本發(fā)明屬于化妝品領(lǐng)域，具體涉及一種菠蘿酵素及其制備方法與抑制酪氨酸酶的用途。

背景技術(shù)：

黑色素(melanin)主要由人體的黑色素細胞產(chǎn)生，它能減少紫外線對皮膚的傷害；然而黑色素的異常蓄積會造成色素沉著過度，容易引起雀斑、老年斑、黑斑病等。研究者發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶在黑色素的生物合成過程中有重大作用。在黑色素生物合成過程中，酪氨酸酶起著十分重要的催化作用。酪氨酸酶能夠促進L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為L-多巴，L-多巴又經(jīng)過氧化而轉(zhuǎn)化為多巴醌，多巴醌多聚生成黑色素。

菠蘿果肉屬于菠蘿的食用部位，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)；但是菠蘿果皮及菠蘿葉是不可食用部分，是菠蘿加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物，若不加以處理及利用，會對環(huán)境造成污染和資源浪費。本發(fā)明的目的是研究菠蘿果肉、果皮及葉對酪氨酸酶的抑制作用，若有一定作用，在今后的生產(chǎn)生活中就不會造成資源浪費，同時也會減少對環(huán)境的污染。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種菠蘿酵素，其特征在于所述菠蘿酵素由如下方法制備，所述方法包括如下步驟：

取一定質(zhì)量的原料，經(jīng)預(yù)處理后，置于經(jīng)無菌處理的發(fā)酵罐中，然后加入原料質(zhì)量的20％-35％質(zhì)量的葡萄糖后，將發(fā)酵罐密封，于15-25℃下，自然發(fā)酵，25-35天。所述原料為新鮮菠蘿果皮、菠蘿果肉或菠蘿葉；所述預(yù)處理包括如下步驟：將原料用自來水沖洗2-3次，然后用蒸餾水沖洗1-2次，再用無菌水沖洗1-2次，再用75％的乙醇沖洗2次，紫外燈照射5分鐘，最后將其切碎。

本發(fā)明提供的菠蘿酵素依靠菠蘿果皮或菠蘿葉表面的野生酵母菌、或菠蘿蛋白酶，在葡萄糖存在下，自然發(fā)酵得到的，具有原料廉價易得，變廢為寶的特點，本發(fā)明不僅解決了菠蘿加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物——菠蘿果皮資源浪費、對環(huán)境造成污染的問題，而且通過自然發(fā)酵技術(shù)還得到了具有抑制酪氨酸酶作用的菠蘿酵素，可用于化妝品領(lǐng)域作為美白劑，天然無刺激。

本發(fā)明提供一種菠蘿酵素的制備方法，其特征在于包括如下步驟：取一定質(zhì)量的原料，經(jīng)預(yù)處理后，置于經(jīng)無菌處理的發(fā)酵罐中，然后加入原料質(zhì)量的20％-35％質(zhì)量的葡萄糖后，將發(fā)酵罐密封，于15-25℃下，自然發(fā)酵，25-35天。所述原料為新鮮菠蘿果皮、菠蘿果肉或菠蘿葉；所述預(yù)處理包括如下步驟：將原料用自來水沖洗2-3次，然后用蒸餾水沖洗1-2次，再用無菌水沖洗1-2次，再用75％的乙醇沖洗2次，紫外燈照射5分鐘，最后將其切碎。

