本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合IGF-1C結(jié)構(gòu)域多肽的活性可注射殼聚糖水凝膠的制備方法，還涉及這類材料作為干細(xì)胞載體材料應(yīng)用于組織損傷修復(fù)，增強(qiáng)干細(xì)胞的治療效果.

背景技術(shù)：

以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法可以為組織損傷治療提供前景。干細(xì)胞具有自我更新和多向分化能力，可以通過轉(zhuǎn)分化、旁分泌等方式參與腎臟修復(fù)。相比于藥物，干細(xì)胞治療組織損傷的一大優(yōu)勢在于其多樣化的治療作用可以靶向腎臟損傷病理生理學(xué)的多種機(jī)制；內(nèi)源性動員或外源性輸注的干細(xì)胞歸巢到受損腎臟，一方面轉(zhuǎn)分化為腎臟細(xì)胞直接補(bǔ)充丟失的小管上皮細(xì)胞，另一方面可以發(fā)揮促進(jìn)增殖、減少凋亡、促進(jìn)血管新生、減少炎癥和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等作用。但是，使用外源性干細(xì)胞治療組織損傷的過程中，遞送形式是一個(gè)挑戰(zhàn)。直接將細(xì)胞注射到組織損傷部位，很難發(fā)生整體的整合。經(jīng)脈管系統(tǒng)注射細(xì)胞需要避免其被其他器官俘獲，而且需要細(xì)胞具有定向遷移的能力。但在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)將干細(xì)胞直接注射到缺血損傷部位，1周后僅有～1％的細(xì)胞存活。這可能與細(xì)胞處于局部惡劣(缺血缺氧、炎癥、缺乏基質(zhì)保護(hù))的損傷環(huán)境有關(guān)。最近的研究顯示生物支架材料作為細(xì)胞載體在調(diào)節(jié)移植細(xì)胞在受損腎臟中的細(xì)胞命運(yùn)方面體現(xiàn)出優(yōu)勢。利用生物材料釋放的細(xì)胞外基質(zhì)與移植細(xì)胞相互作用可以改善局部微環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞的生物學(xué)作用，并加快組織的修復(fù)和再生。殼聚糖(CS)作為一種天然大分子化合物，具有較好的組織相容性、生物可降解性及豐富的生物學(xué)活性。以CS為基礎(chǔ)的多種類型支架材料已經(jīng)在組織工程領(lǐng)域顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，許多研究人員重視利用遞送生長因子來增加組織工程化基質(zhì)的生物活性。由于蛋白具有免疫原性和生物活性丟失快的缺陷，越來越多的研究支持 使用具有生物學(xué)功能的模擬活性多肽(如RGD，QK，QHREDGS)來替代生長因子(如纖維粘連蛋白、血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-1)的功能。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是一種強(qiáng)大的促有絲分裂和細(xì)胞存活的生長因子，其被認(rèn)為在調(diào)控臨床腎病恢復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有趣的是，最近的研究發(fā)現(xiàn)C結(jié)構(gòu)域(IGF-1C)是IGF-1蛋白的活性區(qū)域，并且已經(jīng)證明這一多肽可以促進(jìn)角膜上皮傷口愈合。從這一點(diǎn)上來看，將活性多肽IGF-1C修飾于大分子生物支架材料可能實(shí)現(xiàn)載體對移植細(xì)胞特定功能的增強(qiáng)，從而為組織損傷修復(fù)提供新的視角。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種殼聚糖水凝膠，其特征在于，所述殼聚糖水凝膠結(jié)合了胰島素樣生長因子C結(jié)構(gòu)域多肽(IGF-1C)。

本發(fā)明的殼聚糖水凝膠既具備殼聚糖生物材料的物理和化學(xué)性能，也具有胰島素樣生長因子C結(jié)構(gòu)域多肽的生物活性。

本發(fā)明提供了上述殼聚糖水凝膠的制備方法，其包括：(1)胰島素樣生長因子C結(jié)構(gòu)域多肽通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵結(jié)合到殼聚糖分子上；或者，(2)胰島素樣生長因子C結(jié)構(gòu)域多肽通過物理混合結(jié)合到殼聚糖中。

在本發(fā)明的制備方法中，所述化學(xué)反應(yīng)是點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)和/或縮合反應(yīng)。

本發(fā)明的殼聚糖水凝膠具有不同的釋放胰島素樣生長因子C結(jié)構(gòu)域多肽的行為。

本發(fā)明的殼聚糖水凝膠通過結(jié)合胰島素樣生長因子C結(jié)構(gòu)域多肽方式來調(diào)控所述胰島素樣生長因子C結(jié)構(gòu)域多肽的釋放行為。

本發(fā)明的殼聚糖水凝膠具有可注射性。

本發(fā)明的殼聚糖水凝膠在制備治療組織損傷的干細(xì)胞載體中的應(yīng)用。

干細(xì)胞包括：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、尿液來源干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、心臟干細(xì)胞。

組織損傷包括腎臟損傷、心肌梗死以及皮膚缺損。

本發(fā)明提供一種結(jié)合IGF-1C多肽的生物活性殼聚糖水凝膠的制備方法。

1.IGF-1C結(jié)構(gòu)域多肽的制備方法：

(1)第一個(gè)氨基酸的C端接枝在樹脂上，接載率為0.6毫摩爾/克。20％的哌啶溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)用于脫除氨基的Fmoc保護(hù)基團(tuán)；

(2)在縮合劑O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(BTU)和催化劑N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)的共同作用下，下一個(gè)氨基酸的羧基與游離的氨基結(jié)合；重復(fù)以上步驟，多肽鏈會不斷增長；

(3)最后將分別將疊氮化的己酸或二元酸(丁二酸、己二酸、癸二酸)連接到多肽的氨基上；

(4)用一定體積的DMF反復(fù)沖洗連有多肽的樹脂(5分鐘，5次)，之后再用DCM沖洗(1分鐘，3次)；用三氟乙酸(TFA)處理干燥的樹脂，將多肽從樹脂上脫離，轉(zhuǎn)移進(jìn)入TFA溶液；

(5)收集溶液旋干，得到濃縮溶液；用冰凍乙醚處理，離心，得到沉淀；

(6)將沉淀溶于二甲基亞砜(DMSO)，使用高效液相色譜純化得到IGF-1C，及末端帶有疊氮或羧基的多肽產(chǎn)物IGF-1C-N3或IGF-1C-COOH。

