用于擬無枝菌酸菌的穿梭載體和表達(dá)載體的制作方法
【專利摘要】提出一種新的具備安普霉抗性的穿梭載體(p6apra)，其可由此得到，(a)使用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶(Smal，XmaI)消化大腸桿菌‐擬無枝菌酸菌的穿梭載體pRLE6，從而由所述載體移除npt基因，或者用不含npt基因的反向PCR擴增載體骨架，和(b)通過連接將安普霉素抗性基因aac(3)VI插入載體骨架。以及提出4種由其得到的新表達(dá)載體。
【專利說明】用于擬無枝菌酸菌的穿梭載體和表達(dá)載體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域并且設(shè)及用于擬無枝菌酸菌(Amycolatopsissp. )ATCC 39116的穿梭載體和表達(dá)載體，其制備方法和用途，特別是在生產(chǎn)同天然香蘭素中的用途。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 在過去幾十年間建立起來的DNA測序和操作技術(shù)的巨大進步激發(fā)了用于各種用途 的微生物生產(chǎn)菌種的定向設(shè)計。一個突出實施例是生產(chǎn)氨基酸，如通過谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutami州m)生產(chǎn)レ賴氨酸或レ谷氨酸[2]。
[0003] 可持續(xù)的生物基產(chǎn)品的經(jīng)濟效益W及對其增長的需求都需要改善發(fā)酵生產(chǎn)過程， 其通常與更便宜的化學(xué)方法相競爭。除了通過化學(xué)工程優(yōu)化發(fā)酵過程，使用代謝工程用于 產(chǎn)生改進的生產(chǎn)菌種為開發(fā)盈利方法提供了最大潛能[20]。
[0004] 工業(yè)上使用放線菌擬無枝菌酸菌ATCC 39116用于由阿魏酸，其為高等植物的細(xì)胞 壁成分，發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素[15]。在運種情況下生產(chǎn)的香蘭素可W別標(biāo)記為"天然"，因為其由 天然源提取或"通過適當(dāng)?shù)奈锢?、酶或微生物方法由植物、動物或微生物原材料得?（歐洲 委員會規(guī)定No 1334/2008)[9]。由于天然香蘭素相對于化學(xué)合成的"同天然"類具備明顯更 高的市場價格(將近1000倍），運種方法可W與基于石油化工產(chǎn)品或木質(zhì)素衍生物的更便宜 的化學(xué)方法競爭[6]。
[0005] 為了終止生產(chǎn)的香蘭素的分解代謝并從而在生產(chǎn)中實現(xiàn)更高的香蘭素產(chǎn)量W及 濃度，第一種嘗試是改變擬無枝菌酸菌ATCC 39116及相關(guān)菌的代謝[8,10,18,21]。為了進 一步獲得擬無枝菌酸菌ATCC 39116的有效基因工程化，必須研發(fā)新的分子工具。
[0006] 天然或異源基因在微生物中的過表達(dá)可W導(dǎo)致生物技術(shù)生產(chǎn)菌種的顯著改善。除 了參與想要產(chǎn)物的代謝途徑或競爭途徑的基因的系統(tǒng)性缺失或下調(diào)，合成代謝相關(guān)基因的 可控表達(dá)對于在所用有機物的遺傳背景下引入合理改變同樣十分重要[20]。
[0007] 天然或異源基因的過表達(dá)能力取決于宿主一載體系統(tǒng)如質(zhì)粒、遺傳因子如功能啟 動子和高效轉(zhuǎn)化過程的可用性。盡管可W采用一些系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的細(xì)菌的技術(shù)，各個部分 需要單獨研發(fā)W用于特定的菌種[23]。
[000引放線菌生產(chǎn)大量次級代謝產(chǎn)物，它們在如農(nóng)業(yè)、食品生產(chǎn)并且特別是藥物領(lǐng)域中 工業(yè)應(yīng)用[17]。因此，針對更高滴度的目的化合物或生產(chǎn)具備不同生物活性功能的新的代 謝產(chǎn)物得到深入研究。在放線菌組中研究鏈霉菌（S化eptomyces)基因組的設(shè)計值得注意。 除了常用的大腸桿菌系統(tǒng)，建立了在鏈霉菌中的異源表達(dá)并通常用于抗細(xì)菌源的基因。然 而，大多數(shù)系統(tǒng)僅能有限用于放線菌如諾卡菌或擬無枝菌酸菌。