本發(fā)明制備方法中“75％的乙醇沖洗2次，紫外燈照射5分鐘”是為了殺滅細菌，酵母菌基本不受影響。

本發(fā)明提供一種菠蘿酵素在制備美白劑中的用途，所述菠蘿酵素選自菠蘿果皮酵素、菠蘿果肉酵素或菠蘿葉酵素。

本發(fā)明提供一種菠蘿酵素在抑制酪氨酸酶方面的應(yīng)用，所述菠蘿酵素選自菠蘿果皮酵素、菠蘿果肉酵素或菠蘿葉酵素。

附圖說明

圖1黑色素的吸光值與溫度(A-T)圖

圖2黑色素的吸光值與反應(yīng)時間(A-t)圖

圖3黑色素的吸光值與L-酪氨酸物質(zhì)的量濃度(A-C)圖

圖4黑色素的吸光值與L-酪氨酸用量(A-V)圖

圖5黑色素的吸光值與土豆質(zhì)量/緩沖溶液體積圖

圖6菠蘿果皮酵素濃度與酪氨酸酶抑制率的關(guān)系圖

圖7菠蘿果肉酵素濃度與酪氨酸酶抑制率的關(guān)系圖

圖8菠蘿葉酵素濃度與酪氨酸酶抑制率的關(guān)系圖

圖9熊果苷酵素濃度與酪氨酸酶抑制率的關(guān)系圖

具體實施方案

本發(fā)明中涉及的酪氨酸酶是可按文獻的方法(李好樣，呂海燕，董金龍.馬鈴薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究[J].光譜實驗室，2008，25(6)：1040-1043)從土豆中提取的；或按下列方法提?。簩⑼炼瓜磧粝髌ぃ袎K后放置于冰箱冷凍層，冷凍過夜。需用時取出稱重，與相應(yīng)比例的緩沖溶液[土豆質(zhì)量：緩沖溶液體積＝1：5(g/mL)]共置于攪拌機中攪拌；將所得溶液進行離心，離心速率為4000r/min，離心時長為5min，取上清液為實驗所用(即土豆提取液)。

本發(fā)明所述的緩沖溶液為pH＝6.86的混合磷酸鹽緩沖溶液。

本發(fā)明從菠蘿的不同部位(果皮、果肉、葉)中提取出酵素，測定其對土豆中酪氨酸酶活性的抑制作用，通過計算抑制率來反映抑制作用。用熊果苷作為陽性對照，比較IC50的大小(任紅榮，單承鶯，姜洪芳，等.香水蓮花提取物抑制酪氨酸酶活性的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23(06)：1122-1126；葉孝兆，龔盛昭，廖國俊，等.當歸提取物對酪氨酸酶的抑制作用[J].日用化學(xué)工業(yè)，2010，40(02)：98-100)。

抑制率計算公式：[1-(T2-T1)/(C2-C1)]×100％

C1表示只有底物(土豆提取液和緩沖溶液的混合溶液)的吸光度值，C2表示含有底物和L-酪氨酸的吸光度值，C2-C1表示在扣除底物的吸光度后生成的黑色素的吸光度值。T1表示含有底物和樣品的吸光度值，T2表示含有底物、L-酪氨酸和樣品的吸光度值，T2-T1表示經(jīng)過樣品的抑制，在扣除樣品和底物的吸光度后剩余的黑色素的吸光度值。

實施例1酪氨酸酶促進L-酪氨酸生成黑色素的最佳活性條件的確定

(1)溫度對酪氨酸酶最佳活性的影響

取10mL干凈干燥的棕色容量瓶8個，分為4組，每組2個，分別標記為C1和C2。按照表1加入各試液：

表1體系組成及各試劑加入量

按照上表給4組容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和L-酪氨酸溶液作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液，將4組溶液分別置于0℃、10℃、30℃、40℃下，反應(yīng)35min后，立即進行吸光度的測量(測量波長為475nm為最好)。如圖1。

(2)體系反應(yīng)時間對酪氨酸酶最佳活性的影響

取100mL干凈干燥的棕色容量瓶兩個，標記為C1和C2，按照表2加入各試液：

表2體系組成及各試劑加入量

按照上表給2個容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和L-酪氨酸溶液作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液，將容量瓶置于10℃水浴，每隔5min測量一個吸光度，反應(yīng)總時長為90min(測量波長為475nm)。如圖2。