2.通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合IGF-1C多肽的殼聚糖的制備方法：

碳二亞胺碳二亞胺鹽酸鹽催化下冰浴中反應(yīng)24小時(shí)，從而通過酰胺化反應(yīng)將炔基接枝到殼聚糖分子側(cè)基上，產(chǎn)物經(jīng)透析純化。第二步是通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將碳二亞胺鹽酸鹽催化下冰浴中反應(yīng)24小時(shí)，從而通過酰胺化反應(yīng)將炔基接枝到殼聚糖分子側(cè)基上，產(chǎn)物經(jīng)透析純化。第二步是通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將IGF-1C-N3與炔基化殼聚糖反應(yīng)，采用無水硫酸銅、抗壞血酸鈉做催化劑，恒溫37℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)水透析3天，冷凍干燥得CS-IGF-1C。

3.通過縮合反應(yīng)共價(jià)結(jié)合IGF-1C多肽的殼聚糖的制備方法：

碳二亞胺碳二亞胺鹽酸鹽催化下冰浴中反應(yīng)24小時(shí)，從而通過酰胺化反應(yīng)將炔基接枝到殼聚糖分子側(cè)基上，產(chǎn)物經(jīng)透析純化。碳二亞胺鹽酸鹽催化下冰浴中反應(yīng)24小時(shí)，從而通過酰胺化反應(yīng)將炔基接枝到殼聚糖分子側(cè)基上，產(chǎn)物經(jīng)透析純化。

4.共價(jià)結(jié)合IGF-1C的殼聚糖水凝膠的制備：

(1)將CS-IGF-1C以一定濃度(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1-5％)溶解在水中；

(2)β-甘油磷酸鈉(β-GP)溶液滴加到殼聚糖溶液中，冰水浴條件下攪拌0.5小時(shí)；

(3)混合溶液轉(zhuǎn)移至37℃恒溫箱中，即可見凝膠化；

(4)混合溶液中β-GP終濃度為0.005-0.05M。

5.物理混合IGF-1C的殼聚糖水凝膠的制備：

(1)將殼聚糖以一定濃度(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1-5％)溶解到醋酸(1-3％)溶液中，室溫，過夜；

(2)調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，加入一定比例的IGF-1C多肽(多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)1-5％)，混合均勻；

(3)將β-甘油磷酸鈉(β-GP)溶液滴加到殼聚糖溶液中，冰水浴條件下攪拌0.5小時(shí)；

(5)混合溶液轉(zhuǎn)移至37℃恒溫箱中，5分鐘即可見凝膠化；

(6)混合溶液中β-GP終濃度為0.005-0.05摩爾/升。

本發(fā)明提供了利用結(jié)合IGF-1C多肽的活性水凝膠負(fù)載干細(xì)胞及細(xì)胞示蹤的方法。

1.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)提取與培養(yǎng)

(1)準(zhǔn)備：將手術(shù)器械(彎頭鑷子2把，眼科剪2把)用紗布包好滅菌，后置于烘箱中烘干；無血清培養(yǎng)基(PS)一管；

(2)選取3～4只10周齡雄性小鼠，體重20克以上最佳，利用脫頸的方法將小鼠處死；

(3)用酒精均勻噴灑小鼠腿部以及腹部毛發(fā)，用無菌的彎鑷 提起小鼠表皮，用無菌眼科剪小心分離小鼠皮膚和皮下肌肉組織；

(4)在小鼠大腿的根部有淡粉色的脂肪組織，用剪刀仔細(xì)剝離并剪下，置于無血清培養(yǎng)基中暫時(shí)保存；

(5)沿小鼠腹中線剪開小鼠的腹部肌肉層，打開其腹腔，在小鼠附睪附近，分布有兩大塊白色脂肪組織，輕輕剝離去其它組織并將脂肪組織剪下暫時(shí)保存在無血清培養(yǎng)基中；

(6)將盛有脂肪組織的離心管噴勻酒精充分消毒后，移入超凈臺中，將脂肪組織倒入無菌培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃以洗滌脂肪組織；

(7)用無菌彎頭鑷將脂肪組織轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的盛有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿洗滌脂肪組織。如此反復(fù)再洗滌脂肪組織3次。本步驟意在盡量去除小鼠毛發(fā)以及組織內(nèi)的細(xì)菌；

(8)最后一遍洗滌后，將脂肪組織轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿中(無PBS)，用無菌眼科剪將脂肪組織盡量剪碎(本步驟利于后期酶的消化)；

(9)用無血清培養(yǎng)基重懸剪碎了的脂肪組織，轉(zhuǎn)移至50毫升離心管中，不加培養(yǎng)基使總體積達(dá)到35毫升，在1500轉(zhuǎn)/分的條件下離心5分鐘；

(10)離心后，將液體用離心管小心吸棄，保留漂浮在液面上及沉淀在底部的脂肪組織，后加入無菌的20毫升0.075％的Ⅰ型膠原酶溶液，用封口膜密封離心管，在37℃水浴搖床上消化1小時(shí)；

(11)消化結(jié)束后，補(bǔ)加培養(yǎng)基至總體積為45毫升，在1000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘；

(12)棄掉上清，用45毫升的培養(yǎng)基再次洗滌細(xì)胞沉淀，后棄上清；

(13)用10毫升ADSCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并鋪于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)盤中；

(14)鋪盤后第三天給細(xì)胞換半液，第四天換全液，以后每三天換一次全液，直至細(xì)胞長滿，此時(shí)的ADSCs即為原代(P0)細(xì)胞；

(15)ADSCs長至90％以上時(shí)可以傳代，傳代時(shí)先吸棄培養(yǎng)基，后用PBS清洗殘余的培養(yǎng)基，然后再加入2毫升胰酶-乙二胺四乙酸溶 液，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4分鐘，用AD-MSCs培養(yǎng)基中和胰酶，于1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，重懸沉淀后分盤。通常的傳代比例為1:3。

(16)ADSCs的凍存:將生長良好的P1代細(xì)胞，經(jīng)消化后，用PBS液洗滌2次，用凍存液(含90％的全血清+10％DMSO)重懸細(xì)胞，逐滴加入凍存管中，放入4℃冰箱預(yù)冷l0分鐘，隨后轉(zhuǎn)移至凍存盒中放置于-80℃冰箱凍存48小時(shí)以上，最后沉入液氮中長期保存。凍存細(xì)胞濃度為l-5×106/毫升。

