專利名稱：單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于致病微生物檢測技術領域，具體涉及一種利用切刻內切酶恒溫擴增(NEMA)技術進行菌樣的快速檢測的方試劑盒及其應用。
背景技術：
1929年，Nyfeldt第一次從病人體內分離出單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，它是一種重要的人畜共患病和食源性疾病的病原菌。李斯特菌病的發(fā)病率很低，但是致死率高達20 % 30 %，在新生兒和免疫低下的人群中更高達70 %。單核細胞增生李斯特氏菌在自然界中分布廣泛，研究表明，由單核細胞增生李斯特氏菌引起的食物中毒主要發(fā)生在水分活度較高的食品當中，例如，肉類、禽類、乳及乳制品、水產(chǎn)品等。其中，乳制品的污染率為5% 10%，肉及肉制品的污染率為30%，家禽的污染率為15%，水產(chǎn)品的污染率為4% 8%。該菌在我國被列為21世紀影響中國人健康的十二種病原微生物之一。在2000年，WHO食品安全工作計劃提出將單核細胞增生李斯特氏菌列為重點檢控的食源性致病菌之一。因此，需要建立一種有效的單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測試劑盒及其檢測方法，以克服現(xiàn)有技術的不足，從而為食品安全提供科學的依據(jù)和指導作用。本發(fā)明的主要原理如下:
(I)設計一對5'端帶切刻內切酶識別序列的引物和一對分別由生物素和FITC標記的探針；(2)把引物和目標菌的模板DNA加入到模板預處理反應液，在Taq Platinum DNA聚合酶作用下，通過幾個預變性和擴增的循環(huán)過程，把切刻內切酶識別序列引入到待擴增序列中，作為NEMA恒溫擴增的模板；(3)切刻內切酶識別NEMA模板上的識別序列，在其中一條核酸鏈上切割形成切
口，暴露其3'端；(4)在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3'端為起點，以未被切斷的另一條核酸鏈為模板，合成新的雙鏈核酸，舊鏈被剝離下來成為下一輪核酸合成的模板，同時在新合成的雙鏈核酸上恢復切刻內切酶識別位點；(5)切割、延伸和剝離的步驟重復進行，擴增出大量靶核酸序列；(6)擴增產(chǎn)物利用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測。核酸擴增完成后，在反應管中加入探針與擴增產(chǎn)物雜交。把檢測板水平放置在操作臺上，取雜交產(chǎn)物10 μ L加入檢測板的樣品孔中，再加入100 μ L緩沖液進行層析，IOmin
左右判讀結果。
通用型核酸擴增物快速檢測板的上C為質控區(qū)，T為檢測區(qū)。檢測板在質控區(qū)C和檢測區(qū)T均出現(xiàn)紅色條帶，為陽性結果，表明樣本中含有檢測的目標物；僅在質控區(qū)C出現(xiàn)紅色條帶，為陰性結果，表明樣本中為檢出目標物；質控區(qū)C和檢測區(qū)T內均無紅色條帶出現(xiàn)，表明快速檢測板失效。本發(fā)明的一個方面涉及單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測的引物及探針，其中正向引物序列為SEQ ID N0:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ;反向引物序列為 SEQ IDNO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；Pl探針的序列為SEQ ID NO:3:PI: 5-TGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACG-3 5 端標記生物素；P2探針的序列為SEQ ID NO:4:P2:5-GTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTG-3 3 端標記 FITC。本發(fā)明的另一個方面涉及一種單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，包括如下的組分:(I)模板預處理反應液:其中包括IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液，0.1 1.0mmol/I,dNTP, 0.1 1.0 μ mol/L 正向引物，0.1 1.0 μ mol/L 反向引物，Taq Platinum DNAPolymerase2.5U ；所述的IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液成分為:200mM Tris-HClρΗ8.8，IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgCl2 ；(2) NEMA恒溫擴增反應液:包括IOXNEBuffer 3 反應緩沖液，0.1 1.0mmol/L dNTP，5 % 30 % DMS0，
0.1 1.0 μ mol/L正向引物，0.1 1.0 μ mol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白(BSA)；其中所述的10 X NEBuffer 3 反應緩沖液成分為:IOOmmoI/L NaCl，50mmol/T,Tri s-HCI , 10mmol /T, MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9 ；(3) Nt.BspQI 切刻內切酶:4υ/μ L ；(4) Bst DNA 聚合酶:2U/ μ L ;(5)5'端標記生物素探針Pl和3'端標記FITC的探針Ρ2各10 μ mol/L(6)通用型核酸擴增物快速檢測板。型號:3號。上述試劑盒應用于檢測食品中的單核細胞增生李斯特氏菌，其使用方法，依次包括下列步驟(1)-(4):
(I)待檢樣品或細菌DNA的提取:提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1.6 2.0范圍內，濃度在
10 IOOng/ μ L范圍內；(2)模板預處理:將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴7min后迅速放入低于所檢菌引物Tm值溫度2°C的水浴中50s ;然后94°C水浴20s和低于所檢菌引物Tm值溫度2°C水浴50s，此過程反復進行5個以上循環(huán)；產(chǎn)物用于NEMA模板；(3) NEMA恒溫擴增反應:在裝有46 μ L NEMA擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA，LOyLNt.BspQI切刻內切酶和1.0yL Bst DNA聚合酶后，迅速放入低于所檢菌引物Tm值溫度2°C的水浴中60min。反應結束后取出；(4)產(chǎn)物檢測:反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0.5 μ L，90°C水浴3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增產(chǎn)物快速檢測板檢測產(chǎn)物。檢測線T和質控線C均顯示紅色，說明待檢樣品為陽性。本發(fā)明的試劑盒根據(jù)待檢菌株的保守基因序列設計5'端帶切刻內切酶識別序列的引物，保證檢測方法的特異性。本發(fā)明采用改進的切刻內切酶核酸恒溫擴增(NEMA)技術，該技術特異性強，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測即可，簡單、快速、安全、無污染，特別適用于食品檢測機構。