(3)L-酪氨酸物質(zhì)的量濃度對酪氨酸酶最佳活性的影響

用電子天平準確稱取0.0181g的L-酪氨酸粉末，用緩沖溶液溶解定容于100ml的容量瓶中,可得1mmol/L的L-酪氨酸溶液。

取6個10mL干凈干燥的容量瓶，分別加入上述溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL，用緩沖溶液定容至刻度線，即得物質(zhì)的量濃度分別為0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L的L-酪氨酸溶液。

另取10mL干凈干燥的棕色容量瓶12個，分為6組，每組2個，分別標記為C1和C2。按照表3加入各試液：

表3體系組成及各試劑加入量

按照上表給4組容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和不同物質(zhì)的量濃度的L-酪氨酸溶液作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖3。

(4)L-酪氨酸用量對酪氨酸酶最佳活性的影響

取10個10mL干凈干燥的容量瓶，分為5組，每組2個，分別標記為C1和C2。按照表4加入各試液：

表4體系組成及各試劑加入量

表中x為1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL，對應(yīng)y為8.0mL、7.5mL、7.0mL、6.5mL、6.0mL，向5組容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和不同量的L-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/L)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖4。

(5)土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比對酪氨酸酶最佳活性的影響

取10個10mL干凈干燥的容量瓶，分為5組，每組2個，分別標記為C1和C2。按照表4加入各試液：

表5體系組成及各試劑加入量

土豆提取液中土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比(g/mL)分別為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。向5組容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和L-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/L)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖5。

經(jīng)確定酪氨酸酶促進L-酪氨酸生成黑色素的最佳活性條件：溫度10℃，反應(yīng)時間35min，L-酪氨酸物質(zhì)的量濃度為0.3mmol/L，L-酪氨酸的體積用量為2.5mL，制備土豆提取液時土豆質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為1：4。

實施例2

稱取新鮮菠蘿果皮2.0kg，用自來水沖洗2次，然后用蒸餾水沖洗1次，再用無菌水沖洗2次，再用75％的乙醇沖洗2次，紫外燈照射5分鐘，最后將其切碎，置于經(jīng)無菌處理的發(fā)酵罐中，然后加入400g葡萄糖后，將發(fā)酵罐密封，于15-25℃下，自然發(fā)酵25天后，將發(fā)酵液取出，置于離心管中，經(jīng)離心后，取上清液，進行減壓濃縮，得到固體樣品10.83g，即為菠蘿果皮酵素。

實施例3

稱取新鮮菠蘿果皮1.0kg，用自來水沖洗2次，然后用蒸餾水沖洗2次，再用無菌水沖洗1次，再用75％的乙醇沖洗2次，紫外燈照射5分鐘，最后將其切碎，置于經(jīng)無菌處理的發(fā)酵罐中，然后加入350g葡萄糖后，將發(fā)酵罐密封，于15-25℃下，自然發(fā)酵35天后，將發(fā)酵液取出，置于離心管中，經(jīng)離心后，取上清液，進行減壓濃縮，得到固體樣品6.65g，即為菠蘿果皮酵素。

實施例4

稱取新鮮菠蘿果肉1.0kg，用自來水沖洗2次，然后用蒸餾水沖洗2次，再用無菌水沖洗1次，再用75％的乙醇沖洗2次，紫外燈照射5分鐘，最后將其切碎，置于經(jīng)無菌處理的發(fā)酵罐中，然后加入350g葡萄糖后，將發(fā)酵罐密封，于15-25℃下，自然發(fā)酵35天后，將發(fā)酵液取出，置于離心管中，經(jīng)離心后，取上清液，進行減壓濃縮，得到固體樣品7.23g，即為菠蘿果肉酵素。