(17)ADSCs的復(fù)蘇:將凍存細(xì)胞從液氮取出，置入37℃水浴中1-3分鐘，待細(xì)胞完全解凍，用DMEM培養(yǎng)液稀釋離心，棄上清，使沉淀重新懸浮于培養(yǎng)液中，按2×105/毫升接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

(18)ADSCs的表型鑒定：將P3的ADSCs按上述方法消化，離心后用PBS重懸計(jì)數(shù)，后向每個(gè)炮彈管中分裝含有約15萬個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液；再次離心細(xì)胞(1000轉(zhuǎn)/分鐘)，收集沉淀，用30微升的含有1％FBS的PBS重懸細(xì)胞沉淀，向各管中加入1微升的相應(yīng)的流式抗體(CD45、CD31、CD44、CD29、CD90.2以及Sca-1)，冰上孵育30分鐘，期間經(jīng)常輕晃炮彈管，以防細(xì)胞沉淀；染色結(jié)束后，每管中加入1毫升的PBS溶液充分混勻后離心；離心結(jié)束后棄上清，再次重復(fù)洗滌3次；最后一次洗滌結(jié)束棄上清后，用300微升的PBS重懸細(xì)胞，用流式網(wǎng)過濾后轉(zhuǎn)移至流式管中避光保存，24小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析；以進(jìn)行任何染色的ADSCs進(jìn)行空白對照，利用流式細(xì)胞儀分析各抗體的陽性百分率。

2.體內(nèi)化學(xué)發(fā)光成像評價(jià)

(1)經(jīng)腹腔注射水合氯醛(4％，350毫克/千克)麻醉小鼠；

(2)向小鼠經(jīng)腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin(150毫克/千克)；

(3)底物注射5分鐘后，將小鼠放入小動物活體成像系統(tǒng)暗箱內(nèi)，擺放好體位(俯臥位)，將其頭部對準(zhǔn)暗箱內(nèi)出氣孔；

(4)根據(jù)熒光信號強(qiáng)度調(diào)整曝光時(shí)間，一般為0.5-2分鐘，連續(xù)采集圖像直到信號強(qiáng)度開始下降；

(5)數(shù)據(jù)分析：使用Living Image軟件測定每只小鼠的熒光信號 強(qiáng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本發(fā)明提供了一種利用活性水凝膠負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性腎臟損傷、心肌梗死以及皮膚缺損的方法。

1.急性腎臟損傷及細(xì)胞治療

(1)高壓消毒手術(shù)器械，使用醫(yī)用酒精消毒手術(shù)臺區(qū)域；

(2)經(jīng)腹腔注射水合氯醛(4％，350毫克/千克)麻醉小鼠，于背部中部、脊柱左側(cè)0.2厘米處縱行切開皮膚(0.8-1厘米)，分離皮下結(jié)締組織，離斷背部肌肉進(jìn)入腹腔，探查并暴露左腎，可見正常腎臟呈現(xiàn)鮮紅色；

(4)用尖鑷游離腎周脂肪及筋膜，向左側(cè)輕輕牽拉腎臟暴露腎蒂，使用微型血管夾略靠近腎臟夾閉腎蒂，約1分鐘可見腎臟出現(xiàn)淤血呈紫黑色；

(5)腎臟缺血期間，使用浸沾溫生理鹽水的紗布覆蓋切口并保持紗布濕潤，小鼠上方暖燈照射并保持加熱墊溫度(37℃)恒定；

(6)缺血40分鐘后移除血管夾，肉眼可見腎臟顏色即刻變?yōu)榧t色，使用4-0絲線逐層縫合肌層和皮膚關(guān)閉背部切口；

(7)將小鼠置于加熱墊上復(fù)溫，待蘇醒后放回飼養(yǎng)籠。

在腎臟缺血再灌注后(對于重度損傷模型，在對側(cè)腎臟切除術(shù)后)，即刻行左腎內(nèi)遞送細(xì)胞或水凝膠。

(8)使用鑷子將腎臟輕輕提拉到體外，用細(xì)棉條或紗布條包裹并固定腎臟，防止其掉回腹腔內(nèi)；

(9)使用胰島素注射器(300微升規(guī)格)吸取輸送介質(zhì)(PBS或水凝膠，30微升)負(fù)載的細(xì)胞(106ADSCs)，于腎臟上極、中部和下極三個(gè)部位輕輕刺入腎臟實(shí)質(zhì)(深度約3毫米)，緩慢輕推注射器(10微升/部位)，同時(shí)觀察小鼠的呼吸頻率；

(10)注射完成后，緩慢拔除注射器，同時(shí)使用棉球按壓進(jìn)針處腎臟組織止血1分鐘。

2.治療心肌梗死模型(冠狀動脈左前降支永久結(jié)扎)建立及細(xì)胞-水凝膠移植：

(1)小鼠麻醉：用5％的異氟烷氣體預(yù)麻小鼠，用醫(yī)用膠帶固定小鼠的四肢和頭部于手術(shù)板上，剪開頸部氣管，氣管插管后接通麻醉呼吸機(jī)正壓通氣，調(diào)節(jié)異氟烷的含量約為1％-1.5％，呼吸頻率為120次/分鐘；

(2)胸部備皮，用醫(yī)用酒精和碘伏進(jìn)行消毒；

(3)行胸廓切開術(shù)，于第四肋間處開胸并暴露心臟，仔細(xì)撕開心包膜暴露小鼠左心室前壁；

(4)左冠狀動脈起始端的下方距離左心耳約1毫米處，用7-0的縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支(以結(jié)扎點(diǎn)下方心肌的顏色變淺發(fā)白或出現(xiàn)紫黑色且心電圖(electrocardiogram，ECG)檢測顯示心肌電ST段抬高為結(jié)扎成功的標(biāo)志；

(5)結(jié)扎成功后于結(jié)扎位點(diǎn)左下、右下各1毫米處分別注射10微升生理鹽水、細(xì)胞生理鹽水懸液、水凝膠或凝膠-ADSCs復(fù)合物；

