meod)δ＝175.11，158.10，146.21，145.89，145.44，143.54，。127.09，124.04，123.90，121.40，67.23，51.05，48.51，17.58.

實(shí)施例5：smoc-l-ile-oh(smoc-異亮氨酸)的合成

采用30ml濃硫酸處理2.5g(7.07mmol)fmoc-l-異亮氨酸。反應(yīng)混合物停止反應(yīng)后，得到3.8g(6.82mmol，96.4％)白色粉末狀的粗smoc-l-異亮氨酸。

smoc-異亮氨酸的分析數(shù)據(jù)：

采用lc-apci-ms計(jì)算c21h22no7s·m/z：432.11，測(cè)量的m/z：432.06[m-hso3]^-。

¹hnmr(500mhz，meod)δ＝7.79(d，j＝16.5hz，2h)，7.57(d，j＝8.0hz，2h)，7.55(dd，j＝8.0，1.5hz，2h)，4.15-3.89(m，oh+2h)，3.77(d，j＝6.2hz，1h)，2.93(t，j＝1.6hz，1h)，1.50(dtd，j＝13.2，10.1，6.7hz，1h)，1.20-1.05(m，1h)，0.97-0.81(m，1h)，0.55(d，j＝6.86hz，3h)，0.54(t，j＝7.43hz，3h).

¹³cnmr(126mhz，meod)δ＝173.98，158.49，146.15，145.45，143.48，127.09，124.02，123.95，121.38，67.33，60.30，48.55，38.31，26.30，15.98，11.66.

實(shí)施例6：smoc-l-leu-oh(smoc-亮氨酸)的合成

采用30ml濃硫酸處理2.5g(7.07mmol)fmoc-l-亮氨酸。反應(yīng)混合物停止反應(yīng)后，得到3.6g(7.01mmol，99.1％)白色粉末狀的粗smoc-l-亮氨酸。

smoc-亮氨酸的分析數(shù)據(jù)：

采用lc-apci-ms計(jì)算c21h22no7s·m/z：432.11。測(cè)量的m/z：432.06[m-hso3]^-。

¹hnmr(500mhz，，meod)δ＝7.80(d，j＝18.0hz，2h)，7.58(d，j＝8.1hz，2h)，7.57(dd，j＝8.3，4.1hz2h)，4.11-3.93(m，oh+2h)，3.86(dd，j＝9.9，5.3hz，1h)，2.94(t，1h)，1.41-1.31(m，1h)，1.30-1.17(m，2h)，0.57(dd，j＝14.7，6.5hz，6h).

¹³cnmr(126mhz，meod)δ＝175.08，158.41，146.18，145.95，145.38，143.52，127.10，124.07，123.97，121.40，67.27，53.99，48.54，41.47，25.86，23.27，21.78.

實(shí)施例7：sulfo-trt的合成

在加熱的圓底燒瓶中，在氮?dú)夥障拢瑢?37mg(9.75mmol，3.0eq.)鎂懸浮于10mlthf中。在劇烈攪拌(vicioussteering)下，向該混合物中加入1/10的在15mlthf中的1.878g(9.75mmol，3eq.)4-氯苯磺酸溶液。為了開(kāi)始格氏反應(yīng)，將混合物加熱回流并加入一滴溴。然后逐滴地加入剩余部分的4-氯苯磺酸溶液，并將混合物再回流30分鐘，接著冷卻至室溫。

第二步采用高知偶聯(lián)法(kochi’scouplingmethod)。為此，將三口燒瓶置于氮?dú)鈿夥障?，并采用在甲醇中的干冰懸浮液將其冷卻至-78℃。然后添加入50mlthf，接著添加入0.361ml(3.25mmol，1eq.)四氯化碳和0.325ml(0.03mmol，0.01eq.，0.1mol/l在thf中的溶液)四氯合銅酸二鋰(ii)。向該溶液中逐滴加入預(yù)先制備好的格氏試劑。在-78℃下攪拌1小時(shí)，在0℃下攪拌6小時(shí)后，將混合物溫?zé)嶂潦覝夭⒃贁嚢?8小時(shí)。通過(guò)加入20ml水將溶液淬滅(quenched)。在減壓下除去揮發(fā)性成分，得到1.69g褐色固體形式的粗4，4′，4″-(羥基甲烷三基)三苯磺酸酯(sulfo-trt)。通過(guò)半制備型rp-hplc將產(chǎn)物分離。采用亞硫酰氯(socl2)處理4，4′，4″-(羥基甲烷三基)三苯磺酸酯，形成三(4-磺苯基)甲基氯(sulfo-trt氯)。減壓除去溶劑。

sulfo-trt的分析數(shù)據(jù)：

¹hnmr(500mhz，d2o)δ＝7.68(d，j＝8.6hz，6h)，7.44(d，j＝8.6hz，6h).

