專利名稱：基于核酸內(nèi)切酶消化的甲基化dna定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲基化DNA的定量檢測(cè)方法，尤其涉及一種基于核酸內(nèi)切酶消化的甲基化DNA定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點(diǎn)的胞嘧啶(C)殘基的5，碳上被修飾了一個(gè)甲基。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修飾之一，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發(fā)生在DNA鏈上的CpG 二核苷酸的胞嘧啶(C)殘基上，這常見于基因5’端表達(dá)調(diào)控序列。DNA甲基化在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用，參與了動(dòng)物胚胎發(fā)育、基因印記和X 染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)互相作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個(gè)重要因素。CpG島局部甲基化水平的異常升高，可以導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達(dá)。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機(jī)率就會(huì)提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在腫瘤的早期檢測(cè)中的應(yīng)用，因?yàn)檠芯勘砻鞅碛^遺傳的變化伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，檢測(cè)DNA甲基化改變可以有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉有關(guān)。由于CpG島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測(cè)可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測(cè)。CpG島甲基化的檢測(cè)方法眾多，其原理分別基于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測(cè)法。甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶/Southern法 (methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern,MSRE- Southern)是比較傳統(tǒng)的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法(Methylation Specific PCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA檢測(cè)方法，是目前檢測(cè)DNA甲基化的常用方法，具有高靈敏度的同時(shí)，假陽性率也很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種甲基化DNA的定量檢測(cè)方法，能夠有效的分離出甲基化DNA和非甲基化DNA，并且解決了現(xiàn)有技術(shù)局限性大、方法復(fù)雜、需要樣本量大、容易被干擾、不適用混合樣本等缺點(diǎn)。本發(fā)明一種基于核酸內(nèi)切酶消化的甲基化DNA定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟
步驟1，用亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA，和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA ； 步驟2，在要檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)，選擇富含CpG位點(diǎn)的一段序列，以所選序列5’端的一部分的作為正向引物，以所選序列3’端的一段序列的互補(bǔ)序列作為反向引物；
步驟3，亞硫酸鹽處理過的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，用所述步驟2所設(shè)計(jì)的正向和反向PCR引物，加入Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲基化和非甲基化DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度；
步驟4，以亞硫酸鹽處理的待測(cè)DNA樣品作為PCR模板，在與步驟3相同的條件下，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；
步驟5，將步驟4所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加熱，使其溫度高于標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA相應(yīng)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度，而低于標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度；
步驟6，立即將步驟5中加熱的PCR產(chǎn)物進(jìn)行冷卻，將冷卻后的產(chǎn)物分為兩部分，一部分加入單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶，另一部分不加單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶，在相同的反應(yīng)條件下進(jìn)行消化，得到消化產(chǎn)物；
步驟7，向步驟6所得消化產(chǎn)物中分別加入對(duì)雙鏈DNA特異的熒光染料，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定雙鏈DNA的含量。上述檢測(cè)方法，其中，所述步驟1中所述亞硫酸鹽優(yōu)選為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA的處理方法為以0. 3M的NaOH變性待測(cè)DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌組成的PH值為5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時(shí)；脫硫并純化DNA。上述檢測(cè)方法，其中，所述步驟2中，使所設(shè)計(jì)的PCR引物優(yōu)選為1纊32堿基長(zhǎng)度， 在引物序列中所涉及的CpG位點(diǎn)數(shù)量可以為(Γ3個(gè)，且使所設(shè)計(jì)的引物的3’端的最后一個(gè)堿基不處于CpG的C的位置，以使PCR擴(kuò)增的DNA片段大小為8(Tl80堿基長(zhǎng)度，并使PCR 擴(kuò)增的序列中含有盡可能多的CpG位點(diǎn)。上述檢測(cè)方法，其中，在所述的引物序列中所涉及的CpG位點(diǎn)的C的位置，正向引物中可以用c/τ混合代替C，反向引物中可以用G/A混合代替G。 上述檢測(cè)方法，其中，所述步驟3中，使用實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，并分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲基化和非甲基化DNA擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度。上述檢測(cè)方法，其中，所述單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶為Τ7核酸內(nèi)切酶I、Sl核酸酶或綠豆核酸酶中的一種或幾種的混合。上述檢測(cè)方法，其中，所述對(duì)雙鏈DNA特異的熒光染料為STOR Green I。上述檢測(cè)方法，其中，所述待測(cè)DNA為人類基因組DNA，所述標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA為已確定的純的非甲基化人類基因組DNA和已確定的純的甲基化人類基因組 DNA。上述檢測(cè)方法，其中，所述待測(cè)DNA樣品為人類正常DNA，癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。上述檢測(cè)方法，其中，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；