(6)關(guān)胸，縫合肌肉和皮膚，傷口用碘伏再次消毒，妥善飼養(yǎng)。

(7)假手術(shù)對照組：開胸，穿線不接扎不移植任何細(xì)胞或溶液，后關(guān)胸縫合肌肉。

3.真皮層全層皮膚損傷模型的建立及細(xì)胞-水凝膠移植：

(1)裸鼠腹腔內(nèi)注射4％水合氯醛進(jìn)行全身麻醉。

(2)麻醉效果滿意后，75％酒精消毒裸鼠背部皮膚3遍。

(3)用眼科剪剪除全層裸鼠皮膚及肉膜，暴露肌肉層，制備出面積為l.0平方厘米的皮膚缺損區(qū)域。

(4)IV3000無菌不透水傷口敷料覆蓋創(chuàng)面，貼膜邊緣用傷口粘合劑點(diǎn)附于裸鼠背部皮膚。

(5)術(shù)后裸鼠單籠飼養(yǎng)，自第3天起每隔2天更換創(chuàng)面敷料。

(6)水凝膠-ADSCs以1×106/毫升的密度接種于水凝膠中，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠注射200微升生理鹽水(不治療組)、細(xì)胞生理鹽水懸液(單純細(xì)胞組)、水凝膠-ADSCs(對照水凝膠與細(xì)胞組)、水凝膠。

(7)術(shù)后大體觀測及愈合曲線測定，每天觀察并記錄各組裸鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食飲水情況、活動力、大小便情況。

(8)術(shù)后每隔2天(術(shù)后第3、6、9、l2天)麻醉后首先行活體成像檢測，然后去除傷口敷料、仔細(xì)清除創(chuàng)面滲出物、痂皮，觀察創(chuàng)面有無感染、創(chuàng)面愈合情況，并進(jìn)行創(chuàng)面拍照同時(shí)以透明薄膜描印創(chuàng)面。

(9)拍照后，創(chuàng)面重新用IV3000無菌不透水傷口敷料貼膜覆蓋，貼膜邊緣用傷口粘合劑點(diǎn)附于裸鼠背部皮膚。使用Image J軟件分析各組術(shù)后第3、6、9、l2天殘留創(chuàng)面面積，并繪制愈合曲線。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

我們使用IGF-1C修飾的水凝膠負(fù)載ADSCs通過直接注射的方式移植到損傷組織，觀察到組織學(xué)和功能學(xué)的恢復(fù)。這種治療手段可以在早期顯著增強(qiáng)存活的組織細(xì)胞增殖，并在晚期通過結(jié)合IGF-1C的水凝膠與ADSCs的相互作用增加水凝膠注射區(qū)域和臨近部位的細(xì)胞增殖而建立有益的局部微環(huán)境；水凝膠和細(xì)胞的聯(lián)合移植還能夠通過抑制Bax表達(dá)而減少損傷后早期腎臟細(xì)胞凋亡。該水凝膠具有有效的治療作用、無毒副作用、損傷小、適合長期應(yīng)用。

附圖說明

圖1表示天然人源胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的氨基酸序列以及本發(fā)明合成的C結(jié)構(gòu)域多肽；

圖2表示通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)合成共價(jià)結(jié)合IGF-1C的殼聚糖(CS-IGF-1C)的步驟；

圖3表示不同濃度CS-IGF-1C水凝膠對于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外活性的影響；

圖4A和B表示生物發(fā)光成像檢測CS-IGF-1C水凝膠對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖能力的影響；

本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式做進(jìn)一步詳細(xì)說明。這些實(shí)施例用來更具體地闡述本發(fā)明，并且如所附權(quán)利要求書提出的本發(fā)明的范圍不限于實(shí)施例或受實(shí)施例的限制。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：IGF-1C修飾殼聚糖(CS)獲得CS-IGF-1C的制備

IGF-1C多肽的固相合成

IGF-1C多肽通過成熟的固相合成(SPPS)步驟，使用2-chlorotrityl chloride樹脂和側(cè)鏈被tert-buty基團(tuán)保護(hù)且氨基被Fmoc保護(hù)的氨基酸合成。步驟為：

1.第一個(gè)氨基酸的C端接枝在樹脂上，接載率為0.6毫摩爾/克。20％的哌啶溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)用于脫除氨基的Fmoc保護(hù)基團(tuán)；

2.在縮合劑小時(shí)BTU和催化劑DIPEA的共同作用下，下一個(gè)氨基酸的羧基與游離的氨基結(jié)合；重復(fù)以上步驟，多肽鏈會不斷增長；

3.疊氮化己酸的合成：6-溴己酸乙酯與疊氮化納在DMF中反應(yīng)，之后用氫氧化鈉處理，得到疊氮化的己酸；

4.最后將上一步的疊氮化己酸用同樣的步驟連接到多肽的氨基上；

5.用一定體積的DMF反復(fù)沖洗連有多肽的樹脂(5分鐘，5次)，之后再用DCM沖洗(1分鐘，3次)；

6.用TFA處理干燥的樹脂，將多肽從樹脂上脫離，轉(zhuǎn)移進(jìn)入TFA溶液；

7.收集溶液旋干，得到濃縮溶液；用冰凍乙醚處理，離心，得到沉淀；

8.將沉淀溶于DMSO，使用高效液相色譜純化得到帶疊氮的多肽產(chǎn)物。

炔基取代的殼聚糖(alkynyl-CS)的合成

1.將CS溶解于蒸餾水中，向其中加入戊炔酸，利用1摩爾/升鹽酸(HCL)和1摩爾/升氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH值使CS完全溶解；

2.將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，按照EDC:戊炔酸＝3:1的比例)加入CS溶液中(每半個(gè)小時(shí)加1次，共3次)，期間冰?。?/p>

3.在室溫中反應(yīng)24小時(shí)；

4.對產(chǎn)物進(jìn)行透析(5毫摩爾/升HCl和1wt％NaCl，2天；3毫摩爾/升HCl，1天；1毫摩爾/升HCl，2天；去離子水，3天，4℃)；