¹³cnmr(126mhz，d2o)δ＝140.99，136.88，128.96，127.02，75.45.

實(shí)施例8：2-羥基-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(tbus-oh)的合成。

采用50ml水將6,00g2-甲基-2-丙烯-1-磺酸鈉鹽稀釋。加入10ml硫酸，在室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜。通過(guò)caco3沉淀除去硫酸。減壓除去溶劑。得到白色粉末狀產(chǎn)物。采用lc-ms和nmr分析確認(rèn)目標(biāo)化合物。

tbus-oh的分析數(shù)據(jù)：

采用esi-ms計(jì)算c4h9o4s^-m/z：153.18，測(cè)量的m/z：152.9[m-h]^-。

¹hnmr(500mhz，dmso-d6)δ：1.18(s，6h)，2.67(s，2h)，5.20(s.1h).

¹³cnmr(126mhz，dmso)δ：67.84，61.81，39.52，29.65.

實(shí)施例9：2-溴-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(tbus-br)的合成。

采用20mlhbr(48％w/w)將6,00g2-甲基-2-丙烯-1-磺酸鈉鹽稀釋。減壓除去溶劑。得到白棕色粉末產(chǎn)物。采用lc-ms和nmr分析確認(rèn)目標(biāo)化合物。

tbus-br的分析數(shù)據(jù)：

采用esi-ms計(jì)算c4h8bro3s^-m/z：216，07，測(cè)量的m/z：216，8[m-h]^-。

實(shí)施例10：2-巰基-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(stbus)的合成。

采用25ml濃hcl將3,00g2-甲基-2-丙烯-1-磺酸鈉鹽稀釋，并將反應(yīng)溶液攪拌過(guò)夜。然后用naoh(ph＝6.8)將酸中和，減壓除去溶劑。在加熱的圓底燒瓶中，在氮?dú)夥諊?，?33，67mg鎂懸浮在20mlthf中。在劇烈攪拌下加入1，5g在15mlthf中的tbus-cl懸浮液。為了開(kāi)始格氏反應(yīng)，將混合物加熱至回流(70℃)，加入一滴溴，再將混合物回流90分鐘，然后冷卻至室溫。將4eq.硫添加入格氏試劑中并攪拌8小時(shí)。然后加入200ml水。將混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。隨后，減壓除去溶劑，采用nmr分析所得白色粉末。

stbus分析數(shù)據(jù)：

¹hnmr(500mhz，deuteriumoxide)δ：1.56(s，6h)，2.18(s，j＝1.3hz，1h)，3.67(s，2h).

¹³cnmr(126mhz，d2o)δ：61.66，32.13，28.48.

實(shí)施例11：(9-bbn)-lys(sboc)的合成

將1,68g賴氨酸懸浮于無(wú)水thf中，在惰性氣體下，添加入在thf(0.5mol/l)中的24.28ml9-硼二環(huán)(3.3.1)壬烷(9-bbn)。將所得懸浮液在100℃回流18h。減壓除去溶劑。采用20mlthf將(9-bbn)-lys稀釋，在惰性氣體下，添加入1.97g1，1′-羰基二咪唑和2.54gtbus-oh。將所得溶液攪拌5小時(shí)。減壓除去溶劑，采用dcm將所得粗產(chǎn)物洗滌3次以除去咪唑殘基。

(9-bbn)-lys(sboc)的分析數(shù)據(jù)：

采用esi-ms計(jì)算c19h33bn2o7s^2-m/z：444.35，測(cè)量的m/z：443.2[m-h]^-。

實(shí)施例12：(9-bbn)-tyr(tbus)的合成。

將2.00g酪氨酸懸浮于無(wú)水thf中，在惰性氣體下，添加入25ml在thf中的9-bbn(0.5mol/l)。將所得懸浮液在100℃下回流18h。減壓除去溶劑。將(9-bbn)tyr懸浮在20mlthf中，在惰性氣體下加入2.39gtbus-br。將所得溶液攪拌2d。減壓除去溶劑，采用thf將所得粗產(chǎn)物洗滌3次以除去溴化物殘余物。