[0009]使用擬無枝菌酸菌皿167,其16S-rDNA-序列與擬無枝菌酸菌ATCC 39116的相同， 用于基因工程?，F(xiàn)有技術(shù)已知生產(chǎn)pRLE6，一種基于AmyCOIatopsis benzoatiIyticaDSM 43387內(nèi)源質(zhì)粒pA387的復(fù)制起點的大腸桿菌-擬無枝菌酸菌穿梭載體[14]。質(zhì)粒pRLE6是缺 少紅霉素抗性基因和a -淀粉酶基因的地中海擬無枝菌酸菌（Amy C O 1 a t O P S i S mediterranei)穿梭載體pRL60的自連EcoRI-片段。載體也在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中自 主復(fù)制，而不進一步缺失或重排。然而，該載體不會插入具備完整啟動子的常規(guī)多克隆位 點，允許克隆基因的表達(dá)。
[0010] 由于缺少完整啟動子W及缺少擬無枝菌酸菌中=個遺傳因子的功能信息，限制了 基因工程的途徑。
[0011] 因此本發(fā)明的目標(biāo)是用于擬無枝菌酸菌ATCC 39116的基于質(zhì)粒的基因表達(dá)系統(tǒng) 的構(gòu)建和用途，從而實現(xiàn)工業(yè)有關(guān)的生產(chǎn)菌種的有效基因工程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的第一個目標(biāo)設(shè)及一種新的具備安普霉抗性的穿梭載體(p6apra)，其可由 此得到，
[OOU] (a)使用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶(SmaLXmaI)消化大腸桿菌-擬無枝菌酸菌的穿梭載體 PRLE6,從而由所述載體移除npt基因，或者用不含npt基因的反向PCR擴增載體骨架，和
[0014] (b)通過連接(ligation)將安普霉素抗性基因 aac(3)VI插入載體骨架，
[0015] W及一種得到穿梭載體p6apra的相應(yīng)方法，其中
[0016] (a)使用Smal消化大腸桿菌-擬無枝菌酸菌的穿梭載體PRLE6,從而由所述載體移 除npt基因，和
[0017] (b)通過平端連接將轉(zhuǎn)座子PMA5096的安普霉素抗性基因插入載體骨架。
[0018] 此外，本發(fā)明的其它實施方案設(shè)及通過所述穿梭載體的衍生得到的表達(dá)載體W及 相應(yīng)方法。具體來說：
[0019] (I)具備附加限制位點的第一表達(dá)載體，其由此得到
[0020] (a)借助PCR擴增具備質(zhì)粒地Iuescript SK-的多克隆位點的Iac-啟動子，
[0021] (b)將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。
[0022] W及一種得到第一表達(dá)載體的相應(yīng)方法，其中
[0023] (a)借助PCR擴增具備質(zhì)粒地Iuescript SK-的多克隆位點的Iac-啟動子，
[0024] (b)將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。
[002引（II)第二表達(dá)載體，其由此得到
[0026] (a)借助PCR擴增含有啟動子序列的Vdh(GTG)起始密碼子上游的擬無枝菌酸菌 ATCC 39116基因組的395-bp片段，
[0027] (b)將 Ncol-位點（CCATGG)插入 V 化(AGGAG)的夏因-達(dá)爾加諾（Shine-Dalgarno)序 列下游化P的反向引物，和
[002引（C)將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。W及一種得 到第二改進穿梭載體的相應(yīng)方法，其中
[0029] (a)借助PCR擴增含有啟動子序列的Vdh(GTG)起始密碼子上游的擬無枝菌酸菌 ATCC 39116基因組的395-bp片段，
[0030] (b)將Ncol-位點（CCATGG)插入Vdh(AGGAG)的夏因-達(dá)爾加諾序列下游6bp的反向 引物，和
[0031] (C)將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。
[0032] (III)第S種改進穿梭載體，其由此得到
[003；3] (a)借助PCR擴增卡那霉素抗性基因化扣）的啟動子序列，將Nco 1 -位點（CCATGG)插 入npt的夏因-達(dá)爾加諾序列下游9bp的反向引物，和
[0034] (b)將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。
[0035] W及一種得到第=表達(dá)載體的方法，其中
[0036] (a)借助PCR擴增卡那霉素抗性基因化扣）的啟動子序列，將Ncol-位點（CCATGG)插 入npt的夏因-達(dá)爾加諾序列下游9bp的反向引物，和
[0037] (b)將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。
[0038] (IV)第四表達(dá)載體，其由此得到
[0039] (a)將糖多抱紅霉菌（Saccharopolyspora er}fthraea)的ermE*啟動子由質(zhì)粒 PIAGO移除，