5.凍干獲得終產(chǎn)物。

CS-IGF-1C的合成

利用點(diǎn)擊化學(xué)(“click”反應(yīng))合成CS-IGF-1C，步驟如下：

1.在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用去離子水(10毫升)溶解炔基取代-CS。

2.點(diǎn)擊反應(yīng)條件：IGF-1-N3:CuSO4:抗壞血酸鈉的進(jìn)料摩爾比為1:0.2:0.4。

3.在37℃條件下，反應(yīng)24小時(shí)；

4.使用去離子水透析3天；

5.通過凍干獲得CS-IGF-1C材料；

IGF-1是70個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，含A、B、C和D 4個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖1)。CS-IGF-1C是通過對IGF-1C-N3的疊氮和炔基化殼聚糖的炔烴進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)而合成的。首先，使用固相Fmoc-氨基酸化學(xué)法合成IGF-1的C結(jié)構(gòu)域的序列(GYGSSSRRAPQT)。然后，利用縮合反應(yīng)將6-疊氮基己酸連到C結(jié)構(gòu)域的N-端獲得IGF-1C-N3(N3-GYGSSSRRAPQT)。而后，通過CS和4-戊炔酸的縮合反應(yīng)合成炔基化殼聚糖。最后，利用點(diǎn)擊反應(yīng)合成CS-IGF-1C復(fù)合物(圖2)。向CS-IGF-1C溶液中加入β-GP制備成可注射的水凝膠。利用FT-IR光譜儀檢測證明CS-IGF-1C復(fù)合物化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有alkynyl-CS所不具備的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2：CS-IGF-1C水凝膠的制備及性能評價(jià)

CS-IGF-1C水凝膠的制備

(1)使用醋酸(0.1摩爾/升)溶解CS-IGF-1C(1.5％，w/v)，室溫，過夜；

(2)使用蒸餾水在透析膜(截留分子量為8kDa–10kDa)中對CS溶液進(jìn)行透析，1周，去除殘余的醋酸；

(3)通過凍干獲得CS-IGF-1C鹽酸鹽；

(4)將冰浴的β-GP溶液(2.29摩爾/升)滴加到CS溶液中，冰浴條件下攪拌0.5小時(shí)；

(5)混合溶液轉(zhuǎn)移至37℃恒溫箱中，5分鐘即可見凝膠化；

(6)混合溶液中β-GP終濃度為0.023摩爾/升，經(jīng)透析CS-IGF-1C/β-GP溶液的pH值為7.2。

掃描電子顯微鏡觀察水凝膠形貌

將水凝膠凍干后，放入干燥機(jī)中干燥24小時(shí)，使用場致發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察CS和CS-IGF-1C水凝膠的表面形態(tài)和多孔結(jié)構(gòu)(加速電壓為10千伏，觀察前材料表面噴金處理)。

水凝膠流變學(xué)特性測試

(1)流變測試使用AR 2000ex(TA instrument)流變儀完成，使用25毫米不銹鋼平板圓盤夾具，夾具間隙400微米，溫度設(shè)定為25℃。每個(gè)樣品每次測試需要1毫升溶液。

(2)將CS溶液(含有0.023Mβ-GP，p小時(shí)值為7.2)和CS-IGF-1C溶液(含有0.023摩爾/升β-GP，p小時(shí)值為7.12)加入到流變儀中，在10℃-50℃的溫度范圍內(nèi)測量樣品的流變學(xué)特性。

(3)測試并記錄水凝膠彈性模量(儲能模量)(G’)和粘性模量(損耗模量)(G”)隨溫度變化的改變情況，頻率為1弧度/秒。

(4)使用相位滯后(δ)來確定G’和G”相等時(shí)的成膠溫度。在恒定加熱速率(1℃/分鐘)的情況下改變溫度。

利用SEM觀察凍干水凝膠的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)兩種水凝膠均具有均質(zhì)互通的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小為50微米-100微米，足夠用于干細(xì)胞遞送。比較兩種生物材料隨溫度變化的流變學(xué)性質(zhì)。隨著溫度從10℃增至50℃，CS-IGF-1C/β-GP和CS/β-GP均顯示出儲能模量(G’)的顯著增加，提示從溶液狀態(tài)向凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變的相變過程。CS-IGF-1C/β-GP的成膠溫度為35℃-36℃，與CS/β-GP相似，提示CS-IGF-1C/β-GP也適合于在正常體溫條件下，在體內(nèi)原位成膠。

實(shí)施例3：CS-IGF-1C的生物相容性

CCK-8染色

我們將材料或水凝膠涂布于96孔板(5微升/孔)，將孔板放置于溫箱(37℃)孵育30分鐘(而后直接使用或于4℃儲存)。一方面，為了評價(jià)不同濃度CS-IGF-1C材料對于細(xì)胞活性的影響，將材料按照1％、1.5％、3％、5％和10％的梯度涂布于孔板培養(yǎng)ADSCs，24小時(shí)后進(jìn)行CCK-8染色。另一方面，為了比較CS-IGF-1C和CS水凝膠對于細(xì)胞增殖的影響，將兩種水凝膠(濃度為3％)涂布于孔板培養(yǎng)ADSCs，24小時(shí)后進(jìn)行CCK-8染色。細(xì)胞均按照3×104/孔的濃度鋪盤(4孔/組)。具體染色方法如下：

1.配制CCK-8染色液(按照CCK-8原液:完全培養(yǎng)基＝1:9進(jìn)行稀釋)；

2.吸出培養(yǎng)基；

3.每孔加入100微升染色液，將孔板放入溫箱(37℃)孵育4小時(shí)；

4.吸出上清(100微升)并轉(zhuǎn)移到新的孔板中；

5.使用酶標(biāo)儀檢測(吸光度)OD 450值；

細(xì)胞活死染色

如前述方法在96孔板中涂布CS或CS-IGF-1C水凝膠，將ADSCs按照3×104/孔的濃度鋪盤(4孔/組)。在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行活死染色評價(jià)細(xì)胞的活力。具體步驟為：

1.配制染色劑(按照1:1000稀釋)：乙錠二聚體-1(Etidium Homodimer-1)和鈣綠素-AM(calcein-AM)各取1微升加入到1毫升基本培養(yǎng)基或PBS中。

2.吸去培養(yǎng)基，輕輕加入PBS洗滌(100微升，2次)。

3.每孔加入100微升染色劑，將孔板放入溫箱(37℃)孵育30分鐘。

4.直接置于倒置熒光顯微鏡下觀察，活細(xì)胞被鈣綠素-AM染成綠色，死細(xì)胞被乙錠二聚體-1染成紅色。拍照、計(jì)數(shù)活細(xì)胞所占比例并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

為了評價(jià)CS-IGF-1C材料的細(xì)胞相容性，按照濃度梯度將其涂布于孔板培養(yǎng)ADSCs，24小時(shí)后行CCK-8染色。發(fā)現(xiàn)3％濃度的材料組細(xì)胞的活性最優(yōu)，且為普通培養(yǎng)條件下的3倍(p<0.05)。(圖3)。體外培養(yǎng)7天、14天、21天，各組活細(xì)胞比例均>80％。這說明體外長期培養(yǎng)情況下，CS-IGF-1C和CS水凝膠沒有細(xì)胞毒性。