(9-bbn)-tyr(tbus)的分析數(shù)據(jù)：

采用esi-ms計(jì)算c21h31bno6s^-m/z:436.35，測(cè)量的m/z:436.2[m+h]⁺，453.2[m+h2o]⁺。

實(shí)施例13：smoc-保護(hù)的氨基酸的穩(wěn)定性試驗(yàn)

為了確定smoc-保護(hù)的氨基酸在水性環(huán)境中的穩(wěn)定性，將smoc-甘氨酸和smoc-l-亮氨酸溶解于水中，并在環(huán)境溫度下溫育8天。采用分析型rp-hplc在3、6和8天后檢查氨基酸的狀況?；衔锉仨氃谒原h(huán)境中穩(wěn)定相當(dāng)久的時(shí)間。為了證明這種穩(wěn)定性，將smoc-甘氨酸和smoc-亮氨酸溶解于最少量的水中并保持在環(huán)境溫度下。在3、6和8天后通過(guò)rp-hplc監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果，沒(méi)有觀察到氨基酸組成的顯著變化。

實(shí)施例14：smoc保護(hù)的氨基酸的n-端脫保護(hù)

對(duì)于spps中的使用，保護(hù)基必須在安全條件下容易和有效地脫保護(hù)。為了確定smoc保護(hù)的氨基酸的脫保護(hù)條件，通過(guò)將1mgsmoc-甘氨酸溶解在1ml的水或乙醇中進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。將以下其中一種堿添加入此溶液中，并將混合物在室溫下振蕩溫育5分鐘：

氨(10％水溶液)，

乙醇胺(50％水溶液)，

乙二胺(50％水溶液)或

哌啶(50％水溶液)。

采用分析型rp-hplc和esi-ms分析結(jié)果。

結(jié)果表明，在室溫下，氨或胺在水中的溶液對(duì)于smoc脫保護(hù)是足夠的。

除了哌啶(用作為fmoc-spps脫保護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)堿)外，還可以使用水溶性堿，例如氨水、乙醇胺和乙二胺等。與基于哌啶的脫保護(hù)相比，其允許獲得顯著更便宜和更容易的工藝。

實(shí)施例15：通過(guò)親和層析純化

將smoc-丙氨酸與未保護(hù)的丙氨酸混合，作為人造雜質(zhì)，并溶解在1m甲酸中并加載到deaesephadexa-25離子交換柱中。采用另外的甲酸洗滌離子交換柱后，采用4m甲酸銨溶液洗脫smoc-丙氨酸。采用rp-hplc分析加載前的溶液、加載后的溶液和洗脫餾分。

結(jié)果表明，未受保護(hù)的丙氨酸無(wú)阻礙地通過(guò)離子交換柱，而smoc-保護(hù)的丙氨酸與離子交換柱結(jié)合。隨著流動(dòng)相變化為4m甲酸銨溶液，從柱上洗脫smoc-丙氨酸而沒(méi)有任何雜質(zhì)殘留。因此，已經(jīng)表明，smoc基團(tuán)可以成功地用于親和層析中用于純化目的。

實(shí)施例16：根據(jù)smoc方法合成測(cè)試肽h-v-g-g-v-g-oh

smoc保護(hù)的氨基酸的偶聯(lián)根據(jù)以下進(jìn)行。因此，將3eq.相應(yīng)的smoc保護(hù)的氨基酸、2.8eq.活化劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)、3.0eq.n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和6eq.碳酸氫鈉作為一般堿溶解在最少量的水中并預(yù)活化3min。在環(huán)境溫度下，進(jìn)行典型偶聯(lián)60min。肽樹(shù)脂的n-端脫保護(hù)作為用10％的氨水溶液的雙重脫保護(hù)步驟進(jìn)行。從載體裂解后，通過(guò)rp-hplc和esi-ms分析測(cè)試肽。

肽h-v-g-g-v-g-oh的分析數(shù)據(jù)：

rp-hplc，10→60％mecn，tr＝19.1min。

采用esi-ms計(jì)算c16h29n5o6m/z:387.21測(cè)量的為387.0[m+h]⁺。

在每個(gè)偶聯(lián)步驟和后面的脫保護(hù)步驟后，測(cè)定水、固體載體(pega樹(shù)脂)和pega樹(shù)脂-肽的熒光。結(jié)果示于表1中。因此，在每個(gè)偶聯(lián)步驟后，由于偶聯(lián)了smoc基團(tuán)，熒光值上升，并且在每個(gè)脫保護(hù)步驟之后，熒光值再次降低，表明實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程是可能的。