[0040] (b)將該片段克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。
[0041] W及一種得到第四表達(dá)載體的方法，其中
[0042] (a)將糖多抱紅霉菌（Saccharopolyspora er}fthraea)的ermE*啟動子由質(zhì)粒 PIAGO移除，
[0043] (b)將該片段克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。
[0044] 令人驚訝地是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)運種新的通過插入不同啟動子因子的表達(dá)載體，克服了 現(xiàn)有技術(shù)中報道的缺陷。
[0045] 發(fā)明具體說明
[0046] 在第一步構(gòu)建賦予安普霉素抗性替代卡那霉素抗性的PRLE6衍生物。運一步是必 要的，因為觀察到附著體(episomal)和卡那霉素抗性基因 npt的失活基因組副本發(fā)生重組。 此外，使用擬無枝菌酸菌ATCC 39116的卡那霉素抗性缺失突變體。選擇安普霉素新的轉(zhuǎn)化 載體p6apra得W保持而沒有改變。
【申請人】能夠由各個測試克隆體分離質(zhì)粒DNA。因此質(zhì)粒由 基因組自主復(fù)制并且不會整合。如果P化E6用于轉(zhuǎn)化擬無枝菌酸菌ATCC39116則不是運種情 況。
[0047] 為了生成如常規(guī)表達(dá)載體中的多克隆位點，四種不同的啟動子序列被插入穿梭載 體，從而能夠進行共線克隆基因的轉(zhuǎn)錄。在整合各個啟動子后，得到至少6個獨特限制位點， 其可分別用于克隆。在Vdh和KmT運兩個啟動子的情況下，其已知在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中起作用，通過引入額外的NcoI-位點其基因組織得W成功保持。該限制位點允許在 夏因-達(dá)爾加諾序列下游6或9個堿基對處克隆目的基因的ATG起始密碼子。選擇Iac-啟動子 作為第=個啟動子，其用于在大范圍的細(xì)菌內(nèi)實現(xiàn)異源表達(dá)。最后插入ermE*-啟動子，從而 在不同放線菌中實現(xiàn)強組成表達(dá)[3]。
[004引為了檢測克隆啟動子的功能，將葡萄糖醒酸巧酶(glucuronidase)基因 gusA插入 各個p6apra衍生物。選擇gusA作為報道基因，因為編碼酶GUS的活性可W直接在瓊脂板上簡 單測出。此外，活性可W在非常簡單并且便宜但是敏感的酶測試中檢測[16]。最后擬無枝菌 酸菌ATCC 39116不會表現(xiàn)任何葡萄糖醒酸巧酶固有活性。
[0049] 作為成功建立用于擬無枝菌酸菌ATCC 39116的基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)的主要要求 是觀察到新表達(dá)載體的穩(wěn)定復(fù)制。所有產(chǎn)生的質(zhì)粒沒有像W前用于擬無枝菌酸菌HR167和 其他擬無枝菌酸菌菌種所觀察到的，經(jīng)歷任何變化[14,23]。
[0050] 在新載體系統(tǒng)遺傳穩(wěn)定性分析之后，使用報道基因 gusA分析完整啟動子的功能。 由于擬無枝菌酸菌ATCC 39116不表現(xiàn)內(nèi)源性葡萄糖醒酸巧酶活性，底物X-Gluc和P-硝苯 基-e-D-葡糖巧酸的水解與報道基因編碼的GUS表達(dá)直接相關(guān)。此外，GUS不需要任何輔助因 子，并因此活性僅限于酶的用量[16]。
[0051]令人驚異地是，由ermE*-啟動子調(diào)節(jié)的gusA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生最高的葡萄糖醒酸巧酶活 性。運一結(jié)果在瓊脂板的定性分析W及定量酶分析中證實。
[00對由化rmE*激活的基因表達(dá)產(chǎn)生的GUS-活性比第二強的Knf啟動子高六倍。此外，擬 無枝菌酸菌ATCC 39116p6permE: :gusA可溶部分的葡萄糖醒酸巧酶活性比擬無枝菌酸菌 ATCC 39116p6pv化：：gusA的活性高75倍，比擬無枝菌酸菌ATCC 39116p6plac: :gusA的活性 甚至高7500倍。由于啟動子通常用于許多不同的放線菌，包括諾卡氏菌屬(Nocardia)、戈登 氏菌屬(Gordonia)或紅球菌屬(化odococcus)，IacP控制下的較低表達(dá)是顯著的。有意思的 是，在之前的擬無枝菌酸菌HR167研究中Iac-啟動子也用于實現(xiàn)外源基因的異源表達(dá)[1引。 在運種情況下異源基因在IacP控制下被克隆進pBluescript SK-，并且隨后整個質(zhì)粒與 pI?LE6 連接。