實(shí)施例4：CS-IGF-1C水凝膠促進(jìn)ADSCs體外增殖并增強(qiáng)其抗凋亡能力

體外細(xì)胞生物發(fā)光成像

1.使用P3代生長狀態(tài)良好的ADSCs，胰酶消化后使用α-MEM完全培養(yǎng)基重懸。

2.向不同條件(未處理、CS涂布、CS-IGF-1C涂布)預(yù)處理的96孔板的每個(gè)孔中分別加入一定濃度的(3000細(xì)胞/孔)細(xì)胞懸液。

3.將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后，棄上清，PBS洗1次。

4.向每個(gè)孔加入預(yù)先使用PBS溶液1:100稀釋的Fluc的底物(D-Luciferin)20微升覆蓋孔板底部。立即將孔板置入小動物活體成像系統(tǒng)暗箱內(nèi)，曝光1秒鐘。

5.數(shù)據(jù)分析：使用Living Image軟件測定每孔細(xì)胞的熒光信號強(qiáng)度。

利用BLI技術(shù)評價(jià)水凝膠對于ADSCs增殖的影響，當(dāng)ADSCs培養(yǎng)于CS-IGF-1C處理的孔板時(shí)，細(xì)胞增殖速度明顯高于其他培養(yǎng)條件(p<0.05)(圖4)。此外，使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測增殖相關(guān)基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示相比于其他培養(yǎng)條件，在CS-IGF-1C涂布孔板上培養(yǎng)的ADSCs中IGF-1、HGF和EGF基因表達(dá)急劇上升(p<0.05)。在體外利用H2O2對在不同條件下(未涂布材料組、CS涂布組和CS-IGF-1C涂布組)培養(yǎng)的ADSCs誘導(dǎo)損傷，評價(jià)CS-IGF-1C水凝膠是否對凋亡細(xì)胞具有保護(hù)作用。使用BLI技術(shù)檢測細(xì)胞存活情況使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR評價(jià)凋亡相關(guān)基因(Bax/Bad、Caspase-9/-3和Fas/Fasl)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，CS-IGF-1C水凝膠涂布組細(xì)胞凋亡明顯減輕，且凋亡基因的表達(dá)急劇降低(p<0.05)。

實(shí)施例5：CS-IGF-1C水凝膠促進(jìn)ADSCs體內(nèi)存活和增殖

對8-10周齡FVB雄性小鼠誘導(dǎo)單側(cè)急性腎臟缺血再灌注損傷。根據(jù)動物接受治療類型進(jìn)行分組(每組30只)：Sham組(假手術(shù)組，僅進(jìn)行腎臟探查，不經(jīng)受損傷和治療)；PBS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射30微升PBS)；CS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射30微升CS水凝膠)；ADSCs組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射溶于30微升PBS的106ADSCs)；ADSCs/CS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射溶于30微升CS水凝膠的106ADSCs)；ADSCs/CS-IGF-1C組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射溶于30微升CS-IGF-1C水凝膠的106ADSCs)。

急性腎臟損傷模型

急性腎臟損傷及細(xì)胞治療

(1)經(jīng)腹腔注射水合氯醛(4％，350毫克/千克)麻醉小鼠，于背部中部、脊柱左側(cè)0.2厘米處縱行切開皮膚(0.8-1厘米)，分離皮下結(jié)締組織，離斷背部肌肉進(jìn)入腹腔，探查并暴露左腎，可見正常腎臟呈現(xiàn)鮮紅色；

(2)用尖鑷游離腎周脂肪及筋膜，向左側(cè)輕輕牽拉腎臟暴露腎蒂，使用微型血管夾略靠近腎臟夾閉腎蒂，約1分鐘可見腎臟出現(xiàn)淤血呈紫黑色；

(3)腎臟缺血期間，使用浸沾溫生理鹽水的紗布覆蓋切口并保持紗布濕潤，小鼠上方暖燈照射并保持加熱墊溫度(37℃)恒定；

(4)缺血40分鐘后移除血管夾，肉眼可見腎臟顏色即刻變?yōu)榧t色，使用4-0絲線逐層縫合肌層和皮膚關(guān)閉背部切口；

(5)將小鼠置于加熱墊上復(fù)溫，待蘇醒后放回飼養(yǎng)籠。

重度腎臟損傷模型

(1)麻醉小鼠，并行左側(cè)腎臟缺血再灌注損傷，方法同上；

(2)缺血損傷期間，用同樣方式切開右側(cè)背部皮膚，分離皮下組織和肌肉，探查并暴露右腎；

(3)游離腎周組織后，使用尖鑷分離出右輸尿管，使用6- 0絲線(靠近腎臟)雙結(jié)結(jié)扎腎蒂，同時(shí)注意保護(hù)輸尿管，并切除腎臟；

(4)必要時(shí)，使用棉簽吸凈腹腔內(nèi)血性滲出物，查無明顯出血逐層縫合。

在腎臟缺血再灌注后(對于重度損傷模型，在對側(cè)腎臟切除術(shù)后)，即刻行左腎內(nèi)遞送細(xì)胞或水凝膠。

細(xì)胞/水凝膠/PBS遞送方法

在腎臟缺血再灌注后(對于重度損傷模型，在對側(cè)腎臟切除術(shù)后)，即刻行左腎內(nèi)遞送細(xì)胞或水凝膠。

(1)使用鑷子將腎臟輕輕提拉到體外，用細(xì)棉條或紗布條包裹并固定腎臟；

(2)使用胰島素注射器(300微升規(guī)格)吸取輸送介質(zhì)(PBS或水凝膠，30微升)負(fù)載的細(xì)胞(106ADSCs)，于腎臟上極、中部和下極三個(gè)部位輕輕刺入腎臟實(shí)質(zhì)(深度約3毫米)，緩慢輕推注射器(10微升/部位)，同時(shí)觀察小鼠的呼吸頻率；

(3)注射完成后，緩慢拔除注射器，同時(shí)使用棉球按壓進(jìn)針處腎臟組織止血1分鐘。

為了評價(jià)腎臟功能學(xué)變化，我們對雄性FVB小鼠(每組10只)誘導(dǎo)重度腎臟損傷模型，即單側(cè)腎臟缺血再灌注損傷加對側(cè)腎臟切除術(shù)。