實施例5

稱取新鮮菠蘿葉2.0kg，用自來水沖洗2次，然后用蒸餾水沖洗1次，再用無菌水沖洗2次，再用75％的乙醇沖洗2次，紫外燈照射5分鐘，最后將其切碎，置于經(jīng)無菌處理的發(fā)酵罐中，然后加入400g葡萄糖后，將發(fā)酵罐密封，于15-25℃下，自然發(fā)酵25天后，將發(fā)酵液取出，置于離心管中，經(jīng)離心后，取上清液，進行減壓濃縮，得到固體樣品9.76g，即為菠蘿葉酵素。

經(jīng)HPLC分析，實施例2和實施例3制備得到的菠蘿果皮酵素的HPLC圖出峰情況一致性在95％，其與實施例4的出峰一致性較差，相似性僅為47％，與實施例5的出峰一致性更差，相似性僅為36％。

實施例6

在實施例1確定的酪氨酸酶促進L-酪氨酸生成黑色素的最佳活性條件下，分別測試實施例2、實施例4、實施例5制備得到的菠蘿果皮酵素、菠蘿果肉酵素、菠蘿葉酵素對酪氨酸酶活性的影響，以熊果苷作為陽性對照。

(1)菠蘿果皮酵素對酪氨酸酶活性的抑制作用

取1個25mL干凈干燥的容量瓶，精確稱量0.25g的菠蘿果皮酵素固體樣品，用緩沖溶液溶解定容于容量瓶中，可得濃度為10mg/mL的樣品溶液。

另取9個10mL干凈干燥的容量瓶，每個容量瓶中分別加入上述溶液0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL，用緩沖溶液定容至刻度線，可得質(zhì)量濃度分別為0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL的9瓶溶液，貼上標簽標記。

再取36個10mL干凈干燥的容量瓶，分為9組，每組4個，分別標記為C₁、C₂、T₁、T₂。按照表6加入各試液：

表6體系組成及各試劑加入量

按照上表給9組容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和L-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/L)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液(土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比為1:4),不同組中T1和T2中加入不同濃度的等量的樣品溶液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖6，在酪氨酸酶活性最佳條件下，當濃度為0.5mg/mL～3.0mg/mL之間時，樣品對酶活性的抑制率隨濃度的增大而增大，并在濃度為3.0mg/mL時達到最大值，此時的抑制率為76.11％；當濃度為3.0mg/mL～4.5mg/mL之間時，抑制率隨濃度的增大而減小。在抑制率上升部分，半數(shù)抑制濃度為0.98mg/mL，即IC₅₀＝0.98mg/mL。

(2)菠蘿果肉酵素對酪氨酸酶活性的抑制作用

取1個25mL干凈干燥的容量瓶，精確稱量0.25g的香水菠蘿果肉固體樣品，用緩沖溶液溶解定容于容量瓶中，可得濃度為10mg/mL的樣品溶液。

另取8個10mL干凈干燥的容量瓶，每個容量瓶中分別加入上述溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、1.8mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL，用緩沖溶液定容至刻度線，可得質(zhì)量濃度分別為1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL的8瓶溶液，貼上標簽標記。

再取32個10mL干凈干燥的容量瓶，分為8組，每組4個，分別標記為C₁、C2、T1、T2。按照表7加入各試液：

表7體系組成及各試劑加入量

按照上表給7組容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和L-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/L)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液(土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比為1:4)，不同組中T₁和T₂中加入不同濃度的等量的樣品溶液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖7，在酪氨酸酶活性最佳條件下，當濃度為0.5mg/mL～2.0mg/mL之間時，樣品對酶活性的抑制率隨濃度的增大而增大，并在濃度為2.0mg/mL時達到最大值，此時的抑制率為75.00％；當濃度為2.0mg/mL～4.0mg/mL之間時，抑制率隨濃度的增大而減小。在抑制率上升部分，半數(shù)抑制濃度為1.66mg/mL，即IC₅₀＝1.66mg/mL。