[0053] 在SDS-PAGE分析中同樣可W觀察到表達(dá)活性的區(qū)別，其掲示了用于擬無枝菌酸菌 ATCC 39116p6permE: :gusA的表觀分子量為69±2W)a的突出蛋白信號。在對比菌種樣本中 該帶型缺失，并且在含有具備IacP或V化啟動子的菌種樣本中非常弱。表觀分子量與0-葡萄 糖醒酸巧酶的假定尺寸68.2kDa-致[12]。
[0054] 新的質(zhì)粒提供了在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中異源基因表達(dá)的新功能。尤其是可 W選擇不同的啟動子，提供顯著不同的表達(dá)強度，使工業(yè)相關(guān)放線菌擬無枝菌酸菌ATCC 39116的基因工程更容易和高效。
[0055] 細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件
[0056] 在本研究中使用的所有細(xì)菌菌株和質(zhì)粒列于表1。大腸桿菌細(xì)胞在37 °C下LB (Xysogeny化〇地)介質(zhì)中生長(Sambrook et al. 1989)。擬無枝菌酸菌ATCC 39116細(xì)胞在 45 °C下化SO介質(zhì)中生長(Merck,化rmsta化,Germany)。為了選擇質(zhì)粒宿主菌株，將抗生素如 下加入介質(zhì)：卡那霉素：5化g/ml用于大腸桿菌；安普霉素：5化g/ml用于大腸桿菌和擬無枝 菌酸菌。通過測定400nm(擬無枝菌酸菌ATCC 39116)或600nm(大腸桿菌)的光密度測量細(xì)胞 生長。
[0化7] DNA分離和操作
[0化引 使用 "peqGOLD Plasmid MiniPr巧 Kit r (陽化AB GmbH,化langen，德國）由大腸 桿菌分離質(zhì)粒DNA。使用％iagen Plasmid Purification Kit(Mini)" (Qiagen GmbH, Hilden,德國）由擬無枝菌酸菌ATCC 39116分離質(zhì)粒。當(dāng)由擬無枝菌酸菌ATCC 39116分離質(zhì) 粒時，將DNA再次轉(zhuǎn)移至大腸桿菌，從而產(chǎn)生可W進一步分析的充足量。在生產(chǎn)商描述的條 件下通過限制核酸內(nèi)切酶(Thermo Fisher Scientific GmbH,Schwerte,德國）消化DNA。根 據(jù)生產(chǎn)商說明使用曲USion Hot-Start II high-fidelity DNA聚合酶、T4DNA連接酶和 T4DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific GmbH,Schwerte,德國）。寡核巧酸購自Eurofins MWG Synthesis Gm地化bersberg,德國）。使用 "peqGOLD Gel Extraction Kit" (PEQLAB GmbH,化Iangen，德國）由瓊脂糖凝膠或反應(yīng)混合物分離DNA片段。
[0059] DNA 轉(zhuǎn)移
[0060] 通過使用化Cl2-方法（Sambrook et al. 1989)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進入大腸桿菌，而如前 述通過直接菌絲體轉(zhuǎn)接將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至擬無枝菌酸菌ATCC 39116。
[0061 ] 質(zhì)粒構(gòu)建
[0062] 通過用9145096的安普霉素抗性基因[1]替代931^66的卡那霉素抗性基因[23]^產(chǎn) 生p6apra。為此使用SmaI消化PRLE6從而釋放含有npt全部編碼序列的1006-bp片段。通過 PCR使用化usion Hot-Sta;rt II high-fidelity DNA聚合酶和寡核巧酸Apra_fo;r和Apra_ rev擴增安普霉素抗性基因 aac(3)VI(表1)。擴增產(chǎn)物隨后與PRLE6的SmaI-消化載體骨架連 接。大腸桿菌Mach- ITl轉(zhuǎn)化后，分離得到的質(zhì)粒p6apra并測序。載體提供了由屯個獨特限制 位點巧coRV,NheI ,BmtI ,FspAI ,DraI ,HindIII ,BamHI，參見圖1)構(gòu)成的多克隆位點。大腸桿 菌邸2925轉(zhuǎn)化產(chǎn)生Dam-和Dcm-未甲基化DNA后，p6apra被轉(zhuǎn)移至擬無枝菌酸菌ATCC 39116 并分析得到突變體的新質(zhì)粒穩(wěn)定復(fù)制。
[0063] 為了使轉(zhuǎn)化載體適用于在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中異源表達(dá)，將四種不同啟動 子整合進入p6apra的單一EcoRV-位點，如圖2所示。