所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；
所述體液為血液、腦脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液或陰道分泌液。本發(fā)明提供了一種甲基化DNA定量檢測(cè)方法，該方法具有適用范圍大、方法簡(jiǎn)單、 需要樣本量小、不易被干擾、適用混合樣本等優(yōu)點(diǎn)。在腫瘤早期檢測(cè)、個(gè)性化治療、病情判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。


圖1為本發(fā)明甲基化DNA定量檢測(cè)方法流程圖。
具體實(shí)施例方式參照?qǐng)D1，對(duì)本發(fā)明甲基化DNA定量檢測(cè)方法具體介紹如下 實(shí)施方式(一)
步驟1 采用亞硫酸鹽處理并純化已知的標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA和甲基化DNA，將處理過的甲基化DNA作梯度稀釋，且與一定量的非甲基化DNA混合，作為待測(cè)DNA樣品。其中，標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA為已知的甲基化DNA和非甲基化DNA ； 所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA的處理步驟為，以0. 3M NaOH變性待測(cè)DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌、pH5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時(shí)；脫硫并純化DNA。步驟2 確定待測(cè)基因檢測(cè)區(qū)域，按照基因序列設(shè)計(jì)并合成能同時(shí)擴(kuò)增亞硫酸鹽處理過的非甲基化DNA和甲基化DNA的正向PCR引物和反向PCR引物。其中引物設(shè)計(jì)的要求為在所要檢測(cè)的基因序列中，選擇一段序列作為目標(biāo)檢測(cè)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使這一段序列富含CpG位點(diǎn)。以這一段序列的5’端的一段序列作為PCR 的正向引物，以這一段序列的3’端的一段序列的互補(bǔ)序列作為PCR的反向引物，使PCR擴(kuò)增的DNA片段大小為8(Γ180堿基長(zhǎng)，使PCR擴(kuò)增的序列中含有盡可能多的CpG位點(diǎn)，一般為壙20個(gè)；所設(shè)計(jì)的PCR引物為1壙32堿基長(zhǎng)，在引物的序列中不含有或含有不超過3個(gè) CpG位點(diǎn)，在所涉及CpG位點(diǎn)的“C”的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G ；且使所設(shè)計(jì)的引物的3’端的最后一個(gè)堿基不處于CpG的“C”的位置。步驟3 以上述的PCR引物，以標(biāo)準(zhǔn)的非甲基化DNA和甲基化DNA為模板，以Taq DNA聚合酶，加入熒光染料，以實(shí)時(shí)定量PCR儀，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行解鏈溫度測(cè)定。其中所述的PCR操作過程，由正向和反向PCR引物、PCR擴(kuò)增緩沖液(Buffer)、 Taq DNA聚合酶、四種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNIPs)、所述亞硫酸鈉處理過的DNA模板 (Template)，純水組成的PCR體系，以熒光染料STOR Green I為指示劑，采用實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行解鏈溫度測(cè)定，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA樣品的 PCR產(chǎn)物的解鏈溫度。步驟4 將一定量的亞硫酸鈉處理過的標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA，與梯度稀釋的亞硫酸鈉處理過的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA混合，作為待測(cè)樣品；在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，相同條件是指除模板DNA以外，其他操作均與步驟2相同；但不進(jìn)行解鏈溫度測(cè)定。步驟5 將步驟4中所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行加熱至一個(gè)特定溫度，使這一溫度高于非甲基化DNA相應(yīng)的PCR產(chǎn)物解鏈溫度，而低于甲基化DNA相應(yīng)的PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，然后立即冷卻。步驟6:將步驟5中所加熱處理并冷卻的樣品，分為兩份，其中一份加入對(duì)單鏈DNA 特異的核酸內(nèi)切酶和相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液，在適當(dāng)條件下進(jìn)行消化處理，另一份作為對(duì)照。其中，所述對(duì)單鏈DNA特異的核酸內(nèi)切酶為T7核酸內(nèi)切酶I、S1核酸酶或綠豆核酸酶，或者是上述幾種的混合。步驟7 將步驟6所得消化產(chǎn)物，加入對(duì)雙鏈DNA特異的熒光染料STOR Green I， 以熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，記錄所測(cè)定的加入單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶時(shí)及不加入單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶時(shí)雙鏈DNA的濃度比例變化，并計(jì)算待測(cè)樣品中所含甲基化DNA的量。本發(fā)明一種甲基化DNA檢測(cè)方法，通過上述步驟檢驗(yàn)本發(fā)明的準(zhǔn)確度和靈敏度。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，能夠準(zhǔn)確而靈敏地測(cè)出DNA中是否存在甲基化DNA，就能夠?qū)τ谀[瘤的早期檢測(cè)、病情判斷和癌癥的復(fù)發(fā)監(jiān)控提供一種很好的指標(biāo)。實(shí)施方式(二)
在實(shí)施方式(一)的基礎(chǔ)上，以實(shí)際臨床樣品提取的DNA為待測(cè)樣品，在與上述實(shí)施方式 (一)相同的條件下，檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)用性。其中，與上述在實(shí)施方式(一)相同的條件，指的是除以實(shí)際臨床樣品提取的DNA為待測(cè)樣品外，所有操作與上述在實(shí)施方式(一)相同。所述臨床提取的待測(cè)DNA樣品，為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、各種體液DNA或各種排泄物DNA的樣品。所述癌細(xì)胞可以是肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織可以是肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述各種體液可以是血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。實(shí)施方式(三)
在實(shí)施方式(一)和(二)的基礎(chǔ)上，以P16基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的序列為例，具體PCR引物設(shè)計(jì)如下
P16基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的甲基化是肺癌等多種癌癥細(xì)胞具有的特征。P16基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的序列如下，
Homo sapiens pl6 protein (CDKN2A) gene, CpG island and partial cds, DQ325544. 1
CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCG GGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG 甲基化DNA序列，下劃線部分為要檢測(cè)的區(qū)域； CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCG GGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG 非甲基化DNA序列，下劃線部分為要檢測(cè)的區(qū)域； TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTG GGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGT GGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG 所設(shè)計(jì)的PCR引物正向引物 5’ - GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAG-3’ 反向引物 5，- TTAAACAACRCCCCCRCCTCCAACAA-3， 然后，按照實(shí)施方式(一)所述的方法，進(jìn)行檢測(cè)。上述內(nèi)容為本發(fā)明的具體實(shí)施例的例舉，對(duì)于其中未詳盡描述的試劑、設(shè)備、操作方法等，應(yīng)當(dāng)理解為采取本領(lǐng)域已有的普通及常規(guī)試劑、設(shè)備、操作方法等來予以實(shí)施。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于核酸內(nèi)切酶消化的甲基化DNA定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟1，用亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA、和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA ；步驟2，在要檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)，選擇含多個(gè)CpG位點(diǎn)的一段序列，以所選序列5’端的一部分的作為正向引物，以所選序列3’端的一段序列的互補(bǔ)序列作為反向引物；步驟3，以亞硫酸鹽處理過的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，用所述步驟2所設(shè)計(jì)的正向和反向PCR引物，加入Taq DNA聚合酶，以實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 并測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲基化和非甲基化DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度；步驟4，以亞硫酸鹽處理的待測(cè)DNA樣品作為PCR模板，在與步驟3相同的條件下，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；步驟5，將步驟4所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加熱，使其溫度高于標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA相應(yīng)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度，而低于標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度；步驟6，立即將步驟5中加熱的PCR產(chǎn)物進(jìn)行冷卻，將冷卻后的產(chǎn)物分為兩部分，一部分加入單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶，另一部分不加單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶，在相同的反應(yīng)條件下進(jìn)行消化，得到消化產(chǎn)物；步驟7，向步驟6所得消化產(chǎn)物中分別加入對(duì)雙鏈DNA特異的熒光染料，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定雙鏈DNA的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟1中所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA的處理方法為以0. 3M的NaOH變性待測(cè)DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌組成的pH值為5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時(shí)；脫硫并純化DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，使所設(shè)計(jì)的PCR引物為1壙32堿基長(zhǎng)度，在引物序列中所涉及的CpG位點(diǎn)數(shù)量可以為(Γ3個(gè)，且所設(shè)計(jì)的引物的3’端的最后一個(gè)堿基不處于CpG的C的位置；并使PCR擴(kuò)增的DNA片段大小為8(Tl80堿基長(zhǎng)度，使PCR 擴(kuò)增的序列中含有盡可能多的CpG位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述的引物序列中所涉及的CpG位點(diǎn)的C的位置，正向引物中用C/T混合代替C，反向引物中用G/A混合代替G。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶為 Τ7核酸內(nèi)切酶I、Sl核酸酶或綠豆核酸酶中的一種或幾種的混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述對(duì)雙鏈DNA特異的熒光染料為 SYBR Green I 。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)DNA為人類基因組DNA，所述標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA為已確定的純的非甲基化人類基因組DNA和已確定的純的甲基化人類基因組DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)DNA樣品為人類正常DNA， 癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、 淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液為血液、腦脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液或陰道分泌液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甲基化DNA的定量檢測(cè)方法，包括以下步驟步驟1，用亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA樣品和標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品；步驟2，設(shè)計(jì)并合成PCR引物；步驟3，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)定解鏈溫度；步驟4，對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟5，將待測(cè)DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加熱到一特定溫度后立即冷卻；步驟6，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化；步驟7，加入對(duì)雙鏈DNA特異的熒光染料，以熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算甲基化DNA含量。該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，適用范圍大，并且不受干擾，在腫瘤早期檢測(cè)、個(gè)性化治療、病情判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102399865SQ20101028309
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者王建 申請(qǐng)人:上海迦美生物科技有限公司