具體實施例方式下面結合實例對本發(fā)明的方法做進一步說明，但實例僅限于說明，并不限于此，其中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。實施例1:對單 核細胞增生李斯特氏菌標準菌株的檢測按下列配方制作單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增試劑盒:I)模板預處理反應液:每23μ 含有 2.5μ 10 X Taq Platinum bufferll, 1.0 μ L 2.5mmol/L dNTP,1.0 μ LlO μ mol/L正向引物，l.0uL 10 μ mol/L反向引物，l.0uL 2.5U/ μ L Taq PlatinumDNAPloymerase 和 16.5 μ L ddH20 (滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ；反向引物:SEQID NO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；2) NEMA恒溫擴增反應液:每46yL 含有 5yL IOXNEBuffer 3,1.0μ L 2.5mmol/L dNTP, l.0yL IOymol/L正向引物，1.0yL lOymol/L 反向引物，0.5yL 10mg/ml BSA,4y L DMSO 和 33.5 μ LddH20(滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ；反向引物:SEQID NO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；
3) Nt.BspQI 切刻內切酶:4υ/μ L ；4) Bst DNA 聚合酶:2U/ μ L ;5)探針 Pl 和 Ρ2:10 μ mol/L ;其中所述的探針Pl的序列為SEQ ID NO:35-TGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACG-3 5 端標記生物素；探針P2的序列為SEQ ID NO:4:5-GTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTG-3 3 端標記 FITC。6)核酸薄層層析檢測板。型號:3號；按照以下(I)-(4)程序進行檢測:(I)樣品單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株ATCC 7644DNA的提取:將單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株ATCC 7644增菌培養(yǎng)后，提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA O D260/OD280在1.6 2.0范圍內，濃度在10 IOOng/ μ L范圍內。(2)模板預處理:將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴7min后迅速放入60°C的水浴中50s ;然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環(huán)；產(chǎn)物用于NEMA模板。(3)進行NEMA恒溫擴增反應:將裝有46 μ L NEMA恒溫擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA，l.0yL Nt.BspQI切刻內切酶和1.0yL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min。反應結束后取出；(4)產(chǎn)物檢測:反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0.5μ ，90τ:水浴3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產(chǎn)物。在質控區(qū)C和檢測區(qū)T均出現(xiàn)紅色條帶，說明待檢樣品為單核細胞增生李斯特氏菌，并證明本發(fā)明的引物和探針在進行檢測的時候不會產(chǎn)生假陰性。實施例2:對大腸埃希氏菌ATCC 25922的檢測按下列配方制作單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增試劑盒:I)模板預處理反應液:每23 μ L 含有 2.5 μ L 10XTaq Platinum buffer II> 1.0 μ L 2.5mmol/L Dntp,
1.0 μ LlO μ mol/L正向引物，1.0 μ L 10 μ mol/L反向引物，1.0 μ L 2.5U/ μ L Taq PlatinumDNAPloymerase 和 16.5 μ L ddH20 (滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ；反向引物:SEQID NO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；2) NEMA恒溫擴增反應液:每46yL 含有 5yL IOXNEBuffer 3,1.0μ L 2.5mmol/L dNTP, l.0yL IOymol/L正向引物，1.0yL lOymol/L 反向引物，0.5yL 10mg/ml BSA,4y L DMSO 和 33.5 μ LddH20(滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ；反向引物:SEQID NO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；3) Nt.BspQI 切刻內切酶:4U/y L ；4) Bst DNA 聚合酶:2U/ μ L ;5)探針 Pl 和 Ρ2:10 μ mol/L ;其中所述的探針Pl的序列為SEQ ID NO:35-TGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACG-3 5 端標記生物素；探針P2的序列為SEQ ID NO:4:5-GTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTG-3 3 端標記 FITC。6)核酸薄層層析檢測板。型號:3號；按照以下(1)-(4)程序進行檢測:(I)待檢樣品(大腸埃希氏菌ATCC 25922)DNA的提取:提取待檢樣品大腸埃希氏菌ATCC 25922核酸，其中提取的樣品DNA0D260/0D280在1.6 2.0范圍內，濃度在10 IOOng/ μ L范圍內。