[0064] 首先使用寡核巧酸pSK_MCS_for和pSK_MCS_revW及fusion high-fidelity DNA 聚合酶擴增包括IacZ的pSK-全部多克隆位點（表1)。進一步，使用寡核巧酸pKm_for和pKm_ NcoI_rev擴增PRLE6卡那霉素抗性基因的啟動子區(qū)域（表1)。反向引物包括NcoI-位點 (CCATGG)，其允許克隆npt的夏因-達(dá)爾加諾序列下游9bp的目的基因起始密碼子(ATG)。此 外使用寡核巧酸pv^_h;r和pv^_NcoI_rev擴增V化[10]的上游區(qū)域(表1)。反向引物化〇1 -位點中的ATG位于夏因-達(dá)爾加諾序列下游6bp處，其類似擬無枝菌酸菌ATCC 39116基因組 中V化開放讀碼框(open reading打ame)的基因組織。
[0065] 通過使用KpnI/BamHI消化，由pIAG0[22]分離ermE*-啟動子。由瓊脂糖凝膠純化片 段并使用T4DNA聚合酶產(chǎn)生平整末端。
[0066] 通過平端連接將四種啟動子片段克隆至p6apra的EcoRV位點。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移 至大腸桿菌Mach-ITl，分離并隨后測序，分析與殘余多克隆位點共線的啟動子片段的正確 整合和方向。
[0067] 為了研究克隆啟動子的功能和表達(dá)強度，將葡萄糖醒酸巧酶gusA作為Spel/EcoRV 片段由pSETGUS分離并隨后克隆至與完整啟動子共線的Nhel/Dral-線性化表達(dá)載體 (p6pKm、p6pv化、pGpermE) (Myronovskyi et al. 2011)。對于p6plac，將gusA克隆至由額外 克隆MCS提供的Spel/EcoRV位點。
[0068] 大腸桿菌邸2925轉(zhuǎn)化后，將表達(dá)因子轉(zhuǎn)移至擬無枝菌酸菌ATCC 39116,并分析得 到菌株的新質(zhì)粒的穩(wěn)定復(fù)制。
[0069] 制備粗細(xì)胞提取物和可溶部分。
[0070] 將擬無枝菌酸菌ATCC 39116的細(xì)胞沉淀物懸浮于3至4ml的50mM憐酸鐘緩沖液中 (pH 7.0)。通過=次通過弗氏壓碎器（120MPa)得到粗提取物。為了制備可溶部分，通過在4 °C下20.OOOxg離屯、60分鐘移除細(xì)胞碎片。為了隨后的酶分析，將樣品儲存在冰上。
[0071] 葡萄糖醒酸巧酶分析
[0072] 細(xì)胞裂解液中葡萄糖醒酸巧酶活性的分光光度測定如前所述進行。通過加入P-硝 苯基-0-D-葡糖巧酸引發(fā)反應(yīng)。在415nm觀察到生成p-硝基苯酪（￡ = 7.76cm2/Mi〇l)。W units(U)說明酶活性。IU定義為每分鐘產(chǎn)生1皿Olp-硝基苯酪的酶量。
[0073] 為了檢測0-葡萄糖醒酸巧酶在瓊脂板上的活性，使用Iml的lmM5-漠-4-氯-3-嗎隙 基-e-D-葡糖巧酸(X-Gluc)溶液覆蓋菌落。短暫繁育后含有水解GUS活性的菌落變藍(lán)，因為 形成5,5' -二漠-4,4' -二氯說青。
[0074] 聚丙締酷胺凝膠電泳
[0075] 根據(jù)化a壯ord方法（1976)分析樣本可溶部分的蛋白含量。在如[13]中所記載的 12.5%(**八〇1)凝膠中進行十二烷基硫酸鋼聚丙締酷胺凝膠電泳(505-?466)。如本文所述 加入蛋白質(zhì)。使用Serva Blue G進行蛋白質(zhì)染色[28]。^下分子量參考蛋白購自化ermo Fisher Scientific GmbH(Schwerte,德國）："PageRuler Prestained Protein Ladder"和 "Unstained Protein Molecular Weight Marker''。
[0076] 工業(yè)應(yīng)用
[0077] 本發(fā)明的另一目標(biāo)設(shè)及用于擬無枝菌酸菌ATCC 39116的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，包括至少 一個根據(jù)權(quán)利要求3、5、7或9任一項所述的表達(dá)載體。
[007引此外，本發(fā)明包括表達(dá)載體（I)至（IV)中至少一種在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中 復(fù)制和在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中異源表達(dá)基因的用途。
[0079] 本發(fā)明還包括含有表達(dá)載體(1)至（IV)中至少一種的擬無枝菌酸菌ATCC 39116在 生產(chǎn)香蘭素方法中的用途。
[0080] 最后，本發(fā)明還包括制備同天然香蘭素的方法，通過采用選自含有表達(dá)載體（I)至 (IV)中至少一種的擬無枝菌酸菌ATCC 39116的微生物發(fā)酵阿魏酸。