(3)菠蘿葉酵素對酪氨酸酶活性的抑制作用

取1個25mL干凈干燥的容量瓶，精確稱量0.25g的香水菠蘿葉固體樣品，用緩沖溶液溶解定容于容量瓶中，可得濃度為10mg/mL的樣品溶液。

另取8個10mL干凈干燥的容量瓶，每個容量瓶中分別加入上述溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL、5.5mL，用緩沖溶液定容至刻度線，可得質(zhì)量濃度分別為1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL的8瓶溶液，貼上標簽標記。

再取32個10mL干凈干燥的容量瓶，分為8組，每組4個，分別標記為C1、C2、T1、T2。按照表8加入各試液：

表8體系組成及各試劑加入量

按照上表給8組容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和L-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/L)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液(土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比為1:4),不同組中T1和T2中加入不同濃度的等量的樣品溶液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖8，在酪氨酸酶活性最佳條件下，當濃度為1.0mg/mL～4.0mg/mL之間時，樣品對酶活性的抑制率隨濃度的增大而增大，并在濃度為4.0mg/mL時達到最大值，此時的抑制率為81.44％；當濃度為4.0mg/mL～5.5mg/mL之間時，抑制率隨濃度的增大而減小。在抑制率上升部分，半數(shù)抑制濃度為1.97mg/mL，即IC₅₀＝1.97mg/mL。

(4)熊果苷對酪氨酸酶活性的抑制作用

取1個25mL干凈干燥的容量瓶，精確稱量0.25g的熊果苷固體樣品，用緩沖溶液溶解定容于容量瓶中，可得濃度為10mg/mL的樣品溶液。

另取9個10mL干凈干燥的容量瓶，每個容量瓶中分別加入上述溶液0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.5mL、1.8mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL，用緩沖溶液定容至刻度線，可得質(zhì)量濃度分別為0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL的9瓶溶液，貼上標簽標記。

再取36個10mL干凈干燥的容量瓶，分為9組，每組4個，分別標記為C1、C2、T1、T2。按照表9加入各試液：

表9體系組成及各試劑加入量

按照上表給9組容量瓶加入對應(yīng)量的緩沖溶液和L-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/L)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對應(yīng)量的土豆提取液(土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比為1:4)，不同組中T1和T2中加入不同濃度的等量的樣品溶液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖9，在酪氨酸酶活性最佳條件下，當濃度為0.5mg/mL～2.0mg/mL之間時，樣品對酶活性的抑制率隨濃度的增大而增大，并在濃度為2.0mg/mL時達到最大，此時的抑制率為61.68％；當濃度為2.0mg/mL～3.5mg/mL之間時，抑制率隨濃度的增大而減小。在抑制率上升部分，半數(shù)抑制濃度為1.55mg/mL，即IC₅₀＝1.55mg/mL。

由本實施例(1)-(4)的測試結(jié)果(圖6-圖9)，可以看出菠蘿果皮酵素對酪氨酸酶的抑制活性最好(IC₅₀＝0.98mg/mL)，優(yōu)于菠蘿果肉酵素和菠蘿葉酵素及陽性對照熊果苷的活性。分析可能是菠蘿果皮依靠其表面野生酵母菌在葡萄糖存在下，自然發(fā)酵產(chǎn)生了對酪氨酸酶具有較高抑制活性的次級代謝產(chǎn)物，由其HPLC圖譜也可以看出，菠蘿果皮酵素與菠蘿果肉酵素和菠蘿葉酵素的出峰位置具有顯著不同。

實施例7

按照文獻(中草藥，第46卷第7期第949-954頁)的方法得到菠蘿葉95％的乙醇提取物和按照專利CN 104523463 A的方法得到菠蘿葉丙酮提取物，按照本發(fā)明實施例6中的方法，進行測試酪氨酸酶抑制活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菠蘿葉95％的乙醇提取物和菠蘿葉丙酮提取物在濃度為5mg/mL時，其對酪氨酸酶抑制率不足15％。