(2)模板預處理:將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴7min后迅速放入60°C的水浴中50s ;然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環(huán)；產(chǎn)物用于NEMA模板。(3)進行NEMA恒溫擴增反應:將裝有46 μ L NEMA恒溫擴增反應液的反應管中加入2μ L預處理過的模板DNA，l.0yL Nt.BspQI切刻內切酶和1.0yL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min。反應結束后取出；(4)產(chǎn)物檢測:反應結束后， 反應管中加入探針Pl和P2各0.5μ ，90τ:水浴3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產(chǎn)物。質控區(qū)C顯示紅色條帶，檢測區(qū)T無紅色條帶出現(xiàn)，說明待檢樣品不是單核細胞增生李斯特氏菌。這個結果也證實了本發(fā)明的引物和檢測試劑盒在應用的時候不會產(chǎn)生假陽性。實施例3:對疑似感染單核細胞增生李斯特氏菌食品樣品的檢測將食品樣品按照實施例1描述的方法進行DNA的提取和擴增檢測，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產(chǎn)物。結果質控區(qū)C顯示紅色條帶，檢測區(qū)T也有紅色條帶出現(xiàn)，說明待檢樣品受到了單核細胞增生李斯特氏菌的感染。本發(fā)明的引物、探針和試劑盒還可以對其它的樣品進行單核細胞增生李斯特氏菌的檢測。
權利要求
1.一種單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測的引物及探針，其中: 正向引物序列為SEQ ID NO:1 ； 反向引物序列為SEQ ID N0:2 ； Pl探針的序列為SEQ ID NO:3: P2探針的序列為SEQ ID NO:4。
2.如權利要求1所述的單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測的引物及探針，其特征在于所述的Pl探針的5'端標記生物素，P2探針的3'端標記FITC0
3.權利要求1所述的引物和探針用于檢測食品中的單核細胞增生李斯特氏菌。
4.一種單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測試劑盒，包括如下的組分: (1)模板預處理反應液: 其中包括 IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液，0.1 1.0mmoI/LdNTP,0.1 .1.0 μ mol/L 正向引物，0.1 1.0 μ mol/L 反向引物，Taq PlatinumDNA Polymerase 2.5U ； 所述的 IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液成分為:200mM Tris_HClpH8.8，100mM KCl, 100mM(NH4) 2S04,20mM MgCl2 ； (2)NEMA恒溫擴增反應液: 包括 IOXNE Buffer 3 反應緩沖液，0.1 1.0mmoI/L dNTP，5% 30% DMS0,0.1 1.0 μ mol/L正向引物,0.1 1.0 μ mol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白； 其中所述的IOXNEBuffer 3反應緩沖液成分為:100mmol/L NaCl, 50mmol/LTri s-HCI , 10mmol /T, MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9 ；(3)Nt.BspQI 切刻內切酶:4υ/μ L ；(4)Bst DNA 聚合酶:2U/y L ； (5)5!端生物素標記探針Pl和3端FITC標記探針Ρ2各10 μ mol/L (6)通用型核酸擴增物快速檢測板； 其中正向引物、反向引物和探針P1、P2的序列如權利要求1所述。
5.權利要求4所述的試劑盒用于檢測食品中的單核細胞增生李斯特氏菌。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其使用方法包括如下的步驟: (1)待檢樣品或細菌DNA的提取: 提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26Q/0D28Q在1.6 2.0范圍內，濃度在10 IOOng/μ L范圍內； (2)模板預處理: 將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴7min后迅速放入低于所檢菌引物Tm值溫度2°C的水浴中50s ;然后94°C水浴20s和低于所檢菌引物Tm值溫度2°C水浴50s，此過程反復進行5個以上循環(huán)。產(chǎn)物用于NEMA模板； (3)NEMA恒溫擴增反應: 在裝有46 μ L NEMA擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA，LOyLNt.BspQI切刻內切酶和1.0yL Bst DNA聚合酶后，迅速放入低于所檢菌引物Tm值溫度2°C的水浴中60min,反應結束后取出； (4)產(chǎn)物檢測: 反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0.5 μ L，90°C水浴3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增 產(chǎn)物快速檢 測板檢 測產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單核細胞增生李斯特氏菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測的引物及探針，其中正向引物序列為SEQ ID NO1，反向引物序列為SEQ ID NO2；P1探針的序列為SEQ ID NO3；P2探針的序列為SEQ ID NO4。同時本發(fā)明還提供一種包含上述引物探針序列的，用于恒溫擴增快速檢測單核細胞增生李斯特氏菌的試劑盒，以及應用方法。本發(fā)明的試劑盒根據(jù)待檢菌株的保守基因序列設計引物和探針，從而保證檢測方法的特異性。且具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可。結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測即可，簡單、快速、安全、無污染，特別適用于食品檢測機構。
文檔編號C12Q1/44GK103173536SQ201210594019
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權日2012年12月21日
發(fā)明者姜英輝, 邵秀玲, 張曉梅, 雷質文, 李正義, 趙麗青, 祝素珍, 王建廣 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心