[0081] 相關(guān)文獻(xiàn)
[0082] W下文獻(xiàn)代表相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)。說明書中的編號設(shè)及運些文獻(xiàn)
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[016引實施例1
[0169] 表達(dá)載體的構(gòu)建
[0170] 為了構(gòu)建用于擬無枝菌酸菌ATCC 39116的基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)，生成賦予安普霉 素抗性的輸送載體p6apra。
[0171 ]圖1給出了新輸送載體p6apra的物理圖譜。ApraR:安普霉素抗性基因；pA-r邱：質(zhì) 粒pA387的擬無枝菌酸菌復(fù)制起點；oriV:質(zhì)粒pBR322的大腸桿菌復(fù)制起點。存在用于克隆 的獨特限制位點。
[0172] 由于我們觀察到所含卡那霉素抗性基因和npt基因的未激活基因組副本重組，改 變了先前的大腸桿菌-擬無枝菌酸菌穿梭載體PRLE6。此外，由于我們之前生成了同樣可用 作主基因的擬無枝菌酸菌ATCC39116的卡那霉素抗性缺失突變體，需要不同的抗生素抗性 基因。為此我們通過使用SmaI消化移除了PRLE6的npt基因并通過平端連接將轉(zhuǎn)座子 PMA5096的安普霉素抗性基因插入載體骨架。在交換抗生素抗性基因之后，將載體轉(zhuǎn)移至擬 無枝菌酸菌ATCC 39116并可W監(jiān)控安普霉素抗性突變體。我們可W由各個測試克隆體分離 質(zhì)粒DNA，運說明p6apra保持為自主元件。此外，載體W穩(wěn)定的方式復(fù)制，而在由得到的突變 體質(zhì)粒分離和分析后沒有觀察到缺失和重排。
[0173] 基于新的穿梭載體，生成了具備不同啟動子的四種衍生物。所有的啟動子片段被 分別克隆至反線性于安普霉素抗性基因的單一EcoRV位點。由于運種插入，各個啟動子上游 剩余獨特限制位點中的至少五個可在運些調(diào)控元件的控制下用于克隆和表達(dá)外源DNA。
[0174] 圖2示出了產(chǎn)生的表達(dá)載體的物理圖譜。ApraR:安普霉素抗性基因；pA-r邱：質(zhì)粒 pA387用于擬無枝菌酸菌的復(fù)制起點；oriV:質(zhì)粒pBR322用于大腸桿菌的復(fù)制起點。完整啟 動子及其方向由灰色箭頭指出。示出了用于克隆的獨特限制位點。
[0175] 為了測試擬無枝菌酸菌ATCC 39116中不同的啟動子，首先選擇常用Iac-啟動子， 其被報道在大范圍的細(xì)菌中有功能并且因此可用于各種克隆載體。為了得到額外的限制位 點，我們將市售可得質(zhì)粒pBluescript SK-的全部多克隆位點插入p6apra。為此通過PCR將 包括Iac-啟動子的全部多克隆位點擴增并隨后克隆進p6apra的EcoRV位點。
[0176] 作為第二啟動子，我們將之前表征的擬無枝菌酸菌ATCC 39116的Vdh基因的上游 區(qū)域插入。為此，擴增V化(GTG)起始密碼子上游395-bp片段，其包含上述互補試驗中示出的 啟動子序列(數(shù)據(jù)未示出）。為了保持功能基因組織，我們將化Ol-位點（CCATGG)插入反向引 物，其允許我們克隆Vdh(AGGAG)的假定夏因-達(dá)爾加諾序列下游化P處的目的基因。
[0177] 相同的克隆方案用于插入卡那霉素抗性基因化mO的啟動子區(qū)域。與Vdh-啟動子 類似，我們通過引入化Ol位點保持離npt基因的天然夏因-達(dá)爾加諾序列9bp的距離。選擇卡 那霉素抗性啟動子，因為我們由pRLE6和KmT用于引入剔除（knock OUts)的用途得知，在運 些因素的控制下npt被功能性地轉(zhuǎn)錄至擬無枝菌酸菌ATCC 39116。
[0178] 最后，我們由糖多抱紅霉菌（SaccharopoIyspora e巧thraea)克隆ermE*啟動子， 其為強組合型啟動子并且當(dāng)需要高度表達(dá)時經(jīng)常用于放線菌(Wilkinson et al. 2002)。通 過KpnI/BamHI消化由質(zhì)粒PlAGO移除啟動子。隨后產(chǎn)生平整末端，并且再次將片段克隆至 p6apra的EcoRV-位點。
[0179] 所有產(chǎn)生的質(zhì)粒在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中復(fù)制而沒有任何可觀察到的重組， 因此它們可用于所需基因的異源表達(dá)，
[0180] 實施例2
[0181] gusA在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中的表達(dá)