小動物活體生物發(fā)光成像

1.經(jīng)腹腔注射水合氯醛(4％，350毫克/千克)麻醉小鼠；

2.向小鼠經(jīng)腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin(150毫克/千克)；

3.底物注射5分鐘后，將小鼠放入小動物活體成像系統(tǒng)暗箱內(nèi)，擺放好體位(俯臥位)，將其頭部對準(zhǔn)暗箱內(nèi)出氣孔；

4.根據(jù)熒光信號強(qiáng)度調(diào)整曝光時(shí)間，一般為0.5-2分鐘，連續(xù)采集圖像直到信號強(qiáng)度開始下降；

5.數(shù)據(jù)分析：使用Living Image軟件測定每只小鼠的熒光信號強(qiáng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

腎臟冰凍切片免疫染色

1.將切片從-20℃冰箱中取出，室溫放置30分鐘；

2.將切片放入(-20℃預(yù)冷30分鐘的)丙酮原液中固定10分鐘；

3.將切片置于空氣中干燥30分鐘；

4.使用PBS洗滌切片(5分鐘，2次)；

5.破膜：0.1％Triton X-100，室溫，10分鐘；PBS洗滌，5分鐘，2次；

6.血清封閉，4℃，45分鐘；

7.加一抗，4℃，過夜；

8.次晨復(fù)溫，1小時(shí)；PBS洗滌，5分鐘，4次；

9.加二抗(避光)，室溫，2小時(shí)；PBS洗滌，5分鐘，5次；

10.DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

為了評價(jià)CS-IGF-1C促進(jìn)細(xì)胞存活的作用，在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)，利用BLI技術(shù)縱向追蹤注射到受損腎臟中ADSCsFluc-GFP的存活情況。結(jié)果顯示，在全部時(shí)間點(diǎn)，ADSCs/CS-IGF-1C組的信號顯著高于ADSCs/CS組(p<0.05)這說明與未修飾的CS水凝膠相比，CS-IGF-1C水凝膠更有利于改善局部遞送的細(xì)胞存活。此外，免疫染色的結(jié)果也證實(shí)了CS-IGF-1C水凝膠對移植細(xì)胞的保護(hù)作用。同時(shí)，免疫染色發(fā)現(xiàn)CS-IGF-1C水凝膠能夠促進(jìn)ADSCs的增殖。

實(shí)施例6：CS-IGF-1C水凝膠增強(qiáng)ADSCs促血管新生作用

VEGF-R2轉(zhuǎn)基因小鼠評價(jià)血管新生

為了評價(jià)水凝膠能否增強(qiáng)細(xì)胞在體內(nèi)促進(jìn)血管新生作用，我們對VEGF-R2轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)急性缺血再灌注損傷并進(jìn)行細(xì)胞治療(方法如前所述)。分組(每組6只)：S小時(shí)am組(假手術(shù)組，僅進(jìn)行腎臟探查，不經(jīng)受損傷和治療)；PBS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射30微升PBS)；CS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射30微升CS水凝膠)；ADSCs組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射溶于30微升PBS的106ADSCs)；ADSCs/CS組 (經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射溶于30微升CS水凝膠的106ADSCs)；ADSCs/CS-IGF-1C組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內(nèi)注射溶于30微升CS-IGF-1C水凝膠的106ADSCs)。移植的細(xì)胞為：從同品系野生型C57BL/6J分離培養(yǎng)的ADSCs。在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)，使用BLI技術(shù)(方法如前所述)評價(jià)VEGF-R2基因的表達(dá)。

免疫染色方法見實(shí)施例5

為了闡明CS-IGF-1C水凝膠增強(qiáng)ADSCs促血管新生效應(yīng)的機(jī)制，對表達(dá)VEGF-R2-Fluc轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)腎臟缺血損傷模型，接受同品系小鼠來源的ADSCs的移植治療(并根據(jù)治療方式進(jìn)行分組)。損傷后不同時(shí)間點(diǎn)，使用BLI技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測血管生成，比較各種治療方式促進(jìn)VEGF-R2基因表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，接受ADSCs/CS-IGF-1C共同移植的小鼠腎臟VEGF-R2的表達(dá)顯著高于接受其他治療的動物(p<0.05)。細(xì)胞移植后3天，利用CD31染色評價(jià)腎臟血管新生情況，發(fā)現(xiàn)ADSCs/CS-IGF-1C組毛細(xì)血管數(shù)量顯著高于其他組(p<0.05)。此外，評價(jià)體外培養(yǎng)不同條件下，ADSCs中血管新生相關(guān)基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CS-IGF-1C水凝膠處理能顯著上調(diào)基因的表達(dá)(p<0.05)。

實(shí)施例7：CS-IGF-1C和ADSCs共同移植增強(qiáng)腎臟細(xì)胞增殖并減少凋亡

免疫染色方法見實(shí)施例5

在損傷后3天，使用PCNA和TUNEL染色評價(jià)細(xì)胞聯(lián)合水凝膠治療對腎小管上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，ADSCs/CS-IGF-1C共同移植能最大程度地增加腎臟小管上皮增殖細(xì)胞的數(shù)量并減少細(xì)胞凋亡(p<0.05)。

實(shí)施例8：CS-IGF-1C和ADSCs共同移植加速腎臟組織和功能學(xué)修復(fù)

過碘酸希夫(PAS)染色

1.脫蠟：二甲苯I、II，各10分鐘；風(fēng)干，10分鐘；

2.至水：99％乙醇I、II，各5分鐘；95％、90％、80％乙醇，各5分鐘；

3.清水洗滌，5分鐘；

4.滴加高碘酸，氧化10分鐘。清水洗滌，5分鐘；

5.滴加Schiff液(1分鐘)，目測變紅即終止；清水洗，2-3分鐘；

6.Harris蘇木素染核，2-3分鐘；清水洗，5分鐘；

7.鹽酸-乙醇分化1秒；清水洗，5分鐘；

8.脫水：70％、80％、90％、95％乙醇3秒，99％乙醇5分鐘，2次；風(fēng)干5分鐘；

9.透明：二甲苯I、II，各5分鐘；風(fēng)干，5鐘；

10.中性樹膠封片后顯微鏡下觀察，染色陽性物質(zhì)呈紫紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色。