[0182] 為了測試異源啟動子在擬無枝菌酸菌ATCC 39116中的可用性，選擇由gusA基因編 碼的e-葡萄糖醒酸巧酶GUS為報道子[16]。0-葡萄糖醒酸巧酶的活性可W在瓊脂板上簡單 定性檢測并且W簡單但是敏感的分光光度分析定量檢測。
[0183] 首先測試擬無枝菌酸菌ATCC 39116的固有GUS活性從而排除對比菌株中的潛在背 景信號。野生菌株不表現(xiàn)出任何葡萄糖醒酸巧酶活性，使gusA成為適用于我們研究的報道 基因。
[0184] 為了測定表達(dá)質(zhì)粒的功能，葡萄糖醒酸巧酶基因 gusA作為啟動子分別在啟動子下 游和與啟動子共線處克隆。作為對比菌株我們還生成了僅含gusA的無啟動子p6apra。
[0185] 在表達(dá)載體轉(zhuǎn)移后，除了攜帶無啟動子gusA基因的對比菌株，其他所有菌株在瓊 脂板上檢測GUS活性。為此，將細(xì)菌在固體TSB瓊脂上于42°C下繁殖4她并隨后使用記載于材 料和方法下的底物X-Gluc覆蓋?？寺幼悠蔚谋磉_(dá)強度差別甚至可W在定性分析中推 巧I]。攜帶p6plac: :gusA和p6pv化：：gusA的表達(dá)菌株僅表現(xiàn)出淡藍(lán)色，而在菌株擬無枝菌酸 菌ATCC 3911化化Km: : gusA和擬無枝菌酸菌ATCC 391 ISpSpermE: : gusA觀察到強烈著色。
[0186] 為了進一步分析不同啟動子控制下的gusA表達(dá)，在四種表達(dá)菌株的粗提取物中測 定具體酶活性。不同的擬無枝菌酸菌ATCC 39116表達(dá)菌株在TSB介質(zhì)中于42°C下培養(yǎng)24h。 培養(yǎng)后收獲細(xì)胞，制備可溶部分，并根據(jù)材料和方法中記載的光學(xué)法測定e-葡萄糖醒酸巧 酶GUS的具體活性。在相同條件下處理攜帶無啟動子質(zhì)粒p6apra: : gusA的對比菌株。
[0187] 活性分析顯示對比菌株沒有表現(xiàn)GUS活性。與之相比所有產(chǎn)生的表達(dá)菌株在分光 光度分析中415nm處吸收增強，表現(xiàn)出形成P-硝基苯酪。定量分析確定了表現(xiàn)出最高酶活性 p6permE表達(dá)強度增強的推測（表2)。在瓊脂板活性測試中同樣明顯。在Iac和V化啟動子控 制下的gusA表達(dá)分別產(chǎn)生酶活性僅為0.04U/mg ± 0.00038U/mg和4.04U/mg ± 0.07 lU/mg，而 攜帶KmT-啟動子和化rmE*的菌株表相出非常強的活性59.07U/mg± 1.50U/mg和302.20U/mg ±1.2 抓/mg。
[0188] 在可溶部分的SDS-PAGE分析中g(shù)usA的表達(dá)同樣顯而易見，其示出了尺寸約69 ± 化Da的突出蛋白質(zhì)條帶。對比菌株沒有該信號，而最強蛋白質(zhì)條帶可在由PermE*控制的 gusA表達(dá)菌株觀察到。
[0189] 圖3示出通過SDS-PAGE分析檢測不同gusA表達(dá)菌株的GUS合成。將樣品分散在材料 和方法中記載的12.5% (WtzVol)SDS-聚丙締酷胺凝膠中。使用Serva Blue G丄ane將凝膠 染色。
[0190] Ml:分子量標(biāo)記物："PageRuler Prestained Protein Ladder''，Lane
[0191] M2:分子量標(biāo)記物："Unstained Protein Mole州Iar Weight Marker" ;Lane
[0192] 1: 30]ig對比菌株擬無枝菌酸菌ATCC 39116p6apra: :gusA可溶部分蛋白質(zhì)
[0193] 2: 30]ig擬無枝菌酸菌ATCC 39116p6plac: :gusA可溶部分蛋白質(zhì)
[0194] 3: 30]ig擬無枝菌酸菌ATCC 39116p6pv化：：gusA可溶部分蛋白質(zhì) [01巧]4: 30]ig擬無枝菌酸菌ATCC 3911化化Km: : gusA可溶部分蛋白質(zhì)
[0196] 5: 30]ig擬無枝菌酸菌ATCC 391 IGpGpermE: : gusA可溶部分蛋白質(zhì)。
[0197] 細(xì)胞在TSB介質(zhì)中生長2地。如記載于材料和方法中細(xì)胞破碎和隨后離屯、后得到可 溶部分。箭頭示出推定gusA基因產(chǎn)物的相應(yīng)信號。
[0198] 在下表1和2中給出了細(xì)菌菌株和質(zhì)粒W及不同表達(dá)菌株具體GUS活性的概述。
[0199] 表1
[0200] 研究中使用的菌株和質(zhì)粒

【主權(quán)項】
1. 一種新的具備安普霉抗性的穿梭載體(p6apra)，其可由此得到， (a) 使用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶（S m a 1，X m a I)消化大腸桿菌-擬無枝菌酸菌的穿梭載體 PRLE6,從而由所述載體移除npt基因，或者用不含npt基因的反向PCR擴增載體骨架，和 (b) 通過連接將安普霉素抗性基因 aac(3)VI插入載體骨架，2. -種得到穿梭載體p6apra的相應(yīng)方法，其中 (a) 使用Smal消化大腸桿菌-擬無枝菌酸菌的穿梭載體pRLE6,從而由所述載體移除npt 基因，和 (b) 通過平端連接將轉(zhuǎn)座子PMA5096的安普霉素抗性基因插入載體骨架。3. 具備附加限制位點的第一表達(dá)載體，其由此得到 (a) 借助PCR擴增具備質(zhì)粒pBluescript SK的多克隆位點的lac-啟動子， (b) 將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。4. 一種得到第一表達(dá)載體的相應(yīng)方法，其中 (a) 借助PCR擴增具備質(zhì)粒pBluescript SK-的多克隆位點的lac-啟動子， (b) 將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。5. 第二表達(dá)載體，其由此得到 (a) 借助PCR擴增含有啟動子序列的vdh(GTG)起始密碼子上游的擬無枝菌酸菌ATCC 39116的395-bp片段基因， (b) 將Ncol-位點（CCATGG)插入vdh(AGGAG)的夏因-達(dá)爾加諾(Shine-Dalgarno)序列下 游6bp的反向引物，和 (c) 將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。6. -種得到第二改進穿梭載體的相應(yīng)方法，其中 (a) 借助PCR擴增含有啟動子序列的vdh(GTG)起始密碼子上游的擬無枝菌酸菌ATCC 39116的395-bp片段基因， (b) 將Ncol-位點(CCATGG)插入vdh(AGGAG)的夏因-達(dá)爾加諾序列下游6bp的反向引物， 和 (c) 將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。7. 第三種改進穿梭載體，其由此得到 (a) 借助PCR擴增卡那霉素抗性基因（Knf)的啟動子序列，將Ncol-位點(CCATGG)插入npt 的夏因-達(dá)爾加諾序列下游9bp的反向引物，和 (b) 將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。8. -種得到第三表達(dá)載體的方法，其中 (a) 借助PCR擴增卡那霉素抗性基因（Knf)的啟動子序列，將Ncol-位點(CCATGG)插入npt 的夏因-達(dá)爾加諾序列下游9bp的反向引物，和 (b) 將PCR產(chǎn)物克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。9. 第四表達(dá)載體，其由此得到 (a) 將糖多孢紅霉菌的ermE*啟動子由質(zhì)粒p I AGO移除， (b) 將該片段克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。10. -種得到第四表達(dá)載體的方法，其中 (a)將糖多孢紅霉菌的ermE*啟動子由質(zhì)粒p I AGO移除， (b)將該片段克隆至根據(jù)權(quán)利要求1所述的p6apra載體的EcoRV位點。11. 一種用于放線菌目的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，所述放線菌目包括一些工業(yè)相關(guān)科如棒桿菌 亞目（Corynebacterineae)、假諾卡氏菌亞目（Pseudonocardineae)或鏈霉菌亞目 (Streptomycineae)，含有根據(jù)權(quán)利要求1、3、5、7或9任一項所述表達(dá)載體中的至少一種。12. 根據(jù)權(quán)利要求1、3、5、7或9任一項所述表達(dá)載體中的至少一種在這些細(xì)菌中復(fù)制的 用途。13. 根據(jù)權(quán)利要求1、3、5、7或9任一項所述表達(dá)載體中的至少一種在這些細(xì)菌中異源表 達(dá)基因的用途。14. 含有根據(jù)權(quán)利要求1、3、5、7或9任一項所述表達(dá)載體中的至少一種的重組細(xì)菌在生 產(chǎn)香蘭素、香草酸、松柏醇或松柏醛中的用途。15. -種制備同天然香蘭素的方法，通過采用含有根據(jù)權(quán)利要求1、3、5、7或9任一項所 述表達(dá)載體中的至少一種的微生物發(fā)酵阿魏酸或丁子香酚。
【文檔編號】C12R1/01GK105874073SQ201480062742
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月2日
【發(fā)明人】克里斯汀·弗萊格, 斯蒂芬·蘭布雷希特, 曼紐爾·佩薩羅, 亞歷山大·施泰因布切爾
【申請人】西姆萊斯股份公司