腎臟功能學(xué)檢測

在腎臟重度損傷(單側(cè)40分鐘缺血再灌注損傷+對側(cè)腎臟切除)后，于不同時(shí)間點(diǎn)(2、4、7、10、14和28天)采集小鼠外周血行腎功能檢測(每組10只)。外周血的采集主要使用球后靜脈叢采血法，具體步驟如下：

1.使用水合氯醛(4％，350毫克/千克)經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠；

2.左手拇指、食指壓迫小鼠一側(cè)眼眶后側(cè)皮膚暴露眼球；

3.右手持肝素化毛細(xì)吸管從眼眶側(cè)后方輕輕刺入，深度約4毫米，待吸管觸碰到眼眶骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)動毛細(xì)吸管并前后游走輕刺骨壁，血液自毛細(xì)吸管流出；

4.使用EP管在毛細(xì)吸管另一端收集血液(約200微升)。

將收集的血液標(biāo)本置于37℃溫箱中1小時(shí)，離心(1200轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)，收集血清標(biāo)本送檢(或于-20℃保存)。使用生化自動分析儀檢測血清中BUN和血肌酐水平，以毫克/立方分米作為血清學(xué)指標(biāo)的表示單位。

對損傷后3天的腎臟組織切片進(jìn)行高碘酸-希夫(PAS)染色，并對腎小管的組織學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行半定量評分。結(jié)果顯示，ADSCs/CS-IGF- 1C共同移植能最大程度緩解管型形成、小管壞死和擴(kuò)張、刷狀緣缺失等損傷表現(xiàn)。此外，對小鼠施加嚴(yán)重的AKI(左側(cè)40分鐘I/R損傷，同時(shí)行右側(cè)腎臟切除術(shù))。在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)，檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐的水平。結(jié)果顯示，ADSCs/CS-IGF-1C共同移植能顯著加快腎臟功能學(xué)恢復(fù)。

實(shí)施例9：CS-IGF-1C水凝膠與ADSCs共同移植治療心肌梗死

冠狀動脈左前降支永久結(jié)扎建立及細(xì)胞-水凝膠移植：

(1)小鼠麻醉：用5％的異氟烷氣體預(yù)麻小鼠，用醫(yī)用膠帶固定小鼠的四肢和頭部于手術(shù)板上，剪開頸部氣管，氣管插管后接通麻醉呼吸機(jī)正壓通氣，調(diào)節(jié)異氟烷的含量約為1％-1.5％，呼吸頻率為120/分鐘；

(2)胸部備皮，用醫(yī)用酒精和碘伏進(jìn)行消毒；

(3)行胸廓切開術(shù)，于第四肋間處開胸并暴露心臟，仔細(xì)撕開心包膜暴露小鼠左心室前壁；

(4)左冠狀動脈起始端的下方距離左心耳約1毫米處，用7-0的縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支(以結(jié)扎點(diǎn)下方心肌的顏色變淺發(fā)白或出現(xiàn)紫黑色且心電圖(electrocardioram，ECG)檢測顯示心肌電ST段抬高為結(jié)扎成功的標(biāo)志；

(5)結(jié)扎成功后于結(jié)扎位點(diǎn)左下、右下各1毫米處分別注射10微升生理鹽水、細(xì)胞生理鹽水懸液、水凝膠或凝膠-ADSCs復(fù)合物；

(6)關(guān)胸，縫合肌肉和皮膚，傷口用碘伏再次消毒，妥善飼養(yǎng)。

(7)假手術(shù)(sham)對照組：開胸，穿線不接扎不移植任何細(xì)胞或溶液，后關(guān)胸縫合肌肉。

此外，利用免疫染色、心臟超聲等手段評價(jià)心肌再生情況。

使用CS-IGF-1C水凝膠負(fù)載ADSCs局部注射受損心肌組織，結(jié)果顯示，CS-IGF-1C保護(hù)ADSCs的存活，增強(qiáng)其促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖、抗凋亡、以及刺激血管新生能力，改善心肌肥大并促進(jìn)心臟功能和結(jié)構(gòu)的恢 復(fù)，并減少心肌組織纖維化的發(fā)生。

實(shí)施例10：CS-IGF-1C水凝膠與ADSCs共同移植治療皮膚損傷

真皮層全層皮膚損傷模型的建立及細(xì)胞-水凝膠移植：

(1)裸鼠腹腔內(nèi)注射4％水合氯醛進(jìn)行全身麻醉。

(2)麻醉效果滿意后，75％酒精消毒裸鼠背部皮膚3遍。

(3)用眼科剪剪除全層裸鼠皮膚及肉膜，暴露肌肉層，制備出面積為l.0立方厘米的皮膚缺損區(qū)域。

(4)IV3000無菌不透水傷口敷料覆蓋創(chuàng)面，貼膜邊緣用傷口粘合劑點(diǎn)附于裸鼠背部皮膚。

(5)術(shù)后裸鼠單籠飼養(yǎng)，自第3天起每隔2天更換創(chuàng)面敷料。

(6)水凝膠-ADSCs以1×106/毫升的密度接種于水凝膠中，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠注射200微升生理鹽水(不治療組)、細(xì)胞生理鹽水懸液(單純細(xì)胞組)、水凝膠-ADSCs(對照水凝膠與細(xì)胞組)、水凝膠。

(7)術(shù)后大體觀測及愈合曲線測定，每天觀察并記錄各組裸鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食飲水情況、活動力、大小便情況。

(8)術(shù)后每隔2天麻醉后首先行活體成像檢測，然后去除傷口敷料、仔細(xì)清除創(chuàng)面滲出物、痂皮，觀察創(chuàng)面有無感染、創(chuàng)面愈合情況，并進(jìn)行創(chuàng)面拍照同時(shí)以透明薄膜描印創(chuàng)面。

(9)拍照后，創(chuàng)面重新用IV3000無菌不透水傷口敷料貼膜覆蓋，貼膜邊緣用傷口粘合劑點(diǎn)附于裸鼠背部皮膚。使用Image J軟件分析各組術(shù)后第3、6、9、l2天殘留創(chuàng)面面積，并繪制愈合曲線。

此外，利用免疫染色評價(jià)皮膚組織再生情況。

建立小鼠皮膚缺損模型，使用CS-IGF-1C水凝膠負(fù)載骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)局部注射到皮膚缺損部位，CS-IGF-1C增強(qiáng)BMSCs的存活和增殖，并有利于BMSCs促進(jìn)局部皮膚組織的修復(fù)，加快血管新生，并減少組織纖維化的發(fā)生。